Name: Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Aprenda a detectar senescência induzida por quimioterapia em células tumorais usando citometria de fluxo multiparamétrica com dois marcadores. Este método rápido permite enriquecer populações senescentes para análises posteriores.

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Agradecemos ao Cytometry and Antibody Core Facility da Universidade de Chicago pelo apoio na instrumentação da citometria de fluxo. O Centro de Pesquisa Animal da Universidade de Chicago forneceu alojamento para animais.

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<li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li>
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<li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16%28INK4a%29-luciferase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar para este estudo.

Na última década, a citometria de fluxo tornou-se uma plataforma de ensaio mais comum na pesquisa do câncer devido à popularidade emergente da imunologia tumoral, ao desenvolvimento de citômetros de fluxo de baixo custo e à melhoria das instalações de instrumentação compartilhadas em instituições acadêmicas. Ensaios multicoloridos são agora padrão, já que a maioria dos instrumentos mais recentes são equipados com matrizes ópticas violeta, azul-verde e vermelho a vermelho-distante. Assim, é provável que este protocolo DDA...

As células senescentes normalmente se acumulam em organismos ao longo de anos durante o envelhecimento biológico normal, mas também podem se desenvolver rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer, incluindo radiação e quimioterapia. Embora não proliferem mais, as células tumorais senescentes induzidas pela terapia (TIS) podem contribuir para a resistência ao tratamento e impulsionar a recorrência 1,2,3. Fatores secretados pelas células TIS podem exacerbar a malignidade tumoral, promovendo evasão imune ou metástase 4,5. As células TIS desenvolvem fenótipos complexos e específicos do contexto, perfis metabólicos alterados e respostas imunes únicas 6,7,8. Portanto, a identificação e caracterização de células tumorais TIS induzidas por várias abordagens de tratamento do câncer é um tópico de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer.
Para detectar células tumorais TIS, ensaios de senescência convencionais são amplamente utilizados, principalmente baseados na detecção de aumento da atividade da enzima marcadora de senescência, a beta-galactosidase lisossômica GLB19. A detecção em um pH lisossômico quase neutro (em vez de ácido) permite a detecção específica de beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal)10. Um ensaio padrão SA-β-Gal que tem sido usado por várias décadas usa X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), um substrato cromogênico azul beta-galactosidase, para detectar SA-β-Gal em células fixas por microscopia de luz11. O ensaio X-Gal permite a confirmação visual qualitativa do TIS utilizando reagentes comumente disponíveis e equipamentos de laboratório. Um microscópio básico de luz transmitida é a única instrumentação necessária para avaliar a presença do cromogênio azul. No entanto, o procedimento de coloração X-Gal pode não ter sensibilidade, às vezes exigindo mais de 24 horas para que a cor se desenvolva. A coloração é seguida por uma pontuação subjetiva de baixo rendimento de células senescentes individuais com base na contagem das células que exibem algum nível de intensidade do cromogênio azul sob um microscópio de luz. Como o X-Gal é impermeável a células, este ensaio requer células fixas com solvente, que não podem ser recuperadas para análise a jusante. Ao trabalhar com amostras limitadas de animais ou pacientes, isso pode ser uma grande desvantagem.
Ensaios melhorados de SA-β-Gal utilizando substratos enzimáticos fluorescentes e permeantes a células, incluindo C 12-FDG (5-dodecanoilaminofluoresceína Di-β-D-Galactopyranoside, verde) e DDAOG (9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona-7-il) β-D-Galactopyranoside, far-red) já apareceram na literatura12,13,14,15. A estrutura da sonda química e as características ópticas do DDAOG são mostradas na Figura Suplementar S1. Essas sondas perfeitas por células permitem a análise de células vivas (em vez de fixas), e as sondas fluorescentes, em vez de cromogênicas, facilitam o uso de plataformas de análise fluorescente rápidas de alto rendimento, incluindo instrumentos de triagem de alto conteúdo e citômetros de fluxo. Os citômetros de fluxo de triagem permitem a recuperação de populações enriquecidas de células senescentes vivas de culturas celulares ou tumores para análise a jusante (por exemplo, western blotting, ELISA ou 'omics'). A análise de fluorescência também fornece um sinal quantitativo, permitindo uma determinação mais precisa da porcentagem de células senescentes dentro de uma determinada amostra. Sondas fluorescentes adicionais, incluindo sondas de viabilidade e anticorpos marcados com fluoróforos, podem ser prontamente adicionadas para análise multiplexada de alvos além de SA-β-Gal.
Semelhante ao DDAOG, o C12-FDG é uma sonda fluorescente para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à FA celular intrínseca, que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina nas células16. Utilizando a sonda DDAOG vermelho-distante, a FA celular verde pode ser utilizada como parâmetro secundário para confirmar a senescência17. Isso melhora a confiabilidade do ensaio com o uso de um segundo marcador, além do SA-β-Gal, que muitas vezes pode não ser confiável como um único marcador de senescência18. Como a detecção de FA endógena em células senescentes é uma abordagem livre de rótulos, é uma maneira rápida e simples de expandir a especificidade do nosso ensaio baseado em DDAOG.
Neste protocolo, demonstramos o uso de DDAOG e FA como um ensaio rápido de citometria de fluxo de dois parâmetros para a identificação de células tumorais TIS viáveis de culturas in vitro ou isoladas de tumores tratados com drogas estabelecidos em camundongos (Figura 1). O protocolo utiliza fluoróforos compatíveis com uma ampla gama de analisadores e classificadores de citometria de fluxo comercial padrão (Tabela 1). A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis usando a análise de citometria de fluxo padrão é habilitada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser realizada para avaliar antígenos de superfície celular de interesse concomitantemente com a senescência. As células senescentes identificadas também podem ser enriquecidas usando a metodologia padrão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. Um esquema que resume os pontos-chave do ensaio DDAOG. (A) Uma droga indutora de TIS é adicionada a células cultivadas de mamíferos ou administrada a camundongos portadores de tumores. O tempo é então permitido para o início do TIS: para as células, 4 dias após o tratamento; para camundongos, 22 dias no total, com três tratamentos a cada 5 dias mais 7 dias de recuperação. As células são colhidas ou os tumores são dissociados em suspensão. (B) As amostras são tratadas com Baf para ajustar o pH lisossômico para detecção de SA-β-Gal por 30 min; em seguida, a sonda DDAOG é adicionada por 60 min para detectar SA-β-Gal. As amostras são lavadas 2x em PBS, e uma mancha de viabilidade é brevemente adicionada (15 min). Opcionalmente, as amostras podem ser coradas com anticorpos fluorescentes em canais de fluorescência abertos e/ou fixadas para análise posterior. (C) As amostras são analisadas usando um citômetro de fluxo padrão. Células viáveis são visualizadas em gráficos de pontos mostrando DDAOG vermelho (indicando SA-β-Gal) versus autofluorescência verde (lipofuscina). Uma porta para determinar a porcentagem de células TIS é estabelecida com base em amostras de controle não tratadas (não mostradas). Se um citômetro de classificação (FACS) for usado, as células TIS podem ser coletadas e colocadas de volta em cultura para ensaios in vitro adicionais ou lisadas e processadas para ensaios de biologia molecular. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = senescência induzida pela terapia; FL-Ab = anticorpo conjugado com fluoróforo; Baf = Bafilomicina A1; SA-β-Gal = beta-galactosidase associada à senescência; PBS = solução salina tamponada com fosfato; FACS = classificação celular ativada por fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fluoróforo</td>
			<td>Detecta</td>
			<td>Ex/Em (nm)</td>
			<td>Citômetro a laser (nm)</td>
			<td>Detector de citômetro / filtro passa-banda (nm)</td>
		</tr><tr><td>DDAOG</td>
			<td>SA-β-Gal</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>AF</td>
			<td>Lipofuscina</td>
			<td>&lt; 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>Viabilidade</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>PE</td>
			<td>Anticorpo/marcador de superfície</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Fluoróforos e especificações ópticas do citômetro. As especificações do citômetro utilizadas neste protocolo são listadas para um instrumento com um total de 4 lasers e 15 detectores de emissão. DDAOG detectado a 645/660 nm é a forma da sonda clivada por SA-β-Gal1. O Uncleaved DDAOG pode apresentar fluorescência de baixo nível a 460/610 nm, mas é removido por etapas de lavagem no protocolo. Abreviaturas: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-ona); DDAOG = DDAO-Galactoside; FA = autofluorescência; EP = ficoeritrina; SA-β-Gal = beta-galactosidase associada à senescência.

<table><tbody><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Research Products International</td><td>B40500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de bleomicina&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>13877</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>US Biological</td><td>A1380</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Violet 450 AM corante de viabilidade</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0854-39</td><td>eBioscience</td></tr><tr><td>DPP4 anticorpo, conjugado PE</td><td>Biolegend</td><td>137803</td><td>Clone H194-112</td></tr><tr><td>Linha celular: A549 adenocarcinoma de pulmão humano</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Linha celular: B16-F10 melanoma de camundongo</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células, 100 &micro; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>DDAO-Galactoside</td><td>Life Technologies</td><td>D6488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM meio 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Doxorrubicina, injeção de cloridrato (USP)</td> <td>Pfizer</td><td>NDC 0069-3032-20</td><td></td></tr><tr><td>Doxorrubicina, PEGilado lipossomal (USP)</td><td>Sun Pharmaceutical</td><td>NDC 47335-049-40</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etoposídeo&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>12092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega&nbsp;</td><td>Reagente bloqueador do receptor FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Fc</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>Anti-mouse CD16/32</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo (analisador de células)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Vários</td><td>LSRFortessa</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo (classificador de células)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Vários</td><td>FACSAria</td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Lonza</td><td>BW17737</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Sigma</td><td>5401020001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16%</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td>PBS de Dulbecco (sem cálcio e magnésio)</td></tr><tr><td>Partículas de calibração de arco-íris, kit ultra</td><td>SpheroTech</td><td>UCRP-38-2K</td><td>3.5-3.9 &micro; m, 2E6/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640 meio 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio 0,9% (USP)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Software para aquisição de dados de citômetros, "FACSDiva"</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>n/a</td><td>Entre em contato com a BD para obter licença</td></tr><tr><td>Software para análise de dados de citômetros, "FlowJo"</td><td>TreeStar</td><td>n/a</td><td>Entre em contato com a TreeStar para obter a licença</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-114</td><td></td></tr></tbody></table>

sonda de β-galactosidase associada à senescência fluorescente vermelha distante para identificação e enriquecimento de células tumorais senescentes por citometria de fluxo

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

A senescência celular é um estado de parada proliferativa induzido por danos biológicos que normalmente se acumula ao longo de anos em células envelhecidas, mas também pode surgir rapidamente em células tumorais como resposta a danos induzidos por vários tratamentos contra o câncer. A senescência das células tumorais é geralmente considerada indesejável, pois as células senescentes tornam-se resistentes à morte e bloqueiam a remissão do tumor, exacerbando a malignidade do tumor e a resistência ao tratamento. Portanto, a identificação de células tumorais senescentes é de interesse contínuo para a comunidade de pesquisa do câncer. Existem vários ensaios de senescência, muitos baseados na atividade do conhecido marcador de senescência, a beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal). 
Normalmente, o ensaio SA-β-Gal é realizado usando um substrato cromogênico (X-Gal) em células fixas, com a enumeração lenta e subjetiva de células senescentes "azuis" por microscopia de luz. Ensaios aprimorados usando substratos SA-β-Gal fluorescentes e permeantes a células, incluindo C12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; vermelho-distante), permitiram a análise de células vivas e permitiram o uso de plataformas de análise fluorescente de alto rendimento, incluindo citômetros de fluxo. C12-FDG é uma sonda bem documentada para SA-β-Gal, mas sua emissão fluorescente verde se sobrepõe à autofluorescência celular intrínseca (FA) que surge durante a senescência devido ao acúmulo de agregados de lipofuscina. Ao utilizar a sonda SA-β-Gal DDAOG de vermelho distante, a autofluorescência celular verde pode ser usada como um parâmetro secundário para confirmar a senescência, adicionando confiabilidade ao ensaio. Os canais de fluorescência restantes podem ser usados para coloração de viabilidade celular ou imunomarcação fluorescente opcional.
Usando citometria de fluxo, demonstramos o uso de DDAOG e autofluorescência de lipofuscina como um ensaio de duplo parâmetro para a identificação de células tumorais senescentes. A quantificação da porcentagem de células senescentes viáveis é realizada. Se desejado, uma etapa opcional de imunomarcação pode ser incluída para avaliar antígenos de superfície celular de interesse. As células senescentes identificadas também podem ser classificadas citometricamente e coletadas para análise a jusante. As células senescentes coletadas podem ser imediatamente lisadas (por exemplo, para imunoensaios ou análise ômica) ou cultivadas posteriormente.

Vários experimentos foram realizados para demonstrar a comparabilidade do DDAOG com X-Gal e C12-FDG para a detecção de senescência por SA-β-Gal. Primeiramente, o X-Gal foi utilizado para corar células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por ETO (Figura 2A). Uma cor azul intensa se desenvolveu em um subconjunto de células tratadas com ETO, enquanto outras células exibiram coloração azul menos intensa. A morfologia foi aumentada na maioria das células tratadas com ETO. A color...

Um protocolo para quantificação citométrica de fluxo fluorescente de células cancerígenas senescentes induzidas por drogas quimioterápicas em cultura de células ou em modelos de tumores murinos é apresentado. Os procedimentos opcionais incluem co-imunocoloração, fixação de amostras para facilitar a análise de grandes lotes ou pontos de tempo e o enriquecimento de células senescentes viáveis por classificação citométrica de fluxo.

Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Nosso protocolo de citometria de fluxo multiparâmetro permite a detecção rápida e aprimorada da senescência induzida pela terapia em células tumorais, que é uma condição de estudo em andamento na biologia e terapia do câncer. Nosso ensaio de senescência por citometria de fluxo é mais rápido do que os ensaios baseados em microscopia existentes. Usamos dois marcadores, em vez de apenas um, para identificar células senescentes, melhorando a confiabilidade do ensaio.As células podem ser co-coradas com anticorpos fluorescentes para detectar alvos adicionais de interesse. A classificação por citometria de fluxo pode ser usada para enriquecer populações de células senescentes para análise a jusante. O ensaio pode detectar células senescentes em linhagens de células cancerígenas cultivadas ou em amostras tumorais inteiras após dissociação suave.Antes de tentar esta técnica, é importante estar familiarizado com os procedimentos operacionais gerais do citômetro de fluxo que está sendo usado. Consulte o texto para obter as especificações recomendadas do citômetro de fluxo. Um dia antes da indução da senescência por drogas, colha a cultura da linhagem celular cancerígena com EDTA de tripsina a 0,25%.Coloque as células a 37 graus Celsius por cinco minutos para ativar a tripsina e desprenda a monocamada celular. Quando a monocamada tiver se desprendido visivelmente, neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura completo. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico estéril.Conte as células usando o método padrão do hemocitômetro e registre as células por mililitro. Células de placa em uma vez 10 a terceira a 10 vezes 10 a terceira células por centímetro quadrado em uma placa de cultura plástica padrão de seis poços. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade.No dia seguinte, trate as células com o agente indutor de senescência de interesse, como o etoposídeo. Em seguida, incube por quatro dias para permitir o início da senescência. Examine as células diariamente sob um microscópio de luz para mudanças morfológicas esperadas.Após o início da senescência, colha as células adicionando tripsina EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem dissociadas em suspensão, neutralize a tripsina com um volume igual de meio completo. Transfira cada poço de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.Conte as células novamente e alíquota um número igual de células por amostra em um novo conjunto de tubos. Centrifugar os tubos durante cinco minutos a 1 000 g a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante. Primeiro, ajuste o pH lisossômico de amostras de células cultivadas adicionando uma solução de uma bafilomicina A micromolar em DMEM ao pellet celular em uma concentração de uma vez 10 para a sexta célula por mililitro, e pipeta para misturar.Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius em um rotador a uma velocidade lenta. Em seguida, para corar a beta-galactosidase associada à senescência, adicione a solução-mãe de DDAOG a 10 microgramas por mililitro às amostras sem lavar. Coloque em um rotador por 60 minutos protegido da luz direta.Como antes, centrifugar os tubos, remover o sobrenadante e lavar o pellet com um mililitro de 0,5% BSA gelado em PBS. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução diluída de Calcein Violet 450 AM aos pellets de células lavadas. Incube por 15 minutos no gelo no escuro.Transfira as amostras de células para tubos compatíveis com instrumentos de citometria de fluxo. No software de aquisição de dados, abra um histograma de canal violeta e um gráfico de pontos de canal vermelho distante versus canal verde. Inicie a aquisição de dados do citômetro a uma baixa velocidade de ingestão e coloque as amostras de controle positivas coradas com DDAOG na porta de admissão.Comece a adquirir dados de exemplo. Ajuste as tensões do canal de modo que mais de 90% dos eventos estejam contidos em cada gráfico. Quando todas as configurações estiverem ótimas, registre 10.000 eventos por amostra.Coloque as amostras de controlo apenas para veículos coradas com DDAOG na porta de admissão. Inicie a aquisição de dados e registre 10.000 eventos por amostra. Procure um aumento na autofluorescência, ou FA, e sinal DDAO-galactosídeo versus controle positivo.Salve os dados de amostra no formato de arquivo fcs e exporte os arquivos para um computador de estação de trabalho equipado com software de análise de citometria de fluxo. Usando o software de análise de dados de citometria, carregue os arquivos de dados fcs para todas as amostras adquiridas. Primeiro, para deter células viáveis, clique duas vezes nos dados da amostra para que o controle somente do veículo abra sua janela de dados.Visualize os dados como um histograma de canal violeta. As células viáveis coradas, coradas por CV 450, são baseadas em sua fluorescência mais brilhante do que as células mortas. Desenhe uma porta usando a ferramenta Histograma de porta única para incluir apenas células viáveis.Nomeie o portão Viável. Em seguida, arraste a porta Viável para as outras amostras de célula da janela de layout da amostra para aplicar a porta uniformemente. Abra a janela Layout.Na janela Layout, visualize todas as amostras como histogramas de canal violeta. Verifique se o controle celular viável é apropriado em todas as amostras. Caso contrário, ajuste conforme necessário.Em seguida, para portar as células senescentes, clique duas vezes nos dados da célula viável fechada para que o controle somente do veículo abra sua janela de dados. Em seguida, visualize os dados como um gráfico de pontos para o canal vermelho distante versus canal verde. Desenhe uma porta usando a ferramenta Retângulo Gating para incluir menos de 5% das células DDAO-positivas e AF-positivas do quadrante superior direito.Nomeie o portão como Senescente. Em seguida, arraste a porta Senescente para o subconjunto viável de todas as amostras da janela Layout da amostra para aplicar a porta uniformemente. Na janela Layout, arraste e solte todos os subconjuntos dependentes de células viáveis.Visualize todas as amostras viáveis como gráficos de pontos de canal vermelho-escuro versus verde e observe os resultados. Certifique-se de que o portão senescente é visível em todas as parcelas e que o portão para os controles somente de veículo exibe menos de 5% de células senescentes. A análise está agora concluída.Os dados agora podem ser exportados conforme desejado em formato gráfico e de tabela. Em comparação com as células não tratadas, as células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por etoposídeo exibiram morfologia aumentada e coloração azul devido à clivagem de X-gal por beta-galactosidase associada à senescência elevada. A coloração de células tratadas com etoposídeo com C12FDG fluorescente, ou DDAOG, demonstrou padrões de coloração e variações de intensidade comparáveis ao X-gal.No entanto, a autofluorescência celular sobreposta com a emissão verde de C12FDG mostrou acumular-se em células senescentes não coradas. Em contraste, a autofluorescência foi tipicamente insignificante na faixa de emissão de vermelho distante do DDAOG. Configuração de aquisição de dados de citômetro de fluxo para gráficos de dispersão, microesferas comerciais de calibração fluorescente arco-íris de cinco picos e dados de fluorescência de canal único de células coradas são mostrados aqui.Os dados do ensaio de senescência do citômetro de fluxo DDAOG para células de melanoma B16-F10 mostraram que a Senescência Induzida por Terapia, ou TIS, induzida por etoposídeo ocorreu em 35% das células viáveis, e o agente senolítico ABT-263 quase eliminou as células TIS. Nas células de câncer de pulmão A549, o TIS induzido por bleomicina em 66% das células viáveis e o ABT-263 reduziram a porcentagem para 15. O ABT-263 sozinho não foi tóxico para as células proliferantes não tratadas.Em um ensaio de cocoloração de anticorpos, um histograma de dados do canal de EP mostrou que 42% das células tratadas com etoposídeo foram positivas para o marcador de senescência DPPP4-positivo. Além disso, a visualização com gráficos de pontos bidimensionais indicou que 44% das células tratadas com etoposídeo foram duplamente positivas para DDAOG e DPP4 versus 4% das células somente para veículos. A fixação de células coradas com DDAOG foi avaliada em seguida.Em comparação com amostras de controle não fixas, as amostras fixas exibiram um fundo ligeiramente maior em células não tratadas, com uma porcentagem maior de células pontuando como senescentes em células tratadas com BLM. Este efeito também foi observado em amostras fixas armazenadas durante a noite e por uma semana a quatro graus Celsius. A classificação por citometria de fluxo e a validação de populações de células senescentes enriquecidas por morfologia e marcadores de proliferação são mostradas.As células senescentes classificadas apresentaram morfologia aumentada, como esperado, visualizada pela coloração da actina com faloidina fluorescente. Uma redução no sinal para o marcador de proliferação Ki67 também foi observada pela coloração imunofluorescente. Por fim, avaliou-se a quantificação da senescência em tumores tratados com quimioterápicos.A coloração X-gal nos tecidos foi relativamente fraca, mas a coloração azul foi evidente em tumores tratados com doxorrubicina ou doxorrubicina lipossômica peguila, particularmente em tumores que também pontuaram positivo para senescência pelo ensaio de fluxo DDAO-galactosídeo. Como esperado, os tumores somente salinos exibiram senescência insignificante. Aqui, como em qualquer ensaio de células vivas, as etapas do protocolo devem ser executadas de forma eficiente, mas suave.Procedimentos prolongados de coloração ou incubações além dos tempos mencionados devem ser evitados. Se as células senescentes forem classificadas citometricamente em fluxo, elas podem ser colocadas de volta à cultura para imunoensaios, ou lisadas, e processadas para análise ômica, incluindo transcriptômica ou proteômica. Esta técnica permitiu que nosso laboratório e outros identificassem novas características de células tumorais senescentes, incluindo quantificação de danos ao DNA, expressão de proteínas e mudanças no metabolismo.

far-red-fluorescent-senescence-associated-galactosidase-probe-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo ilustra um ensaio baseado em citometria de fluxo para quantificar células cancerígenas senescentes induzidas por terapia com marcadores de senescência duplos. A detecção e quantificação de células senescentes envolvem o uso de um substrato de β-galactosidase. O substrato é clivado por β-galactosidase lisossômica ativa dentro das células senescentes, produzindo um produto fluorescente que, em conjunto com grânulos de lipofuscina autofluorescentes, marca as células cancerígenas...

Quantificação baseada em citometria de fluxo de células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.

Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

ROS intracelular foi mostrado para jogar um papel importante na indução da senescência celular. Aqui, descrevemos um ensaio sensível para quantificação dos níveis ROS durante a senescência celular. Nós também fornecemos protocolos para avaliar o fenótipo secretor associada a senescência, que alegadamente contribui para várias desordens relacionadas com a idade.

Uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo Oncogene

A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Este protocolo apresenta microscopia confocal com luz refletida para a detecção objetiva, por célula única, da atividade beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) na fração vascular estromal isolada do tecido adiposo humano. O método é compatível com imunocitoquímica, incorpora controles de pH para avaliação quantitativa e, adicionalmente, oferece uma alternativa mais sensível e menos subjetiva à coloração convencional de SA-β-gal.

Detecção de Senescência usando luz refletida na fração vascular estromal adiposa

Este artigo apresenta um protocolo LysoTracker de células vivas para medir a remodelação lisossômica durante a senescência em fibroblastos humanos IMR-90.

Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Um protocolo de triagem eficiente é apresentado para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de Ralevic em células-tronco glioblastoma (GSCs). O ensaio baseia-se em um repórter de diferenciação de células-tronco no qual a expressão da GFP reforçada (eGFP) é conduzida pelo promotor GFAP humano.

Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Aprenda a detectar senescência induzida por quimioterapia em células tumorais usando citometria de fluxo multiparamétrica com dois marcadores. Este método rápido permite enriquecer populações senescentes para análises posteriores.

Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo

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