Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

Este protocolo integra a análise de imagem orientada por IA para segmentação de tecidos. Com a colheita seletiva de histologia por microdisseção a laser e nos aproxima da realidade da Pathomics. A predefinição do ROI do tecido usando IA, limita o tempo de uso dos slides de tecido à temperatura ambiente, reduz o esforço de mão-de-obra para realizar essas colheitas e diminui a variabilidade do operador.

Esta técnica é amplamente aplicável a qualquer pesquisa baseada em doenças ou patologias envolvendo a coleta ou enriquecimento de populações celulares específicas de amostras de tecidos. Este método é simples para usuários com conhecimento básico de histopatologia e experiência em LMD. A chave é garantir que você corte o calibrador limpo para as células e treine bem o classificador.

Para começar, certifique-se de que o slide esteja completamente seco antes de cortar os fiduciários de calibração de referência. Abra o software de microdisseção a laser e abra o arquivo sld de ponto de calibração padrão sob a opção formas de importação. Carregue a lâmina com o tecido voltado para baixo e o lado da etiqueta mais próximo do operador.

No suporte de slides no estágio de microdisseção a laser, selecione o foco automático antes da opção de corte. Usando o microscópio laser e o arquivo sld de ponto de calibração padrão, corte fiduciais de calibração na membrana PEN. Somente para coletas enriquecidas com microdisseção a laser, abra o software de análise de imagens.

Selecione imagens abertas e, na janela pop-up, selecione o arquivo de imagem de svs de ponto gerado a partir da digitalização do slide. Navegue até a guia anotações, selecione e use a ferramenta de anotação retângulo para desenhar uma caixa ao redor do tecido. Selecione a anotação da caixa e clique com o botão direito do mouse na imagem.

Selecione o menu suspenso avançado e clique na opção de particionamento. Defina o tamanho e o espaço entre 500 e 40, respectivamente, e selecione bem para gerar as telhas. Selecione e exclua a anotação da caixa do perímetro usada para gerar as telhas.

Selecione o menu de queda de ações de camada e clique em exportar para salvar as anotações de ladrilhos como um arquivo de anotação de ponto. Coloque uma cópia salva do algoritmo Python dapa, desenvolvido para mesclar as camadas de anotação classificadas por IA na mesma pasta do arquivo de anotações de ladrilhos. Copie o nome do arquivo de anotação de ladrilhos.

Abra o programa Python usando o ambiente de desenvolvimento integrado ocioso e cole o nome do arquivo de anotação de ladrilhos entre as cotações na parte inferior do programa. Selecione o menu suspenso e clique no módulo executar. Aguarde que alguns arquivos sejam gerados que terão todas as anotações de ladrilhos mescladas sob uma única camada.

Abra o software de análise de imagens e navegue até a guia anotações. Selecione o menu de queda de ações de camada e clique em excluir todas as camadas para remover todas as anotações da imagem. Selecione o menu de queda de ações de camada e clique em importar arquivo de anotação local.

Na janela pop-up, selecione o arquivo de anotação de ponto mesclado que foi gerado pelo script. Certifique-se de que todas as telhas importadas estão sob a mesma camada de anotação. A partir da guia classificadora, siga as instruções do fabricante para destacar áreas representativas do tumor, estroma e ROIs de fundo de deslizamento de vidro em branco.

Antes de executar o classificador, clique nas opções avançadas de classificador, selecione a camada de anotação desejada verificando a caixa ROI ou as caixas na guia anotações. Use a opção camada de anotação do menu de ações do classificador para executar o classificador. Uma vez concluída a análise do classificador, navegue até a guia anotações e selecione a camada de anotação gerada a partir da análise.

Selecione o menu suspenso de ações de camada e clique em excluir todas as camadas, mas atual para remover todas as outras camadas de anotação da imagem. Em seguida, selecione o menu de queda de ações de camada e clique em exportar para salvar as anotações como um arquivo de anotação de ponto. Crie uma pasta para a sessão ou projeto e salve o arquivo de anotação de ponto dentro de uma subpasta.

Rotulado com o identificador exclusivo para o slide. Navegue até a guia anotações, selecione as ações de camada para baixo e clique em excluir todas as camadas para remover todas as anotações da imagem. Selecione a ferramenta caneta e desenhe uma linha curta de cada fiduciário de calibração.

Desenhe linhas das marcas na seguinte ordem. Canto superior esquerdo, superior direito, inferior direito. Selecione o menu suspenso de ações de camada e clique em exportar para salvar as anotações de ladrilhos como um arquivo de anotação.

Adicione calib de sublinhado ao nome do arquivo e coloque o arquivo na pasta sub que contém as coordenadas para as formas de ladrilhos. Copie o endereço do projeto principal. Abra o malliator de geração de script de importação XML usando o ambiente de desenvolvimento integrado ocioso e cole o endereço da pasta do projeto entre as cotações na parte inferior do script.

Selecione o menu suspenso e clique em executar o módulo para executar o script. Carregue o slide da membrana marcada com o tecido voltado para baixo e o lado da etiqueta mais próximo do operador no suporte de slides no estágio do microscópio laser. Selecione formas de importação no menu suspenso do arquivo.

Selecione o ponto XML, arquivo de importação LMD gerado para o slide. Selecione não na janela pop-up para evitar carregar pontos de referência do arquivo e não na segunda janela popup para evitar o uso de quaisquer pontos de referência armazenados anteriormente para calibração. Siga as solicitações da aplicação de micro dissecção a laser e alinhe a cruz de calibração para cada uma das três fiduciárias de calibração no slide.

Procure por fiduciais de calibração que aparecem no canto superior esquerdo, superior direito e inferior direito da imagem de slides. No software de análise de imagens que corresponderá aos pontos de referência do slide de microdisseção a laser invertido no estágio do microscópio. Alternar entre usar a lente subjetiva 5x para localizar, e a lente subjetiva de 63x para alinhar cada fiduciário de calibração.

Selecione não na janela pop-up para evitar salvar os pontos de referência para arquivo e tudo bem na segunda janela pop-up para confirmar se o slide está inserido. Mova a lente subjetiva 5x para a posição e selecione sim na janela pop-up para usar a ampliação real. Uma vez que as formas importadas aparecem, concentre a câmera no tecido.

Destaque e selecione todas as formas na janela de lista de formas. Arraste-os para o lugar usando uma ou duas anotações dentro do campo de visão como referências e alinhe o eixo z vertical para cortar com o laser. Carregue os tubos em suporte de tubo universal projetado para microtubos PCT.

Revise as formas importadas e atribua-as à posição apropriada do tubo para coleta. Pressione o corte de partida para ligar o laser. Descarregue e feche o tubo de amostra com tecidos LMD e coloque gelo seco.

Após termociclismo e centrifugação, o LMD colhia amostras de tecido, remove e descarta as microcapas dos microtubos PCT. Adicione trippsina, adicione uma proporção de um micrograma por tecido quadrado de 30 milímetros. E insira um micro pilão no micro tubo usando a ferramenta microcap.

Transfira os microtubos para um cartucho de ciclo de barril e monte o cartucho completo. Coloque o cartucho na câmara de pressão do ciclo do barril e fixe a tampa. Ciclo do barril a 45.000 PSI por 50 segundos e pressão atmosférica por 10 segundos a 50 graus Celsius para 60 ciclos.

Para análise de LC-MS MS, carregue frascos de amostrador automático nas posições apropriadas no amostrador automático de cromatografia líquida. Feche o amostrador automático e analise frações individuais com um método de espectrometria de gradiente e massa apropriado. Agrupamento hierárquico não supervisionado usando as 100 proteínas mais variáveis.

Resultou na segregação do câncer de ovário soroso de alto grau e do carcinoma de células claras do ovário a partir da microdisseção a laser enriquecida e amostras inteiras de tumores. Em contraste, a microdissecção a laser enriqueceu amostras de estroma de alto grau e carcinoma de células claras do ovário. Agrupados e independentemente da microdisseção a laser enriqueceu tumores e amostras de tumores inteiros.

Entre as 5.971 proteínas quantificadas, 215 foram significativamente alteradas entre coleções de tumores inteiros de câncer de ovário soroso de alto grau e amostras de carcinoma de células claras do ovário. Das 76 proteínas de assinatura quantificadas por Hughes, 57 foram co-quantificadas neste conjunto de dados e foram altamente correlacionadas O classificador é a parte mais desafiadora. Seguindo as instruções do software Indica Lab e refinando o classificador reproduziu os resultados mais precisos.

Todo o resto é padronizado. O tecido colhido usando este fluxo de trabalho LMD orientado por IA é compatível com uma variedade de aplicações analíticas a jusante, incluindo proteômica baseada em espectrometria de massa descrita aqui ou genomi, transcriptômica ou outras análises omicais.