Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

A mosca da fruta oriental é uma espécie de praga altamente invasiva e adaptativa. Métodos eficazes para a pesquisa de genes funcionais poderiam nos ajudar a desenvolver estratégias de manejo de pragas ambientalmente amigáveis. Este método é de alta eficiência e baixo custo.

Nosso protocolo servirá como um guia útil para gerar moscas mutantes para pesquisadores orientais de moscas da fruta. Para começar, prever a estrutura dos genes-alvo de interesse e determinar os limites entre éxons e íntrons através da análise bioinformática do genoma de Bactroceras dorsalis. Use o kit de síntese de gRNA comercialmente disponível para gerar o sgRNA projetado.

Ressuspeite o produto de gRNA em água livre de nuclease. Quantifique a concentração usando um espectrofotômetro UV-visível e armazene a 80 graus Celsius antes do uso. Coloque as pupas de B.dorsalis em uma gaiola de plástico, com uma condição de criação de 55% de umidade relativa, 26,5 graus Celsius e um ciclo de luz / dia 14:10.

Quando os adultos fecharem, forneça uma mistura de açúcar e levedura como alimento, juntamente com água. A maioria dos adultos atinge a maturidade sexual 10 dias após a emergência. Use um suporte de luz com uma luz de 30 a 50 lux para melhorar a fecundidade das fêmeas, melhorando assim a eficiência da coleta de embriões.

Em seguida, coloque uma gaze de 200 malhas na câmara de oviposição, a aproximadamente 1 a 2 milímetros de distância da tampa da câmara. Coloque uma nova câmara de oviposição na gaiola quando a configuração de microinjeção estiver pronta. Colete os embriões a cada 10 minutos usando uma escova fina e úmida e alinhe-os em uma placa de injeção feita por conta própria.

Mergulhe os embriões em óleo de halocarbono durante a injeção para evitar mais dessecação. Preparar a solução de trabalho misturando a proteína Cas9 e o sgRNA correspondente a uma concentração de 300 nanogramas por microlitros de cada. Em seguida, adicione 1 microlitro de vermelho de fenol à mistura para servir como uma maneira conveniente de marcar embriões injetados.

Coloque a mistura preparada no gelo para evitar a degradação do sgRNA. Prepare a agulha de injeção de vidro usando um puxador de micropipeta. Adicione 3 microlitros da mistura na agulha de injeção sem introduzir bolhas de ar.

Em seguida, abra a agulha usando um Microgrinder e conecte-a ao micromanipulador de acordo com o guia do usuário. Defina os parâmetros para o injetor como Pi para 500 hectopascals. Ti a 0,5 segundos e PC a 200 hectopascals.

Coloque o prato com embriões alinhados na mesa objetiva. Em seguida, ajuste a posição da micropipeta sob um microscópio óptico fino, colocando a micropipeta e o embrião no mesmo plano. Insira a ponta da agulha no polo posterior, ou vegetal, do embrião.

Em seguida, pressione o pedal do injetor para entregar as misturas no embrião. O aparecimento de uma ligeira cor avermelhada é devido à adição de vermelho fenol na mistura. Coloque a placa de injeção com os embriões injetados em uma câmara climática artificial.

Após 36 horas, transfira as larvas eclodidas para a dieta larval usando uma escova de ponta fina. Colete as larvas três ou quatro vezes ao dia até que não haja mais larvas eclodindo. Em seguida, coloque as larvas maduras na areia molhada para pupar.

A fase de pupação leva 10 dias. Após a pupação, mova as pupas para uma gaiola de plástico antes do início da eclosão. Depois de isolar o DNA genômico de um pupário fresco ou de uma única perna média de adultos individuais e projetar os primers específicos para amplificar a área-alvo, realizar a reação em cadeia da polimerase, ou PCR, seguindo as condições de ciclagem descritas no manuscrito do texto.

Em seguida, sequencie os produtos de PCR purificados. A detecção de múltiplos picos sobrepostos adjacentes ao local de destino sugere mutagênese bem-sucedida. Para a subclonagem, misture os produtos de PCR purificados com um vetor de extremidade contundente e ligue-os a 25 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, adicione as células trans-T1 e coloque-as no gelo por 30 minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de LB médio e incube a 37 graus Celsius por 1 hora com agitação. Centrifugar e descartar o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet e espalhe-o em uma placa LB. Coloque a placa para incubação durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, selecione colônias bacterianas individuais para sequenciamento para verificar o genótipo dos mutantes.

Neste estudo, o exemplo do sítio alvo do gene selecionado está localizado no terceiro éxon. O local alvo é altamente conservado, e uma única banda foi detectada por eletroforese em gel para o molde de DNA para gRNA sintético e gRNA obtido na transcrição in vitro. A sobrevivência e a mutagênese de B.dorsalis após microinjeções são mostradas aqui.

Após o sequenciamento dos produtos de PCR, 80% dos indivíduos G0 são mutantes em mosaico. Na triagem mutante, o mutante com deleção de 8 pares de bases resultou no término prematuro da tradução de aminoácidos. Inserir a agulha na área posterior ou polo vegetal de um embrião é um passo central, pois isso afeta diretamente a sobrevivência dos ovos.

Esta tecnologia fornece uma referência para o estudo de áreas de funções genéticas em B.Dorsalis Eles podem capturar rapidamente os mutantes que desejam através deste método.