Name: In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda métodos in ovo e ex ovo para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário usando embriões de galinha. Este protocolo detalha técnicas de eletroporação e cultura de explantes para investigar regeneração de células ciliadas e avaliar efeitos ototóxicos de fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos o apoio do NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e do Royal National Institute for the Deaf. Gostaríamos de agradecer à Organização Central de Desenvolvimento Avícola e ao Instituto de Treinamento, Hesaraghatta, Bangalore. Somos gratos ao CIFF e ao apoio laboratorial e às instalações do EM no NCBS. Agradecemos a Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami pelas construções Tol2-eGFP e T2TP, e a Guy Richardson pelo HCA e anticorpo G19 Pcdh15. Somos gratos aos membros da Earlab por seu apoio constante e feedback valioso sobre o protocolo.

Protocolos envolvendo a aquisição, cultura e uso de ovos de galinha fertilizados e embriões não eclodidos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Centro Nacional de Ciências Biológicas, Bengaluru, Karnataka.
1. Na eletroporação de ovoporação de precursores auditivos de pintos
<ol><li>Projeto de sgRNA e clonagem para knockout do gene CRISPR/Cas9<ol><li>Para criar nocautes de genes, o projeto guia RNAs para interromper as regiões éxons do gene, de preferência mais perto da extremidade 5' da região codificadora.</li>
		<li>Selecione os potenciais RNAs guia usando uma ferramenta web CRISPOR23. Defina os dados do navegador como Gallus gallus e a sequência de motivos adjacentes do protoespaçador (PAM) como 5'- NGG -3'. O programa determina os RNAs de guia a partir da sequência de entrada e atribui pontuações diferentes com base na atividade no alvo e fora do alvo. Selecione os quatro principais guias para estudos adicionais.</li>
		<li>Para o projeto de oligos específicos do modelo para a produção de RNA do guia (g), remova a sequência PAM (5′- NGG -3′) da saída da ferramenta de projeto do gRNA. Isso não é necessário para a segmentação, mas contém a sequência de reconhecimento de clivagem Cas9. Sintetizar dois oligos complementares purificados por HPLC com local de restrição de BsmBI em ambas as extremidades, para cada potencial gRNA.</li>
		<li>Clone a sequência guia em quadro com um andaime de tracrRNA de um vetor de escolha (aqui, pcU6_1sgRNA vetor foi utilizado24).</li>
		<li>Dissolver os oligonucleotídeos de sgRNA a uma concentração de 100 μM em água isenta de DNase/RNase. Realizar o recozimento das duas guias oligo sense e antisense usando um termociclador com os seguintes parâmetros: 95 °C por 3 min, depois 37 °C por 15 min e, em seguida, diminuir para 4 °C.</li>
		<li>Usando técnicas padrão de biologia molecular, conforme descrito em25, a digestão de restrição de configuração dos oligos recozidos e pcU6_1sgRNA vetor de clonagem com a enzima BsmBI durante a noite. Ajuste a ligadura com o vetor de pcU6_1sgRNA linear BsmBI digerido por gel e oligos de sgRNA digeridos. Transformar-se em uma célula competente DH5-alfa e sequência confirmar o clone obtido.</li>
	</ol></li>
	<li>Manuseamento e janelas de ovos<ol><li>Procure ovos recém-postos e limpe-os limpando-os com etanol a 70% para evitar a contaminação. Incubar a 37-38 °C, com 45% de umidade por 3,5-4 dias.</li>
		<li>Após a incubação, coloque o ovo de lado por pelo menos 5 minutos antes de abrir. Isso permite que o embrião se reposicione no topo da gema. Use fórceps para fazer pequenos orifícios na parte superior e na extremidade romba do ovo, de modo que uma agulha 21G possa passar.</li>
		<li>Para evitar danos durante a janela, remova a albumina para abaixar o embrião para longe da casca. Para fazer isso, use uma seringa de 5 mL e uma agulha 21G para extrair cuidadosamente 2 mL de albumina de um orifício na extremidade contundente do ovo. Use fita adesiva transparente para cobrir o orifício na extremidade contundente.</li>
		<li>Para fazer a janela do ovo, afixe fita adesiva no topo da casca do ovo. Corte uma janela, com cerca de 2 cm de comprimento e 1,5 cm de largura, usando uma tesoura de arco de mola e exponha o embrião. Use fórceps para abrir as membranas coriônicas que recobrem o embrião, permitindo o acesso ao embrião.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmídeos de microinjeção<ol><li>Para o experimento de knockout de genes, prepare duas soluções: a mistura knock-down contendo a proteína SpCas9 e o plasmídeo guia - pcU6_1sgRNA, e a mistura de plasmídeo traçador de T2K-eGFP (este é um de GFP de condução de chick ß-actin conduzindo GFP cercado pelos locais de transposon de Tol2) juntamente com o T2TP (a transposase de Tol2 clonada na construção de Tol226,27). O traçador é usado para rastrear a eficiência da eletroporação.</li>
		<li>Ao eletroporar múltiplos plasmídeos, certifique-se de que a concentração final de DNA seja de pelo menos 4 μg/μL. Misture as três construções, plasmídeo guia - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP e T2TP, em uma proporção de 1:1:1 com 1 μg de proteína SpCas9, 30% de sacarose e 0,1% de corante Fast Green em um volume final de 10 μL.</li>
		<li>Puxe as agulhas para microinjeção dos capilares de vidro padrão (comprimento 3 pol, OD 1,0 mm) usando um puxador de pipeta vertical. Use pinça fina para quebrar a ponta capilar após a tração para obter um diâmetro da ponta de aproximadamente 50 μm com uma extremidade cônica.</li>
		<li>Coloque os embriões em E3.5 no lado esquerdo com a cabeça voltada para a direita. Desta forma, apenas a vesícula ótica direita é acessível para micro-injeção. Micro-injete a mistura knock-down na vesícula ótica. Injete cerca de um volume de 200 nL de mistura de solução de DNA para encher a vesícula ótica.</li>
		<li>Determinar a eficiência da guia usando um ensaio de endonuclease T728.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroporação<ol><li>Adicione algumas gotas de solução salina a 0,719% em cima do embrião antes da eletroporação para diminuir a resistência elétrica e evitar o superaquecimento do embrião.</li>
		<li>Coloque o eletrodo positivo através do orifício feito no lado rombudo do ovo quando a albumina foi removida. Manobrar o eletrodo para que ele fique sob a gema. Coloque o eletrodo negativo sobre o otocisto cheio.</li>
		<li>Use eletroporação para transfectar plasmídeos para as células do embrião. Use um gerador de pulso quadrado e aplique cinco pulsos de 25 V e 100 ms de duração cada, separados por 50 ms. Determine as condições empiricamente com base em uma configuração de eletroporação individual.</li>
		<li>Hidrate o embrião após a eletroporação adicionando algumas gotas de solução salina a 0,719%. Para limpar a albumina desnaturada da superfície dos eletrodos, enxágue-a completamente com água destilada. Voltar a selar o ovo com fita adesiva e regressar à incubadora humidificada a 37-38 °C para posterior incubação. NOTA: Os embriões podem ser cultivados até a eclosão após a eletroporação, no entanto, há uma redução acentuada na viabilidade.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dissecção da papila basilar
<ol><li>Use etanol a 70% para desinfetar a mesa cirúrgica, o estágio do microscópio e a área circundante. O calor ou o álcool esterilizam equipamentos de microdissecação que incluem tesouras de arco de mola mínimas, microcurette e dois pares de pinças finas.</li>
	<li>Prepare as seguintes placas de dissecação: uma placa de Petri de vidro com uma base de silício preto, uma placa de Petri de plástico de 90 mm e uma placa de Petri de 60 mm. Resfrie a solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou a Solução Salgada Balanceada de Hanks (HBSS) para dissecações.</li>
	<li>Quebre suavemente o ovo na placa de Petri de 90 mm. Identifique a orelha externa do pintinho. Decapitar o embrião cortando o pescoço logo abaixo do nível da mandíbula inferior usando uma tesoura. Transfira a cabeça para uma placa de Petri de 60 mm cheia de PBS gelada.</li>
	<li>Oriente o embrião com a parte superior do bico voltada para o experimentador e segure o bico usando uma das pinças #5. Retire os olhos usando o segundo fórceps #5. Indo de rostral para caudal, corte o crânio ao longo de sua linha média. Tire o cérebro.</li>
	<li>Adicione mais PBS ou HBSS gelado e localize as duas estruturas brilhantes, perto do nível do pavilhão auricular. Estes são os otólitos da lagena no final do ducto coclear e são encontrados perto da linha média.</li>
	<li>Corte aproximadamente entre as duas lagenas, e bem acima e abaixo desta região para isolar duas orelhas internas. Sob iluminação oblíqua, visualize o contorno do ouvido interno. Remova o tecido estranho e o vestíbulo.</li>
	<li>Transfira a cóclea isolada para uma placa de base de silicone preto com PBS gelado. Usando pinça # 5, descasque a cápsula coclear cartilaginosa para obter o ducto coclear. Localize a camada ondulada (tegmento) do ducto coclear e remova usando pinça #55 para expor a PA. Usando pinça #55, remova a membrana tectorial para expor HCs e SCs.</li>
</ol>3. Cultura de explantes de papila basilar
<ol><li>Cultura de membrana da PA<ol><li>Pegue uma placa de cultura de tecido de seis poços e organize uma inserção de membrana de cultura por poço.</li>
		<li>Recolher a papila basilar dissecada (explante) numa pipeta de 200 μL com 1x tampão HBSS e transferi-la para uma membrana. Para evitar que o tecido grude na parede da pipeta, desenhe alguns meios antes de aspirar o tecido.</li>
		<li>Oriente o explante de tal forma que a papila basilar esteja voltada para cima, de modo que o cabelo e as células de suporte sejam visíveis a partir do topo29. Uma vez que o explante esteja posicionado, aspirar o tampão HBSS lentamente da superfície da membrana de cultura. Neste processo, o explante se ligará à membrana de cultura.</li>
		<li>Adicione 1,2 mL do meio de cultura Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco entre a inserção da membrana e a parede do poço para encher os poços da placa de seis poços. Até seis explantes podem ser cultivados em uma única membrana de cultura de 30 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura de colágeno do ducto coclear<ol><li>Prepare a mistura de colágeno adicionando 400 μL de 3 mg/mL de colágeno de cauda de rato, 50 μL de 10x DMEM, 30 μL de 7,5% de NaHCO3 e 5 μL de HEPES em um exaustor de cultura de tecidos.</li>
		<li>Pegue um prato de quatro poços e adicione três gotas de mistura de colágeno em cada poço. Transfira o ducto coclear dissecado para cada gota de colágeno. Incubar a placa por 10 min a 37 °C, 5% de CO2 para curar a matriz de colágeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento de pequenas moléculas de culturas<ol><li>Preparar meios de cultura (DMEM, suplemento de N-2, penicilina) com o modulador farmacológico ou seu solvente sozinho (para uso como controle). Substitua o meio de cultura por 700 μL de meio suplementado com o inibidor. Cultivar os explantes em incubadora a 37 °C, 5% de CO2.</li>
		<li>Substitua 50% da mídia cultural todos os dias. Após o tempo de incubação adequado, remova o meio de cultura e utilize os explantes para ensaios a jusante.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imagem e análise
<ol><li>Análise imunofluorescente<ol><li>Remova os meios de cultura dos poços e lave os explantes duas vezes com 1x HBSS. Usando uma pipeta, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) ao poço e incube por 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire o PFA e lave os explantes três vezes com 1x PBS à temperatura ambiente. Para coletar os explantes da membrana de cultura, faça um pequeno corte ao redor da membrana contendo o pedaço do tecido usando uma pequena tesoura de arco de mola e transfira o tecido junto com a membrana para uma placa de cultura de 48 poços usando pinça. NOTA: Se os tecidos estiverem flutuando após a fixação, aspirar com uma pipeta de 200 μL e transferi-la para placas de 48 poços para processamento adicional. Evite o descolamento forçado do tecido da membrana.</li>
		<li>Para a cultura de gotículas de colágeno, use fórceps para transferir toda a gota de colágeno para uma placa de silício. Adicione 200 μL de 1x PBS e remova o colágeno com a ajuda de fórceps e, em seguida, transfira o tecido para uma placa de cultura de 48 poços.</li>
		<li>Permeabilizar os explantes com 1 mL de 1x PBS suplementado com Tween-20 a 0,3% (PBST) por 30 min à temperatura ambiente. Incubar os explantes com 200 μL de tampão bloqueador (10% de soro de cabra + 1% de albumina sérica bovina em PBST) por 1 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar os explantes com 200 μL de solução de anticorpos primários (1:300, em tampão de bloqueio) durante a noite a 4 °C. Retire a solução primária de anticorpos e lave bem os explantes 5 x 20 min com PBST.</li>
		<li>Incubar os explantes com 200 μL de faloidina e solução de anticorpos secundários (em tampão de bloqueio) por 1 h à temperatura ambiente no escuro. Retire a faloidina e a solução de anticorpos secundários e lave bem os explantes 5 x 20 min com PBST. NOTA: A concentração secundária de anticorpos e o comprimento de lavagem devem ser determinados para cada aplicação individual de imagem. Para imagens usando microscopia de super resolução, normalmente aumentamos a concentração do anticorpo secundário de 1:500 para 1:200 e aumentamos a concentração de faloidina de 1:400 para 1:200.</li>
		<li>Incubar os explantes com uma solução de DAPI (1:1000 em PBST) durante 15 min à temperatura ambiente. Retire a solução DAPI e lave os explantes 3 x 5 min com PBST.</li>
		<li>Use o meio de montagem para montar explantes em uma lâmina com a pressão arterial voltada para cima (contra a tampa). Para imagens confocais, use meios de montagem antifade. Deixe o meio de montagem secar durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Escreva a imagem diretamente ou armazene os slides a 4 °C até a geração de imagens.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação ototo para análise de MEV<ol><li>Prepare todas as soluções frescas e manuseie de acordo com as diretrizes de segurança locais. Fixar explantes cultivados por membrana (a partir da etapa 4.1.4) em glutaraldeído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3) com CaCl2 3 mM. Efectuar a fixação a 4 °C durante 24 a 72 h com uma mudança de fixador a cada 24 h.</li>
		<li>Retire o fixador e lave o tecido com cacodilato de sódio 0,1 M 3 x 5 min à temperatura ambiente. Fixação secundária com 1% de OsO 4 (diluído a partir de um estoque de OsO 4a 4% usando tampão de cacodilato de sódio 0,1 M) por 1 h à temperatura ambiente. Execute esta e as etapas subsequentes até a desidratação em um exaustor.</li>
		<li>Enxaguar com tampão de cacodilato de sódio 0,1 M 3 x 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, enxaguar em água duplamente destilada ou ultrapura 3 x 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar uma solução a 0,5% de tiocarbohidrazida (TCH) em água ultrapura. Agitar a 75 °C durante 10 min e filtrar a solução quando esta tiver arrefecido à temperatura ambiente. NOTA: O TCH é extremamente perigoso. O uso deve ser aprovado pelo comitê de segurança local e deve-se tomar cuidado ao manusear.</li>
		<li>Remova a água ultrapura da amostra e adicione 0,5% de TCH gota a gota. Se a solução ficar castanha, pare e lave a amostra com água ultrapura, antes de adicionar cuidadosamente a solução de TCH a 0,5%. Quando a solução estiver limpa, substitua-a por 0,5% de TCH. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min30,31.</li>
		<li>Enxaguar a amostra com água ultrapura 3 x 5 min à temperatura ambiente. Repita as etapas 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.5 mais duas vezes, terminando com a incubação de OsO4 seguida de enxágue.</li>
		<li>Desidratar as amostras em uma série de etanol para etanol 100% anidro (EtOH). Incubar primeiro em 25% ETOH por 10 min, depois 50% ETOH por 10 min, 75% EtOH por 10 min, 95% ETOH por 10 min, antes de incubar por um total de 3x por 10 min cada em 100% ETOH.</li>
		<li>Realizar secagem por ponto crítico utilizando COlíquido 2. Monte imediatamente as amostras em um stub SEM com fita adesiva de carbono de dupla face. Prossiga para o revestimento de esguicho para fornecer 5-10 nm de revestimento. Se não houver imagens imediatas, armazene as amostras em um exsicador sob vácuo.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Sai, X., Ladher, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+inner+ear+development%3A+induction+and+morphogenesis+of+the+otic+placode%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).</li>
<li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+sound+in+space%3A+the+regulation+of+inner+ear+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139 (2), 245-257 (2012).</li>
<li>Driver, E. C., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the cochlea.</a> Development. 147 (12), (2020).</li>
<li>Richardson, G. P., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bundle+links%3A+genetics+as+the+gateway+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hair-bundle links: genetics as the gateway to function.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).</li>
<li>Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments%2C+stereocilia+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+VI.+How+the+number+and+arrangement+of+stereocilia+are+determined%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined.</a> Development. 116 (1), 213-226 (1992).</li>
<li>Jones, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+proteins+link+basal+body+polarization+to+planar+cell+polarity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation.</a> Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).</li>
<li>Sipe, C. W., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kif3a+regulates+planar+polarization+of+auditory+hair+cells+through+both+ciliary+and+non-ciliary+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms.</a> Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).</li>
<li>May-Simera, H. L., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%2C+Wnt+signaling%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton.</a> Cilia. 1 (1), 1(2012).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereocilia-staircase+spacing+is+influenced+by+myosin+III+motors+and+their+cargos+espin-1+and+espin-like%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like.</a> Nature Communications. 7, 10833(2016).</li>
<li>Corwin, J. T., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+sensory+hair+cells+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma.</a> Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).</li>
<li>Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hair+cell+regeneration+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hair cell regeneration research.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).</li>
<li>Edge, A. S., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).</li>
<li>Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+hair+cell+development+and+regeneration%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences.</a> Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).</li>
<li>Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feathers+and+fins%3A+non-mammalian+models+for+hair+cell+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration.</a> Brain Research. 1277, 12-23 (2009).</li>
<li>Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+hair+cell+regeneration+research+and+speculations+on+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future.</a> Hearing Research. 297, 42-51 (2013).</li>
<li>Stone, J. S., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).</li>
<li>Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transdifferentiation+gives+rise+to+the+earliest+new+hair+cells+in+regenerating+avian+auditory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+the+vertebrate+mechanosensory+cell+and+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).</li>
<li>Tilney, L. G., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+filaments%2C+stereocilia%2C+and+hair+cells+of+the+bird+cochlea.+IV.+How+the+actin+filaments+become+organized+in+developing+stereocilia+and+in+the+cuticular+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate.</a> Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).</li>
<li>Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-cell+regeneration+in+organ+cultures+of+the+postnatal+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear.</a> Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).</li>
<li>Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+labyrinth%3A+culture+of+the+chicken+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear.</a> Methods. 66 (3), 447-453 (2014).</li>
<li>Matsunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+supporting+cell+activation+for+hair+cell+regeneration+in+the+avian+auditory+epithelium%3A+an+explant+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994(2020).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+genome+editing+for+loss-of-function+in+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo.</a> Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2021 (11), (2021).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).</li>
<li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+stable+integration+and+tetracycline-inducible+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).</li>
<li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Davies, S., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+mammalian+organ+of+Corti+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy.</a> Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).</li>
<li>Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+electron+microscopy+methods+for+examination+of+cochlear+morphology+in+mouse+models+of+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).</li>
<li>Bermingham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1%3A+an+essential+gene+for+the+generation+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells.</a> Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).</li>
<li>Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+cadherin+23+and+protocadherin+15+in+the+kinocilial+links+of+avian+sensory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells.</a> The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).</li>
<li>Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+distribution+of+the+275+kD+hair-cell+antigen+during+development+of+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).</li>
<li>Funahashi, J., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation in avian embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).</li>
<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Electroporation: past, present and future.</a> Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).</li>
<li>Olaya-Sanchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf3+and+Fgf16+expression+patterns+define+spatial+and+temporal+domains+in+the+developing+chick+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear.</a> Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).</li>
<li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).</li>
<li>Serralbo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+and+web+resources+in+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transgenesis and web resources in quail.</a> Elife. 9, 56312(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses concorrentes a divulgar.

O pintinho é uma adição econômica e conveniente aos organismos modelo que um laboratório pode usar para pesquisar o ouvido interno. Os métodos descritos aqui são rotineiramente usados em nosso laboratório e complementam a pesquisa em andamento no ouvido interno dos mamíferos. No ovo, a eletroporação é usada para introduzir manipulações genéticas no genoma do pintinho. A eletroporação também pode ser usada para introduzir construtos que codificam proteínas fluorescentes direcionadas a organelas ou estruturas subc...

A orelha interna de todos os vertebrados é derivada de um epitélio simples conhecido como placode ótico 1,2. Isso dará origem a todos os elementos estruturais e aos tipos de células necessários para transduzir a informação mecanossensorial associada à audição e à percepção de equilíbrio. As células ciliadas (HCs), o sensor ciliado do ouvido interno, são cercadas por células de suporte (SCs). Os HCs transmitem informações para o rombencéfalo auditivo através dos neurônios do oitavo nervo craniano. Estes também são gerados a partir do placode ótico3. A transdução primária do som é realizada na superfície apical do HC auditivo, através de um feixe capilar mecanicamente sensível4. Isso é mediado por meio de saliências modificadas à base de actina chamadas estereocílios, que são dispostas em um padrão de escada graduada5. Além disso, um cílio primário modificado, chamado de cinocílio, organiza a formação de feixes capilares e é adjacente à fileira mais alta de estereocílios 6,7,8. A arquitetura dos estereocílios é fundamental para esse papel na conversão de estímulos mecânicos derivados da energia acústica em sinais neurais elétricos9. Danos à HC auditiva por envelhecimento, infecção, trauma otoacústico ou choque ototóxico podem resultar em perda auditiva parcial ou completa que, em mamíferos, é irreversível10.
Terapias de substituição celular têm sido propostas que podem reparar tais danos11,12. A abordagem desta pesquisa tem sido compreender o desenvolvimento normal da célula ciliada de mamíferos e perguntar se os programas de desenvolvimento podem ser reiniciados em células semelhantes a progenitores que possam existir dentro da orelha interna13. Uma segunda abordagem tem sido olhar para fora dos mamíferos, para vertebrados não mamíferos nos quais ocorre regeneração robusta das células ciliadas auditivas, como as aves14,15. Em aves, a regeneração das células ciliadas ocorre predominantemente através da desdiferenciação de uma célula de suporte para um estado semelhante ao de progenitor, seguida de divisão mitótica assimétrica para gerar uma célula ciliada e uma célula de suporte16. Além disso, a diferenciação direta de uma célula de suporte para gerar uma célula ciliada também tem sido observada17.
Embora os mecanismos de desenvolvimento auditivo aviário mostrem semelhanças significativas com os dos mamíferos, existem diferenças18. A diferenciação de HC e SC na PA do pintinho é aparente a partir do dia embrionário (E) 7, tornando-se mais distinta ao longo do tempo. Por E12, uma papila basilar (PA) bem padronizada e bem polarizada pode ser visualizada, e por E17 células ciliadas bem desenvolvidas podem ser vistas19. Esses pontos de tempo fornecem janelas para os mecanismos de diferenciação, padronização e polaridade, bem como a maturação das células ciliadas. Entender se tais mecanismos são conservados ou divergentes é importante, pois eles fornecem insights sobre a homologia profunda das origens das células ciliadas mecanossensoriais.
Aqui, demonstramos uma série de técnicas realizadas em estágios embrionários iniciais e tardios para estudar processos celulares, como proliferação, especificação de destino, diferenciação, padronização e manutenção ao longo do desenvolvimento do órgão do ouvido interno. Isso complementa outros protocolos de compreensão do desenvolvimento da orelha interna em cultura de explante20,21,22. Primeiro, discutimos a introdução de DNA ou RNA exógeno em precursores da PA dentro do otocisto E3.5 usando na ovo-eletroporação. Embora as manipulações genéticas possam fornecer informações valiosas, os fenótipos assim gerados podem ser pleiotrópicos e, consequentemente, confusos. Isto é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento posterior do ouvido interno, onde processos fundamentais, como o remodelamento citoesquelético, desempenham múltiplos papéis na divisão celular, morfogênese tecidual e especialização celular. Apresentamos protocolos de inibição farmacológica em explantes cultivados, que oferecem vantagens no controle da dosagem e do tempo e duração do tratamento, oferecendo manipulação espaço-temporal precisa dos mecanismos de desenvolvimento.
Diferentes métodos de cultura de órgãos podem ser utilizados, dependendo da duração do tratamento de pequenos inibidores. Aqui demonstramos dois métodos de cultura de órgãos que permitem insights sobre a morfogênese epitelial e a especialização celular. Um método para cultura 3D usando colágeno como matriz para cultivar o ducto coclear permite a cultura robusta e a visualização ao vivo da PA em desenvolvimento. Para a compreensão da formação de estereocílios, apresentamos um método de cultura de membrana de tal forma que o tecido epitelial seja cultivado em uma matriz rígida, permitindo que as saliências de actina cresçam livremente. Ambos os métodos permitem o processamento a jusante, como imagens de células vivas, imuno-histoquímica, microscopia eletrônica de varredura (MEV), gravação celular, etc. Essas técnicas fornecem um roteiro para o uso efetivo do pintinho como um sistema modelo para entender e manipular o desenvolvimento, maturação e regeneração do epitélio auditivo aviário.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Tecnologias</td> de <td>DNA Integradas</td><td>1081061</td><td>Proteína Cas9 de alta fidelidade</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>Coelho policlonal para soro bovino GFP</td></tr><tr><td> Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, cauda de rato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Secador de ponto crítico Leica EM CPD300</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 Eletroporador</td><td>Nepageno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Microscópio de Campo Amplo Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Fine</td><td>Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>FLUOVIEW 3000 Microscópio de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído (25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Mouse IgG Secundário, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Mouse IgG Secundária Anticorpo, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra filtrado estéril</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td><td></td></tr> Solução <tr><td>salina balanceada de Hanks inativada por calor (HBSS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan Microscópio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Cell Culture Insert, 30 mm, PTFE hidrofílico, 0.4 &micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 Microscópio Estéreo</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A anticorpo</td><td>DSHB</td><td>138-1</td> Microscópio de dissecação <td>monoclonal de camundongo para miosina não convencional-VIIa</td></tr><tr><td>MZ16</td> Suplemento <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 (100X)</td> <td>Tesoura Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Noyes, 14cm (5,5' ')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>tetróxido de ósmio (4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 Extrator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>Mini vetor com frango modificado U6</td></tr><tr><td>promotor Penicilina G sal</td> <td>de sódioSigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 Microscópio de dissecação</td><td>Tampão</td> de Cacodilato de Sódio Nikon<td></td><td></td></tr><tr><td>, 0.2M</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Sódio cloreto</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>Sputtre Coater K550X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, Sem Filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>O MERLIN Compact VP</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo e ex ovo métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

O ouvido interno percebe o som e mantém o equilíbrio usando a cóclea e o vestíbulo. Ele faz isso usando um tipo de célula mecanossensorial dedicada conhecida como célula ciliada. A pesquisa básica no ouvido interno levou a uma compreensão profunda de como as células ciliadas funcionam e como a desregulação pode levar à perda auditiva e vertigem. Para esta pesquisa, o mouse tem sido o sistema modelo proeminente. No entanto, os ratos, como todos os mamíferos, perderam a capacidade de substituir as células ciliadas. Assim, ao tentar entender as terapias celulares para restaurar a função do ouvido interno, estudos complementares em outras espécies de vertebrados poderiam fornecer mais insights. O epitélio auditivo de aves, a papila basilar (PA), é uma folha de epitélio composta por células ciliadas mecanossensoriais (HCs) intercaladas por células de suporte (SCs). Embora a arquitetura anatômica da papila basilar e da cóclea de mamíferos difiram, os mecanismos moleculares do desenvolvimento da orelha interna e da audição são semelhantes. Isso torna a papila basilar um sistema útil não apenas para estudos comparativos, mas também para entender a regeneração. Aqui, descrevemos técnicas de dissecação e manipulação para o ouvido interno da galinha. A técnica mostra métodos genéticos e de inibição de moléculas pequenas, que oferecem uma ferramenta potente para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento do ouvido interno. Neste trabalho, discutimos em ovo-eletroporação técnicas para perturbar geneticamente a papila basilar utilizando deleções CRIPSR-Cas9, seguidas de dissecção da papila basilar. Também demonstramos a cultura de órgãos da PA e o uso ideal das matrizes de cultura, para observar o desenvolvimento do epitélio e das células ciliadas.

Na configuração de eletroporação, o posicionamento do eletrodo pode desempenhar um papel no domínio da transfecção. O eletrodo positivo é colocado sob a gema e o negativo acima do embrião (Figura 1A). Isso resulta em maior expressão de GFP em grande parte da orelha interna e em ambos os órgãos vestibulares (Figura 1B) e na papila basilar auditiva (Figura 1C,D), confirmando a transfecção.
...

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Idade, infecção e drogas ototóxicas podem causar degeneração das células ciliadas do ouvido interno, o que em nós leva à perda auditiva. Em vertebrados não mamíferos, como pintinhos, as células ciliadas podem ser regeneradas. As técnicas aqui descritas fazem uso do custo-benefício do trabalho com embriões de pintinhos, da facilidade de obtenção de embriões e do bom desenvolvimento exo de explantes teciduais.Compreender o desenvolvimento e a regeneração dos pelos do ouvido interno das aves pode fornecer informações importantes sobre a perda auditiva e as possíveis terapias, e a cultura de explante pode ser importante para avaliar os efeitos ototóxicos de várias drogas. Antes de iniciar o experimento, adquira ovos recém-postos e limpe-os com etanol a 70% para evitar a contaminação. Incubar os ovos por 3,5 a 4 dias, a 37 a 38 graus Celsius com 45% de umidade.Após a incubação, reposicione o embrião no topo da gema, colocando um ovo de lado por cinco minutos. Em seguida, use fórceps para fazer um pequeno orifício na parte superior e na extremidade romba do ovo para uma agulha de calibre 21 passar. Usando uma seringa de cinco mililitros e uma agulha de calibre 21, remova dois mililitros da albumina de um orifício na extremidade contundente do ovo.Cubra o orifício na extremidade contundente usando fita adesiva. Para fazer com que a janela do ovo afixe a fita transparente na parte superior da casca do ovo. Segure as agulhas da microinjeção de capilares de vidro padrão usando um puxador de pipeta vertical.Após a tração, quebre a ponta capilar usando pinça fina para obter um diâmetro de ponta de aproximadamente 50 micrômetros com uma extremidade cônica. Para o experimento de nocaute de genes, misture os três construtos, a saber, o plasmídeo-guia, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP em uma proporção um-para-um com um micrograma de proteína SP Cas9, 30% de sacarose e corante verde 0,1% rápido, e um volume final de 10 microlitros. Ao eletroporar múltiplos plasmídeos, certifique-se de que a concentração final de DNA seja de pelo menos quatro microgramas por microlitro.Com a ajuda de uma tesoura de arco de mola, abra cerca de uma janela de dois centímetros de comprimento e 1,5 centímetro de largura e exponha o embrião. Em seguida, use fórceps para abrir as membranas coriônicas que recobrem o embrião, permitindo o acesso ao embrião. Injete cerca de 200 nanolitros de volume de mistura de solução de DNA para preencher a vesícula ótica.Para determinar a eficiência do RNA guia realize um ensaio de endonuclease T7. Adicione gotas salinas de 0,719% ao embrião para diminuir a resistência elétrica e evitar o superaquecimento. Em seguida, coloque o eletrodo positivo através do orifício feito no lado rombudo do ovo e manobre o eletrodo para que ele fique sob a gema.Coloque o eletrodo negativo sobre o otocisto cheio. Para transfectar o plasmídeo para a vesícula ótica com eletroporação, use um gerador de pulso quadrado e aplique cinco pulsos de 25 volts por 100 milissegundos cada, com 50 milissegundos de intervalo. Determine as condições empiricamente com base em uma configuração de eletroporação individual.Após a eletroporação, hidrate o embrião adicionando algumas gotas de 0,719% de solução salina. Volte a selar o ovo com fita adesiva e retorne à incubadora umidificada a 37 a 38 graus Celsius para posterior incubação. Desinfete a mesa cirúrgica, o estágio do microscópio e a área circundante usando etanol e calor a 70%, ou esterilize o equipamento de microdissecção, incluindo tesouras minimamente de arco de mola, micro cureta e dois pares de pinça fina.Prepare as placas de dissecação, incluindo uma placa de Petri de vidro com uma base de silicone preta, uma placa de Petri de plástico de 90 milímetros e uma placa de Petri de 60 milímetros. Mantenha o PBS refrigerado ou a solução salina balanceada de Hanks, também conhecida como HBSS, pronta para dissecações. Quebre suavemente o ovo na placa de Petri de 90 milímetros.Em seguida, identifique a orelha externa do pintinho e transfira a cabeça para uma placa de Petri de 60 milímetros cheia de PBS gelada. Em seguida, oriente o embrião com a parte superior do bico voltada para dentro e segure o bico usando uma das pinças número cinco. Retire os olhos usando o segundo fórceps número cinco.Então, de rostral para caudal, corte ao longo do crânio ao longo de sua linha média e retire o cérebro. Adicione mais PBS gelado, ou HBSS, e localize os dois otólitos da lagena como estruturas brilhantes no final do ducto coclear e perto da linha média. Para isolar duas orelhas internas, corte entre as duas lagenas, e bem acima e abaixo da região.Em seguida, sob iluminação oblíqua, visualize o contorno do ouvido interno e remova o tecido estranho e o vestíbulo. Transfira a cóclea isolada para uma placa de base de silicone preto com PBS gelado. Descasque a cápsula coclear cartilaginosa usando pinça número cinco para obter o ducto coclear.Em seguida, localize a camada ondulada ou tegmento do ducto coclear e remova-a usando pinça número 55 para expor a papila basilar ou a PA. Em seguida, remova a membrana tectorial para expor as células ciliadas e as células de suporte usando pinça número 55. Para a cultura de membrana da papila basilar, pegue uma placa de cultura de tecido de seis poços e organize uma inserção de membrana de cultura por poço. Desenhe alguns meios em uma pipeta de 200 microlitros e, em seguida, aspirar o explante de papila basilar dissecado com um tampão X HBSS.Transfira o explante para uma membrana e oriente-o de modo que a papila basilar fique voltada para cima e as células ciliadas e de suporte sejam visíveis a partir do topo. Uma vez posicionado o explante, aspirar o tampão HBSS lentamente da superfície da membrana de cultura. Neste processo, o explante se ligará à membrana de cultura.Encha o poço da placa de seis poços adicionando 1,2 mililitros de meio de águia modificado do dulbecco, ou meio de cultura DMEM, entre a inserção da membrana e a parede do poço. Para preparar a cultura de colágeno do ducto coclear, adicione três gotas de mistura de colágeno recém-preparada em cada poço de uma placa de quatro poços e transfira o ducto coclear dissecado para cada gota de colágeno. Incube a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para curar a matriz de colágeno.Para um tratamento de pequenas moléculas das culturas, substitua o meio de cultura por 700 microlitros de meio suplementado com o modulador farmacológico, como a penicilina, e incube as placas como demonstrado anteriormente. Substitua 50% dos meios de cultura todos os dias. Após o tempo de incubação apropriado, remova o meio de cultura e use os explantes para ensaios a jusante.Na configuração da eletroporação, o posicionamento correto do eletrodo resultou em maior expressão de GFP na orelha interna em ambos os órgãos vestibulares, e a papila basilar auditiva confirmou a transfecção. CRISPR Cas9 mediado knockout do gene Atoh1 no ouvido interno, resultando em perda de células ciliadas. O knockout do gene Atoh1 através de uma ovo-eletroporação seguida de incubação até E10 mostrou desenvolvimento reduzido de células ciliadas em comparação com o controle plasmídico vazio.Embora a eletroporação seja mosaico, as células eletroporadas de controle foram capazes de formar células ciliadas. Em amostras eletroporadas de gRNA Atoh1, células fluorescentes verdes positivas para proteínas nunca mostraram os marcadores de desenvolvimento de células ciliadas. A cultura de órgãos da papila basilar em matriz 3D, como colágeno e coloração com anticorpos contra antígeno de células ciliadas proporcionou a excelente preservação da morfologia tecidual por até cinco dias.A organização das células ciliadas e das células de suporte foi mantida nessas condições de cultura. As culturas de órgãos em uma membrana podem ser mantidas por até cinco dias, mantendo a integridade do feixe capilar. Isso pode ser visto na imagem representativa pela localização da proteína de ligação da ponta, a protocaderina 15.Para investigar o desenvolvimento do feixe de cabelo, imagens de maior resolução, como microscopia de super resolução ou microscopia eletrônica de varredura, podem fornecer mais informações. Condições estéreis devem ser mantidas durante todo o procedimento. Durante a eletroporação, certifique-se de que os embriões não sequem.Ao titular inibidores farmacológicos, pode-se reduzir a concentração para superar qualquer letalidade. Tanto embriões quanto explantes podem ser levados para experimentos de imagem. Seja realizando microscoping de vídeo em tempo real ou microscoping eletrônico confocal de luz estática, conforme mostrado no protocolo.Dada a facilidade e acessibilidade do uso de explantes de orelha interna de pintinhos, podemos usar o meio através de triagem de prova para identificar novas moléculas essenciais para a regeneração das células ciliadas.

in-ovo-and-ex-ovo-methods-to-study-avian-inner-ear-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste artigo, apresentamos uma metodologia simples para ativar a longo...

Um Ex-ovo Sistema de Cultura de embriões de frango Indicado para aplicações de imagem e Microcirurgia

Para avaliar a função e regulação de genes durante o desenvolvimento de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, nós descrevemos um método que...

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

A expressão ectópica é uma técnica para elucidar o papel microRNAs no desenvolvimento do cérebro. No entanto, em áreas específicas usando a eletroporação in ovo é um desafio. Aqui, vamos mostrar uma maneira eficiente para regiões do mesencéfalo ventral e dorsal seletiva electroporate.

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Aqui descrevemos uma técnica de microdissecção seguido de injeção de corante fluorescente no gânglio acústico de embriões de galinha cedo para rastreamento seletivo das fibras auditivas axônios no nervo e rombencéfalo.

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

Visualizar e acessar o embrião de galinha durante o desenvolvimento pode ser um desafio. Desenvolvemos um método ex ovo que é simples, econômico e pode ser facilmente usado em sala de aula ou ambiente de pesquisa. Este método fornece acesso ao embrião em estágios finais do desenvolvimento embrionário (HH 40).

Otimizado Ex-ovo A cultura de Chick embriões para estágio avançado de desenvolvimento

O órgão auditivo medeia a audição. Aqui apresentamos um método de micro-eletroporação in ovo modificado otimizado para estudar a proliferação e diferenciação de células progenitoras auditivas no órgão auditivo de galinhas em desenvolvimento.

A transferência de genes para o frango auditivo órgão por<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-eletroporação

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Aqui, apresentamos um organotypic cultivo protocolo para crescer órgãos embrionárias de galinha in vitro. Usando esse método, o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha pode ser estudado, mantendo um alto grau de controle sobre o ambiente de cultura.

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de fatias de tronco cerebral auditiva não coronal do embrião de frango para a investigação de propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento dentro de uma fatia de tronco cerebral. Essas fatias incluem seções sagita, horizontal e horizontal/transversal que abrangem regiões tonotópicas maiores dentro de um plano de fatia individual que as seções coronais tradicionais.

Fatiando o tronco auditivo de frango embrionário para avaliar gradientes tonotópicos e microcircuitos

Usamos técnicas padrão de resposta ao tronco cerebral (ABR) e aplicamos-as a galinhas filhotes, um modelo aviário precoce para função auditiva. O protocolo descreve detalhadamente as técnicas de preparação animal e aquisição da ABR, com etapas que podem se traduzir em outros modelos aviários ou roedores.

Avaliação da Resposta Auditiva do Brainstem em Filhotes de Frango

Este protocolo, destinado a usuários iniciantes de tecido do ouvido interno de camundongos, detalha de forma abrangente as etapas para o processamento de ouvidos internos de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento para imunocoloração de seção.

Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

Aprenda métodos in ovo e ex ovo para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário usando embriões de galinha. Este protocolo detalha técnicas de eletroporação e cultura de explantes para investigar regeneração de células ciliadas e avaliar efeitos ototóxicos de fármacos.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

Explorar mais vídeos