Isolamento do mesênquima intestinal murino resultando em alto rendimento de telócitos
24 de março de 2023
Apresentamos aqui um protocolo para isolar o mesênquima intestinal murino, incluindo telócitos. Estes podem ser usados para várias aplicações, tais como co-cultura com camundongos ou organoides derivados de humanos, para apoiar o crescimento e refletir melhor a situação no tecido original.
Nosso protocolo de isolamento do mesênquima intestinal resulta em alto rendimento de telócitos. Este método oferece uma plataforma inicial para estudar a interação célula-célula envolvendo telócitos na homeostase e doença. Os telócitos são células únicas sensíveis aos protocolos de dissociação tecidual disponíveis.
Portanto, a principal vantagem desta técnica é o isolamento do mesênquima, incluindo telócitos viáveis enriquecidos. Mesenquima, incluindo telocíto, pode servir como uma fonte para moléculas de sinalização e fatores de crescimento necessários para o crescimento organizado ex vivo. Para começar, lave o intestino, separado de um rato eutanasiado, em uma placa de Petri contendo PBS frio e estéril.
Coloque o intestino em uma placa de Petri. E usando uma tesoura de ponta de bola, abra o tubo intestinal longitudinalmente e lave as fezes. Transfira o intestino para um novo prato contendo PBS fresco e frio.
Depois de lavar o intestino mais uma vez, corte o intestino delgado em segmentos de um centímetro de comprimento e transfira-os para um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com oito mililitros de PBS. Agite o tubo manualmente a um ou dois ciclos por segundo durante um minuto. Despeje a solução em uma placa de Petri.
E usando pinças, transfira o segmento para um tubo cônico de 50 mililitros preenchido com 20 mililitros de Solução A.Coloque os tubos em uma incubadora de agitador orbital a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, agitar vigorosamente o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos por segundo durante um minuto para dissociar o epitélio. Repita esta etapa mais uma vez.
Depois de cortar e lavar os fragmentos, como demonstrado anteriormente, transfira-os para um novo tubo de 50 mililitros preenchido com 10 mililitros de PBS estéril e inverta o tubo em um ou dois ciclos por segundo durante um minuto. Despeje a solução em uma placa de Petri. Transfira os segmentos para um novo tubo de 15 mililitros preenchido com 10 mililitros de PBS estéril e incline suavemente para cima e para baixo em um ou dois ciclos por segundo durante dois minutos.
Sob um armário de biossegurança, use pinças para colocar os segmentos em um lenço de laboratório estéril para secá-los. Depois de secos, corte os segmentos em pedaços. Transfira as peças cortadas usando pinças para uma placa de seis poços preenchida com quatro mililitros de solução de digestão pré-aquecida por poço.
Incube a placa a 37 graus Celsius por 50 minutos e agite suavemente a placa manualmente a cada 20 minutos. Em seguida, transfira as peças usando uma pipeta de Pasteur para um tubo cônico de 15 mililitros preenchido com quatro mililitros de DMEM. Agite o tubo manualmente a quatro ou cinco ciclos por segundo durante um minuto para obter uma suspensão de célula única.
Filtre a suspensão através de um filtro de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 700 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Eliminar o sobrenadante por aspiração e ressuspender o pellet de células em cinco mililitros de SFB/PBS a 2%.
Após centrifugar a suspensão mais uma vez a 700 g por cinco minutos, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 12 mililitros de meio de cultura. Por fim, semeie a suspensão celular em placas de seis poços. Após a dissociação do mesênquima, os telócitos perdem suas características celulares, apresentando morfologia celular arredondada, e refletem menor número de células positivas para GFP no primeiro dia em comparação com os dias seguintes.
Alguns dias depois, os telócitos exibem uma morfologia celular pequena e esticada com processos celulares curtos. Após sete a 10 dias de semeadura, os telócitos recuperam suas características celulares, apresentando morfologia celular grande e esticada com processos citoplasmáticos longos. A citometria de fluxo revela a composição celular.
No geral, 69% das células isoladas foram viáveis com base na coloração DAPI. Destes, 60,9% representaram contaminação epitelial e células imunes e endoteliais. A fração telocita dispersou-se acima de 100k e 70k FSC e SSC, respectivamente, e representou quase 10% do mesênquima fechado.
A análise da FACS revelou que o subgrupo de telócitos pode ser definido pela coloração positiva para CD201 e GP38. A imunomarcação de mesênquima cultivado em um dia usando esses marcadores mostrou expressão desses marcadores moleculares, apesar de as células não exibirem suas características celulares. Este procedimento resulta em uma suspensão unicelular viável de células estromais, que pode ser usada não apenas para cultura 2D, mas para qualquer outra aplicação, como co-cultura 3D com organoides ou bioimpressão.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o isolamento do mesênquima intestinal murino, com foco na extração de telócitos. O método tem como objetivo aprimorar sistemas de co-cultura com organoides, fornecendo uma representação mais precisa do ambiente tecidual original.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Engenharia de Tecidos
Antecedentes
- Os telócitos são células especializadas no mesênquima intestinal.
- Eles desempenham um papel nas interações célula-célula e na homeostase tecidual.
- O isolamento de telócitos viáveis é crucial para o estudo de suas funções.
- Protocolos existentes podem não fornecer quantidades suficientes dessas células.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o isolamento de mesênquima intestinal e telócitos.
- Facilitar o estudo das interações dos telócitos na saúde e na doença.
- Fornecer uma fonte de moléculas sinalizadoras para o crescimento ex vivo.
Métodos Utilizados
- Os segmentos intestinais foram lavados e cortados em pequenos pedaços.
- As células foram dissociadas utilizando digestão enzimática e agitação mecânica.
- A citometria de fluxo foi empregada para analisar a viabilidade celular e a composição.
- A imunomarcação foi utilizada para identificar telócitos e avaliar suas características.
Principais Resultados
- O protocolo resultou em uma alta porcentagem de telócitos viáveis.
- A citometria de fluxo indicou que 10% das células isoladas eram telócitos.
- Os telócitos recuperaram sua morfologia após vários dias em cultura.
- A imunomarcação confirmou a expressão de marcadores específicos nos telócitos.
Conclusões
- Este método fornece uma fonte viável de telócitos para pesquisa.
- Os telócitos isolados podem ser utilizados em diversas aplicações, incluindo co-cultivo com organoides.
- Os achados aprimoram a compreensão dos papéis dos telócitos na biologia intestinal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento eficiente de telócitos viáveis a partir do mesênquima intestinal murino permite a modelagem avançada do nicho de células-tronco intestinais e das interações célula-célula essenciais para a homeostase tecidual. Este protocolo sustenta sistemas ex vivo de alta fidelidade, facilitando estudos preditivos sobre sinalização estroma-epitelial e dinâmica de fatores de crescimento. O método aprimora a continuidade translacional desde a biologia de descoberta até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos em portfólios de pesquisa gastrointestinal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de vias de sinalização mediadas por telócitos relevantes para a regulação de células-tronco intestinais.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer uma fonte definida de células mesenquimais que suportam o nicho.
- Facilita a validação funcional de alvos para fatores estromais que influenciam a proliferação epitelial.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece suspensões de células isoladas validadas, adequadas para imunomarcação quantitativa e citometria de fluxo.
- Permite o preparo reprodutível de populações de células mesenquimais para o desenvolvimento de ensaios de co-cultura.
- Apóia a padronização de ensaios mediante a preservação das propriedades antigênicas e funcionais dos telócitos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Permite a integração do mesênquima enriquecido com telócitos em sistemas de co-cultura de organoides para modelar ambientes teciduais nativos.
- Aprimora a relevância translacional ao permitir suporte a organoides independente de fatores de crescimento, refletindo condições in vivo.
- Facilita o avanço ajustado ao risco de modelos pré-clínicos para pesquisa de doenças gastrointestinais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo posiciona o isolamento de telócitos como uma etapa fundamental que conecta a descoberta inicial, o desenvolvimento de ensaios e a otimização de modelos translacionais nos fluxos de trabalho de pesquisa gastrointestinal.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre interações estroma-epiteliais e sinalização mediada por Wnt.
- Triagem Fornece suspensões celulares quantitativas e reprodutíveis para imunofenotipagem e separação subsequente.
- Análise de dados: Permite a quantificação por citometria de fluxo e imunomarcação de populações de telócitos e viabilidade.
- Pesquisa Translacional Alinha sistemas de co-cultura in vitro com a arquitetura tecidual in vivo para estudos de biomarcadores e mecanicistas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo reutilizável para a geração de fontes de células mesenquimais em diversos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na modelagem da biologia do nicho intestinal e da sinalização estromal.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento de telócitos viáveis e funcionalmente relevantes para uso escalonável em pesquisas.
- Valor Estratégico: Reduz a ambiguidade mecanicista em estudos estromal-epiteliais, apoiando decisões informadas de prosseguir/não prosseguir.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de descobertas gastrointestinais e ativos pré-clínicos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissociação de tecidos e manipulação de células isoladas para preservar a viabilidade dos telócitos.
- Exige acesso à infraestrutura de citometria de fluxo e imunomarcação para identificação e quantificação celular.
- Necessita padronização entre equipes dos passos do protocolo para garantir reprodutibilidade entre experimentos.
- Pode exigir adaptação para uso com diferentes fontes de tecidos ou espécies, conforme suportado pelo protocolo.
- Limitações potenciais incluem contaminação por células epiteliais e imunes, exigindo seleção cuidadosa de marcadores e estratégias de seleção celular.
