Técnica de injeção de embriões para edição de genes no carrapato de patas pretas, Ixodes scapularis

Este é o primeiro protocolo de injeção embrionária para uma espécie de Chelererata. A capacidade de injetar embriões de carrapatos abrirá muitas linhas de pesquisa, em particular, estudos sobre a função do gene do carrapato e as interações com patógenos do carrapato. Esta técnica permite trabalhos futuros em estudos funcionais de genes de carrapatos e fornece uma base para o controle populacional de carrapatos usando sistemas de gene drive.

Este método facilitará a compreensão da interação entre carrapatos e os patógenos que eles abrigam em um nível molecular. Isso nos permitirá identificar proteínas que podem ser usadas para o desenvolvimento de vacinas para a doença de Lyme e outros patógenos. Enquanto várias áreas de pesquisa, como interações de patógenos de carrapatos e transmissão de patógenos para hospedeiros por carrapatos durante a alimentação, se beneficiarão deste trabalho.

Questões mais fundamentais, como como os carrapatos evitam a resposta imune do hospedeiro e as diferenças nos mecanismos de reparo do DNA também podem ser entendidas agora. Existem alguns aspectos da biologia do carrapato que precisam ser entendidos antes de realizar este procedimento. A alta pressão interna do embrião leva à explosão quando tocado por uma agulha.

É muito importante preparar embriões para injeção. Para começar, transfira as fêmeas de quatro graus Celsius para uma incubadora de 27 graus Celsius para o início da postura de ovos uma semana antes das injeções. Após três a quatro dias, quando as fêmeas começarem a botar ovos, remova todos os ovos usando um pincel de ponta fina enquanto prepara as fêmeas para a ablação de órgãos de Gene.

Para esvaziar a glândula, organize o carrapato gravídico em uma lâmina de vidro sob um microscópio de forma que as partes da boca sejam visíveis nos lados ventral e dorsal. Em seguida, perfure cuidadosamente a área atrás das partes da boca no lado dorsal e aplique pressão no lado ventral usando fórceps. Coloque a borda de um lenço sem fiapos e remova a cera líquida que sai do local da punção.

Alternativamente, em vez de esvaziar a glândula por dissecção, colas como adesivo de tecido podem ser usadas ao redor das partes da boca do carrapato. Quando as fêmeas começarem a botar ovos novamente, use um pincel fino para coletar ovos recém-depositados e colocá-los em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione aproximadamente 200 microlitros de água de cloreto de benzalcónio a 5% no tubo contendo ovos de zero a 18 horas de idade.

Gire suavemente os ovos com o pincel por cinco minutos para evitar que os ovos se depositem no fundo do tubo e remova o sobrenadante usando uma micropipeta, deixando os ovos para trás no tubo. Adicione aproximadamente 200 microlitros de água destilada ao tubo que contém ovos. Gire com um pincel e retire a água do tubo de microcentrífuga usando uma micropipeta.

Após a lavagem com água destilada, adicione aproximadamente 200 microlitros de cloreto de sódio a 5% e gire suavemente com um pincel por cinco minutos. Em seguida, retire a solução do tubo após cinco minutos e lave os ovos duas vezes com água destilada. Em seguida, adicione aproximadamente 100 microlitros de solução de cloreto de sódio a 1% no tubo de microcentrífuga contendo ovos.

Primeiro, cole duas lâminas de microscópio de vidro juntas, deixando uma lacuna de cerca de 0,5 centímetros para suportar o alinhamento de ovos usando uma fita dupla face e aplique um pedaço de curativo de filme transparente na fita dupla face no espaço entre as lâminas. Em seguida, alinhe de oito a 10 ovos de cada vez na configuração do slide usando um pincel. Em seguida, coloque a lâmina com ovos alinhados no estágio de um microscópio composto e remova a solução de cloreto de sódio a 1% usando um pedaço de toalha sem fiapos no qual eles são armazenados.

Ligue a agulha de injeção cheia a um micro injetor ligado a um micromanipulador. Em seguida, abra a agulha esfregando-a suavemente contra a superfície do ovo usando uma configuração de alta pressão no microinjetor. Depois que a agulha for aberta, reduza a pressão do microinjetor dependendo da abertura da agulha.

Em seguida, injete todos os ovos na lâmina em um ângulo de 10 a 15 graus o mais rápido possível, pressione rapidamente o pedal do pé e mova imediatamente o slide para condições de alta umidade em uma placa de Petri com uma toalha de papel úmida. Após cinco a seis horas de colocação da lâmina contendo embriões injetados em uma grande placa de Petri forrada com papel de filtro úmido, adicione uma pequena gota de água destilada ao curativo de filme transparente com embriões injetados anexados. Em seguida, desloque suavemente os ovos usando um pincel.

Em seguida, transfira os ovos para uma pequena placa de Petri e submerja-os em água destilada. Mantenha os ovos submersos em água, coloque a placa de Petri em uma caixa de plástico de seis litros em uma incubadora a 27 graus Celsius a mais de 90% de umidade relativa. Quando a larva começar a eclodir dos embriões injetados 21 a 25 dias após a injeção, verifique-os diariamente e transfira todas as larvas eclodidas para frascos de vidro com uma tela na parte superior.

Os resultados demonstraram que injetar os ovos no início da embriogênese de 12 a 18 horas de idade, e alinhar o eixo mais longo do ovo perpendicular à borda da lâmina resulta em uma maior taxa de sobrevivência dos ovos injetados. De todos os ovos injetados, até 8,5% sobreviveram e a larva eclodiu. Antes de iniciar este procedimento, é importante lembrar as etapas 2.4, remoção da cera do carrapato mãe e etapas 3.1 a 3.4, amolecimento do córion do embrião com cloreto de benzalcônio e dessecação do embrião com soluções de cloreto de sódio para permitir a injeção bem-sucedida do embrião.

Este método foi desenvolvido principalmente para edição de genes de carrapatos, e isso nos permitirá fazer knockouts e knock-ins que nos ajudarão a entender a função do gene do carrapato. Esta técnica permitirá o uso de ferramentas de edição de genes disponíveis para muitos outros organismos a serem aplicadas à pesquisa de carrapatos. E isso acelerará a pesquisa em biologia molecular do carrapato.