Name: Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a monitorar metilação de citosina em embriões intactos de peixe-zebra usando Danio rerio. Este método rápido e eficiente permite detectar alterações epigenéticas causadas por exposição química em diferentes estágios de desenvolvimento.

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O apoio à pesquisa foi fornecido por uma bolsa da Divisão de Pós-Graduação da UCR para a SAB, uma bolsa do Programa de Treinamento NRSA T32 (T32ES018827) para a SAB e uma bolsa do National Institutes of Health (R01ES027576) e o USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) para a DCV.

Os criadores adultos foram manuseados e tratados de acordo com um protocolo de uso animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (#20180063) na Universidade da Califórnia, Riverside.
1. Recolha de embriões de peixe-zebra e exposição química
<ol><li>Adicione armadilhas de reprodução no tanque a tanques contendo peixes-zebra machos e fêmeas adultos sexualmente maduros e reprodutivamente viáveis. Adicionar pelo menos três armadilhas por tanque de 6 L pelo menos 12 h antes da coleta às ~9:00 da manhã, que é o tempo aproximado de fertilização e desova dos ovos dentro dos tanques.</li>
	<li>Prepare uma solução de exposição fresca na manhã da coleta. A solução de exposição é preparada utilizando uma pipeta de 5 ml e adicionando 5,0 ml de água do sistema isenta de partículas a uma placa de Petri de vidro de 60 mm.</li>
	<li>Em seguida, use uma pipeta microcapilar de vidro de 10 μL para transferir 10 μL de veículo (sulfóxido de dimetilo ou DMSO) ou solução de estoque químico para o sistema de água no prato de vidro.</li>
	<li>Gire a placa de Petri de vidro para garantir que a solução de estoque se dissipe. Adicione mais 5,0 mL de água do sistema à placa de Petri de vidro. Gire a placa de Petri de vidro para homogeneizar a solução de exposição.</li>
	<li>Repetir para cada grupo de tratamento em repetições de quatro para produzir quatro repetições por tratamento.</li>
	<li>Após a preparação das soluções de exposição, tampe os pratos de vidro com tampas de vidro para minimizar a evaporação.</li>
	<li>Ao remover as armadilhas de reprodução de cada tanque, permita cuidadosamente que a água dentro de cada armadilha escorra para o tanque antes de remover dos tanques. Certifique-se de que as armadilhas permaneçam do lado direito para cima.</li>
	<li>Transfira as armadilhas de reprodução para a pia do laboratório e enxágue-as usando uma garrafa de esguicho cheia de água de osmose reversa (RO) em uma rede de peixe previamente embebida em 10% de água sanitária e enxaguada com água. Lave os embriões até que todos os detritos sejam limpos e apenas embriões limpos permaneçam.</li>
	<li>Transfira os embriões da rede de peixe usando uma garrafa de esguicho cheia de água RO para uma placa de Petri de plástico de 100 mm. Classificar aleatoriamente 50 embriões vivos às 0,75 h pós-fertilização (hpf) e remover o excesso de água RO.</li>
	<li>Usando uma microespátula, coloque embriões classificados na solução de tratamento. Todos os embriões devem estar dentro do veículo ou da solução de tratamento não antes das 9:45 da manhã. Gire os pratos de vidro para garantir que os embriões sejam uniformemente revestidos dentro da solução de tratamento.</li>
	<li>Depois de quatro placas replicadas (N = 50 por replicação) terem sido configuradas para cada grupo de tratamento, coloque a tampa de vidro em cima das placas de exposição e transfira todas as placas para uma incubadora com temperatura controlada a 28 °C até 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf ou 10 hpf.</li>
	<li>Preparar o paraformaldeído fresco a 4% (PFA) pelo menos 4 h antes do termo da exposição e conservar a 4 °C.<ol><li>Ligue a placa de aquecimento a 115 °C, faça 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x (2 mL de 10x PBS + 18 mL de água RO) em um tubo de centrífuga de 50 mL e pese 800 mg de paraformaldeído.</li>
		<li>Dentro de um exaustor químico, transfira 1x solução de PBS para um balão de Erlenmeyer de 250 mL, adicione 800 mg de paraformaldeído e, em seguida, adicione 2 μL de 10 N NaOH. Colocar um termómetro no interior do balão, colocar o balão na chapa quente e observar a temperatura enquanto agita.</li>
		<li>Quando a temperatura atingir 62-65 °Cremova o PFA a 4% da placa quente e deixe-o arrefecer até à temperatura ambiente (RT). Conservar o PFA a 4% a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Uma vez que a duração da exposição tenha terminado, remova os embriões da incubadora e transfira todos os embriões vivos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Aspirar a solução de exposição residual utilizando uma pipeta de 1 ml. Não aspirar embriões.</li>
	<li>Adicione 500 μL de PFA a 4% refrigerado a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e misture os embriões em 4% de PFA invertendo várias vezes. Permita que os embriões se fixem em 4% de PFA durante a noite. NOTA: Não é recomendado permitir que os embriões permaneçam em PFA por mais de 12 h.</li>
</ol>2. Dechorionação de embriões
<ol><li>No dia seguinte, aspirar o PFA a 4%, ressuspender os embriões em 1x PBS e pipetar suavemente para cima e para baixo por 30 s. Se necessário, pare o protocolo nesta etapa e armazene os embriões em 1x PBS a 4 °C por até 48 h.</li>
	<li>Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira cuidadosamente embriões fixos para um prato de vidro cheio de água RO e gire suavemente por 30 s. Repita esta etapa mais uma vez.</li>
	<li>Use agulhas de seringa com ampliação de 5,0x usando um estereomicroscópio padrão para decorionar manualmente todos os embriões. Faça isso usando a ponta da agulha para perfurar o córion e descascá-lo suavemente para longe da gema e da massa celular4.</li>
	<li>Uma vez que os embriões tenham sido decorionados, use uma pipeta microcapilar de vidro para transferir até 25 embriões intactos para uma cesta de imunoquímica (IHC) e coloque a cesta IHC em uma placa de 96 poços. Use uma pipeta de 1 mL para aspirar a água RO de cada poço.</li>
</ol>3. Imuno-histoquímica usando anticorpo específico de 5 mC
<ol><li>Ressuspender os embriões em 500 μL de tampão bloqueador (1x PBST + 2% de soro de ovino + 2 mg/mL de albumina sérica bovina) por poço e envolver a placa com parafilme e folha de alumínio para protegê-los da luz. Incubar a 4 °C durante 4 h num agitador orbital (100 rpm).</li>
	<li>Remova o envoltório de parafilme e o alumínio e use uma pipeta de 1 mL para aspirar o tampão de bloqueio de cada poço. Substitua-o por 500 μL de uma diluição de 1:100 do anticorpo anti-5-mC monoclonal do rato no tampão de bloqueio. Incubar todos os embriões com anticorpos primários, exceto um subconjunto de embriões de controle de veículos que serão incubados com o tampão de bloqueio para explicar o ruído de fundo. Tenha cuidado para não perturbar a integridade dos embriões, nem para aspirar embriões durante esta etapa.</li>
	<li>Reembrulhe a placa em parafilme e folha de alumínio e deixe a placa incubar a 4 °C durante a noite num agitador orbital (100 rpm).</li>
	<li>No dia seguinte, remova a solução de anticorpos primários de cada poço e substitua-a por 1x PBS + Tween-20 a 0,1% (1x PBST). Lave cada poço três vezes com 1x PBST por 15 min por lavagem em um agitador orbital (100 rpm).</li>
	<li>Substitua 1x PBST por uma diluição de 1:500 do anticorpo IgG anti-rato de cabra em tampão de bloqueio e incube todos os embriões com o anticorpo secundário. Deixar a placa incubar a 4 °C durante a noite num agitador orbital (100 rpm).</li>
	<li>No dia seguinte, remova o anticorpo secundário e lave a solução residual três vezes com 1x PBST por 15 min por lavagem em um agitador orbital (100 rpm). NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui por até 48 h se as cestas IHC forem armazenadas em poços limpos preenchidos com 1x PBS.</li>
	<li>Use uma pipeta de 1 mL para aspirar 1x PBST de cada poço e coloque a cesta IHC em uma placa de Petri de vidro cheia de água RO. Sob um estereomicroscópio padrão, classifique aleatoriamente embriões intactos em uma placa de 96 poços, resultando em um embrião por poço.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1 mL, remova toda a água RO de poços individuais e substitua-a por 200 μL de 1x PBS. Centrifugar a placa durante 3 min a 1 x g.</li>
</ol>4. Imagem automatizada de embriões dentro de placas de 96 poços
<ol><li>Fotografe os embriões com uma objetiva de 2x sob luz transmitida e FITC usando um sistema de triagem de alto conteúdo (Tabela de Materiais). NOTA: Uma imagem fluorescente de cada embrião foi capturada automaticamente usando a ampliação acima mencionada e um filtro FITC19.<ol><li>Selecione Foco automático para garantir que o foco da câmera esteja na parte inferior da placa e deslocado pela espessura inferior.</li>
		<li>Selecione um comprimento de onda FITC com uma duração de exposição de 100 ms e defina o foco automático para laser com um deslocamento Z. Observe e confirme a aquisição adequada de imagens em vários poços antes de iniciar a aquisição da placa. NOTA: O instrumento adquire automaticamente imagens de todos os poços selecionados que contenham embriões. Uma placa de 96 poços exigiu aproximadamente 30 minutos para aquisição de imagens e armazenamento de dados. Durante o período de aquisição, a temperatura interna dentro do sistema de imagem foi mantida no TR.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a aquisição da imagem, realize a análise de dados usando o sistema de triagem de alto conteúdo e um procedimento personalizado de análise automatizada de imagens. Selecione cada embrião na placa de 96 poços a ser analisado quanto à área total e intensidade integrada de fluorescência. NOTA: A análise incluiu o fornecimento de imagens que continham sobreposições de pontos de dados da análise.</li>
	<li>Em seguida, tabular os pontos de dados e exportá-los do sistema de triagem de alto conteúdo indo em Medir e selecionando Abrir Log de Dados para uma planilha. As porções de aquisição de placas e análise de dados estão representadas na Figura 1.</li>
</ol>5. Análise dos dados
<ol><li>Carregue a planilha exportada em um programa de computador em que o pacote deployer (dplyr) é usado para classificar, somar dados para cada poço e filtrar por número de poço. O pacote writexl é então usado para exportar os dados somados para uma planilha. O código do programa 5mC é mostrado no arquivo suplementar 1.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li>
<li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078(2022).</li>
<li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179(2021).</li>
<li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).</li>
<li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands%2C+cytosine+methylation%2C+and+the+metabolome+in+driving+tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li>
<li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li>
<li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li>
<li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation-mediated+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li>
<li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li>
<li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li>
<li>Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter parecido influenciar o trabalho relatado neste artigo.

Durante este protocolo, existem algumas etapas que são críticas. Primeiro, ao descorionar embriões, é importante apontar a agulha para longe do tecido do embrião / saco vitelino / massa celular, pois essas porções do embrião em desenvolvimento são muito frágeis e fáceis de perfurar. Em segundo lugar, ao transferir embriões marcados para poços individuais, use uma pipeta de vidro para transferir embriões, pois eles aderirão a uma pipeta de plástico. Em terceiro lugar, ao executar IHC de montagem completa, certifique-se de...

As modificações enzimáticas conduzem à metilação ativa e à desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina 1,2. O fosfato de tris(1,3-dicloro-2-propil) (TDCIPP) é um retardador de chama amplamente utilizado nos Estados Unidos que já demonstrou alterar a trajetória de metilação da citosina após exposição embrionária precoce de 0,75 horas pós-fertilização (hpf) até gastrulação precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Dentro dos vertebrados, o 5-mC e seus derivados modificados são críticos para regular o desenvolvimento embrionário precoce9. A fertilização de um embrião desencadeia a desmetilação do DNA parental, seguida pela degradação do mRNA materno, ativação do genoma zigótico e remetilação do genoma zigótico9. Processos biologicamente relevantes que utilizam metilação de citosina incluem modificação de histonas, recrutamento de maquinário transcricional, metilação de RNA, reprogramação epigenética e determinação da estrutura da cromatina10,11. A metilação da citosina também é conservada entre as espécies de vertebrados, ressaltando a importância de compreender e investigar como a metilação aberrante da citosina pode afetar a trajetória do desenvolvimento de um organismo11. Além disso, o desenvolvimento in utero é sensível à exposição materna e tem o potencial de causar desfechos adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença do adulto e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias12,13,14.
Longos trechos de pares citosina-guanina, ou ilhas CpG, têm sido os focos primários de pesquisadores que visam caracterizar a dinâmica da metilação da citosina em todo o genoma15,16,17. Estratégias baseadas em bissulfito, como sequenciamento de bissulfito de genoma inteiro, sequenciamento de bissulfito de representação reduzida e sequenciamento de amplificador de bissulfito representam o padrão-ouro para interrogar a metilação da citosina na resolução do par de bases. No entanto, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina em estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Além disso, as abordagens baseadas em sequenciamento não fornecem informações sobre localização espacial, o que é crítico para a compreensão de tipos de células e áreas potencialmente afetadas dentro de um embrião em desenvolvimento. Da mesma forma, ensaios globais de metilação do DNA, como análise de restrição dependente de metilação, imunoensaios enzimáticos (ELISAs) de 5-mC e cromatografia líquida-massa (LC-MS) de 5-metil-2'-desoxicitidina (5-mC) dependem de homogeneizados celulares ou teciduais e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a localização e a magnitude da metilação da citosina no espaço e no tempo dentro de espécimes intactos12,18.
Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser amplamente utilizados como modelos fisiologicamente intactos para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos comercialmente disponíveis específicos para 5 mC, o protocolo abaixo descreve uma estratégia econômica para monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica (IHC) de montagem completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística.
Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a monitorar 5-mC dentro de embriões intactos de peixe-zebra. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10-&micro; L pipeta microcapilar de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico de 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x tampão fosfato salino&nbsp;</td><td>Pipeta Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>1-mL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690032</td><td></td></tr><tr><td>frasco Erlenmeyer de 250 mL</td><td>Pipeta Fisher Scientific</td><td>FB501250</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de vidro de 60 mm com tampas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08747A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 cabra conjugada anti-rato IgG anticorpo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Aquecimento&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>Armadilhas de reprodução em tanque</td><td>Habitats Aquáticos</td><td>N/A</td><td>Este produto não está mais disponível após a aquisição de Habitats Aquáticos pela Pentair.&nbsp; Os investigadores podem usar tanques de reprodução fora do sistema padrão disponíveis em vários fornecedores.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Sistema de triagem de alto conteúdo de campo amplo</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>N/A</td><td>Qualquer sistema de triagem de alto conteúdo equipado com luz transmitida e filtro FITC será adequado.</td></tr><tr><td>Cesto de imunoquímica (IHC)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fabricado internamente utilizando tubos de microcentrífuga com parte cónica removida e fundo equipado com malha, dimensionado para placas de 24 ou 48 poços.</td></tr><tr><td>MetaXpress 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>N/A</td><td>Qualquer software capaz de quantificar a área total e a intensidade integrada da fluorescência será adequado.</td></tr><tr><td>Microespátula</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de camundongo anti-5-mC</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio é um software de código aberto e pode ser baixado em https://www.rstudio.com.</td></tr><tr><td>Soro de ovelha</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora com temperatura controlada&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR505755L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

A metilação da citosina é altamente conservada em todas as espécies de vertebrados e, como um dos principais impulsionadores da programação epigenética e do estado de cromatina, desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário inicial. As modificações enzimáticas impulsionam a metilação ativa e a desmetilação da citosina em 5-metilcitosina (5-mC) e subsequente oxidação de 5-mC em 5-hidroximetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carboxilcitosina. A reprogramação epigenética é um período crítico durante o desenvolvimento no útero , e a exposição materna a produtos químicos tem o potencial de reprogramar o epigenoma dentro da prole. Isso pode potencialmente causar resultados adversos, como consequências fenotípicas imediatas, efeitos a longo prazo na suscetibilidade à doença em adultos e efeitos transgeracionais de marcas epigenéticas hereditárias. Embora o sequenciamento baseado em bissulfito permita que os pesquisadores questionem a metilação da citosina na resolução do par de bases, as abordagens baseadas em sequenciamento são proibitivas em termos de custo e, como tal, impedem a capacidade de monitorar a metilação da citosina nos estágios de desenvolvimento, múltiplas concentrações por produto químico e replicar embriões por tratamento. Devido à facilidade de imagens automatizadas in vivo , manipulações genéticas, rápido tempo de desenvolvimento ex utero e criação durante a embriogênese, os embriões de peixe-zebra continuam a ser usados como um modelo fisiologicamente intacto para descobrir vias mediadas por xenobióticos que contribuem para resultados adversos durante o desenvolvimento embrionário inicial. Portanto, usando anticorpos específicos de 5 mC comercialmente disponíveis, descrevemos uma estratégia econômica para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação da citosina em embriões individuais e intactos de peixe-zebra, aproveitando a imuno-histoquímica completa, imagens automatizadas de alto conteúdo e processamento de dados eficiente usando linguagem de programação antes da análise estatística. Para o conhecimento atual, este método é o primeiro a detectar e quantificar com sucesso os níveis de 5 mC in situ dentro de embriões de peixe-zebra durante o desenvolvimento inicial. O método permite a detecção da metilação do DNA dentro da massa celular e também tem a capacidade de detectar a metilação da citosina de mRNAs maternos localizados na gema durante a transição materna-zigótica. No geral, este método será útil para a rápida identificação de produtos químicos que têm o potencial de interromper a metilação da citosina in situ durante a reprogramação epigenética.

O objetivo geral deste protocolo é determinar se um tratamento afeta a abundância relativa de 5 mC, avaliando a área total e a intensidade relativa da fluorescência dentro de embriões de peixe-zebra fixos e marcados. Depois de completar o protocolo, um estereomicroscópio de fluorescência pode ser usado para primeiro determinar se a IHC de montagem completa foi bem-sucedida. Quando embriões marcados são observados sob um filtro FITC ou GFP, um resultado positivo é indicado por um sinal positivo de FITC dentro do embrião, ...

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Este protocolo oferece um método relativamente rápido e econômico, bem como uma aquisição e análise automatizadas, produzindo assim triagem de baixa sensibilidade da 5-metilcitosina, que é um biomarcador epigenético comum. A principal vantagem desta técnica está na flexibilidade que oferece um design experimental que os usuários podem otimizar para o seu modelo e estágio de desenvolvimento. Esta técnica pode ser usada para detectar como a exposição química altera a abundância relativa de 5-metilcitosina dentro de um organismo em desenvolvimento, o que normalmente só poderia ser feito através de métodos caros de alta trpA, como o sequenciamento.Este método é útil para qualquer pesquisa que vise utilizar métodos NCG para entender as alterações epigenéticas da 5-metilcitosina em resposta a estímulos ambientais. Comece por preparar uma solução de exposição fresca na manhã da recolha. Adicione cinco mililitros de água livre de partículas a uma placa de Petri de vidro de 60 milímetros.Em seguida, use uma pipeta de vidro microcapilar micro de 10 microlitros para transferir 10 microlitros de sulfóxido de dimetilo ou solução de estoque químico para a água do sistema. Gire a placa de Petri d

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Somitogenesis é um processo de desenvolvimento rítmico que espacialmente padrões do eixo do corpo de embriões vertebrados. Anteriormente, desenvolvemos linhas de zebrafish transgênicos que usam repórteres fluorescentes para observar os genes cíclicos que impulsionam esse processo. Aqui, a cultura dispersas células destas linhas e imagem suas oscilações ao longo do tempo in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada...

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Uma combinação das técnicas de microscopia com longo comprimento de onda multi fóton fluorescência de excitação de laser ópticas foi implementada para capturar imagens de alta resolução, tridimensional, em tempo real de migração da crista neural em Tg (sox10:EGFP) e Tg (foxd3:GFP) zebrafish embriões.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Este estudo estabelece um método sensível de imagem baseado em imunofluorescência para quantificar a metilação global do DNA em corações embrionários individuais de peixe-zebra. Essa abordagem supera o desafio do material tissular limitado e evita a necessidade de conversão de bissulfito.

Detecção de metilação global do DNA nos corações das larvas de peixe-zebra

Aprenda a monitorar metilação de citosina em embriões intactos de peixe-zebra usando Danio rerio. Este método rápido e eficiente permite detectar alterações epigenéticas causadas por exposição química em diferentes estágios de desenvolvimento.

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