Name: Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a visualizar o metabolismo espacial de interações microbianas durante infecções usando espectrometria de massa por imagem MALDI-IMS. Este método permite analisar co-culturas bacterianas em ágar e tecidos com precisão.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o prêmio GM138660. J.T.S. foi apoiado pela Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship da Universidade da Flórida. J.P.Z. foi apoiado pelos subsídios do NIH K22AI7220 (NIAID) e R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. foi apoiado pelo Cell and Molecular Biology Training Grant da Universidade da Pensilvânia (T32GM07229).

NOTA: Experimentos com animais foram aprovados pelos Comitês de Cuidado e Uso Animal do Hospital Infantil da Filadélfia e da Escola de Medicina Perelman da Universidade da Pensilvânia (protocolos IAC 18-001316 e 806279).
CUIDADO: Clostridium difficile (C. difficile) e Enterococcus faecalis (E. faecalis) são patógenos do BSLII e devem ser manuseados com extrema cautela. Utilize protocolos adequados de descontaminação quando necessário.
1. Crescimento de macrocolônias de cultura bacteriana e preparação para embarque noturno
<ol><li>Preparar as culturas de C. difficile e E. faecalis durante a noite e cultivá-las individualmente a 37 °C em uma câmara anaeróbia (85% de nitrogênio, 10% de hidrogênio, 5% de dióxido de carbono) em caldo de infusão cérebro-coração-suplementado com 0,5% de extrato de levedura e 0,1% de l-cisteína (BHIS). Use ágar a 1,5% para todas as amostras chapeadas.</li>
	<li>Normalizar o meio de cultura bacteriana para densidade óptica a 600 nm (OD600). Placa de 5 μL de cada macrocolônia em placas de ágar BHIS + l-cisteína e crescer anaerobicamente por 7 dias a 37 °C. Para macrocolônias de espécies mistas, misture os meios de cultura bacteriana em uma proporção de 1:1 antes do chapeamento.</li>
	<li>Prepare lâminas de microscópio revestidas com óxido de estanho de índio (ITO) usando um ohmímetro para identificar o lado da lâmina com o revestimento condutor. Use um escriba com ponta de diamante para gravar e rotular o lado revestido de ITO da lâmina do microscópio.</li>
	<li>Excise toda a cultura da placa de crescimento do ágar e, em seguida, monte em uma lâmina de microscópio revestida de ITO, garantindo que as bolhas de ar não fiquem presas entre o ágar e a lâmina. NOTA: O teor de água no meio de ágar deve permitir que a cultura adira naturalmente à superfície da lâmina do microscópio. Um vídeo exemplificando esse processo é fornecido na documentação suplementar de Yang et al.22.</li>
	<li>Coloque as colônias em caixas de lâmina de microscópio para proteção. Armazene as caixas deslizantes em 8 em x 8 em sacos de transporte de amostras de risco biológico com um punhado de pellets dessecantes e vedação para envio noturno para processamento e análise posteriores. NOTA: É importante manter um ambiente seco para as culturas bacterianas quando enviadas em condições ambientais para retardar o crescimento e o metabolismo bacteriano e manter a fixação dos espécimes bacterianos até a análise. Este método de transporte foi otimizado através de extensos experimentos e é preferido sobre o transporte das colônias congeladas em gelo seco. Grandes mudanças de temperatura antes da secagem tendem a causar desmontagem e borbulhamento sob a amostra de ágar montada.</li>
</ol>2. Secagem ambiente de macrocolônias bacterianas de C. difficile + E. faecalis
<ol><li>Remova as colônias bacterianas de agarose montadas em lâminas de microscópio revestidas de ITO do material de embalagem. Coloque as amostras em uma caixa seca com dessecante por 48-72 h à temperatura ambiente. NOTA: Este é um processo de secagem suave e lento que minimiza o borbulhamento, rachaduras ou descolamento do meio de ágar da superfície da lâmina do microscópio.</li>
	<li>Eliminar adequadamente todo o material de embalagem contaminado e descontaminar o espaço de trabalho com um desinfetante bactericida/esporicida adequado.</li>
	<li>Inspecione visualmente as colônias em busca de deformações na superfície do ágar (por exemplo, borbulhamento, rachaduras, desmontagem). NOTA: A altura da superfície de agarose deve diminuir visivelmente e ficar plana sobre o slide.</li>
</ol>3. Secagem a vácuo e mediada pelo calor de macrocolônias bacterianas de C. difficile + E. faecalis
NOTA: Um aparelho de secagem a vácuo personalizado (Figura 1) foi construído para facilitar a remoção do excesso de umidade das amostras de ágar. Este aparelho utiliza uma bomba de vácuo de palhetas rotativas conectada em linha a um biofiltro HEPA, uma armadilha a frio e uma câmara de aço inoxidável, onde as amostras bacterianas são colocadas. Um transformador de tensão variável é conectado a um filamento de fio isolado, o que permite ao usuário aquecer a câmara para agilizar o processo de secagem.
<ol><li>Feche a linha de vácuo para a câmara de amostra e ligue o interruptor de energia para a bomba de palhetas rotativas para permitir que a bomba de vácuo aqueça e atinja a pressão de vácuo adequada.</li>
	<li>Ligue o transformador de tensão variável para aquecer o filamento de fio enrolado em torno da câmara. Ajuste a fonte de alimentação variável até que a temperatura interna da câmara de vácuo atinja ~50 °C. Enquanto a bomba está aquecendo, coloque uma pasta de gelo seco e etanol 100% no condensador da armadilha fria. NOTA: O purgador a frio condensa quaisquer vapores ou esporos da amostra e evita a contaminação do sistema de bomba de palhetas rotativas e do óleo da bomba de vácuo.</li>
	<li>Abra a câmara de vácuo usando uma chave inglesa para soltar as braçadeiras de flange de garra dupla de 16 mm. Insira as amostras de agarose na câmara e sele firmemente a câmara com as braçadeiras de flange de garra dupla de 16 mm.</li>
	<li>Abra a válvula da bomba para evacuar a câmara. Deixe as amostras secarem por 60-120 min (por exemplo, a ~150 mTorr). NOTA: Este tempo de secagem é suficiente para remover a maior parte da umidade em pequenas seções de ágar. A determinação empírica do tempo de secagem ideal para a remoção da umidade e a diminuição da altura do ágar podem ser necessárias, dependendo da configuração individual e das amostras. Tempos de secagem substancialmente mais longos podem fazer com que o ágar seco se torne quebradiço e propenso a rachaduras.</li>
	<li>Quando estiver completo, ventile lentamente a câmara de vácuo à pressão ambiente, fechando a válvula na bomba de palhetas rotativas e abrindo a válvula externa ao ar ambiente. Abra a câmara utilizando o protocolo mencionado anteriormente e retire a amostra de agarose seca da câmara.</li>
	<li>Conservar a amostra numa caixa seca com dessecante até à aplicação da matriz. NOTA: A Figura 2 mostra imagens da superfície do ágar antes e após a secagem.</li>
</ol>4. Aplicação da matriz MALDI via pulverização robótica
NOTA: Depois que as amostras de agarose tiverem sido completamente secas e a altura das seções de cultura tiver diminuído visivelmente, use um pulverizador de matriz robótica para aplicar homogeneamente um revestimento fino de um composto químico de matriz MALDI. Este procedimento deve ser realizado em um exaustor químico e com equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas, óculos de laboratório e um jaleco.
<ol><li>Selecione a matriz MALDI apropriada. Para seguir este protocolo, utilizar a matriz MALDI de 1,5-diaminonaftaleno (DAN) para sua dessorção favorável e ionização de aminoácidos em modo de íons negativos.</li>
	<li>Preparar 10 ml de uma solução matricial de 10 mg/mL DAN MALDI em acetonitrila/água 90/10 (v/v). Use solventes de grau HPLC, sonicate por 30 min e filtre a solução através de filtros de seringa de nylon de 0,2 μm antes da introdução na bomba de seringa de pulverizador robótico. Além disso, prepare soluções de lavagem para garantir que a linha do pulverizador esteja limpa entre cada uso. NOTA: As soluções de lavagem são escolhidas para aumentar a solubilidade da matriz e de outros contaminantes na linha de pulverização e facilitar a sua remoção do sistema. As soluções de lavagem aqui utilizadas são 90/10 (v/v) acetonitrila/água, 50/50 (v/v) água/metanol, 99/1 (v/v) acetonitrila/ácido acético e 95/5 (v/v) água/hidróxido de amônio.</li>
	<li>Anexe a amostra à bandeja do pulverizador e carregue as soluções preparadas na linha do pulverizador (Figura 3). Usando o software de computador, especifique os parâmetros necessários para permitir um revestimento uniforme do composto da matriz: temperatura do bocal de 30 °C, oito passagens, vazão de 0,1 mL/min, padrão CC, tempo de secagem de 0 s, 10 psi. NOTA: É geralmente aceito que a maioria dos patógenos será inativada pela aplicação da matriz MALDI, que é tipicamente um pequeno ácido orgânico ou base.</li>
	<li>Após o término da sequência de pulverização, retire a amostra da bandeja do pulverizador e guarde em um gabinete de dessecação até a análise.</li>
</ol>5. Preparação de macrocolônias bacterianas para aquisição de dados de espectrometria de massa por imagem MALDI
NOTA: Todas as análises de espectrometria de massa por imagem foram realizadas usando um espectrômetro de massa por ressonância cíclotron de íons com transformada de Fourier (FTICR). Este instrumento está equipado com um sistema laser Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).
<ol><li>Insira a amostra revestida de matriz no adaptador de lâmina do microscópio de placa alvo MALDI e escreva pelo menos três marcadores fiduciais que abranjam a área da amostra usando marcadores permanentes (Figura 4). Use um scanner de mesa para adquirir uma imagem óptica da lâmina do microscópio, incluindo os marcadores fiduciais. NOTA: Os marcadores fiduciais permitirão o registro da imagem óptica para a visão da câmera MALDI observada no instrumento.</li>
	<li>Defina um método de instrumento MS otimizado para a faixa de massa, sensibilidade e resolução desejadas, que inclui calibração de massa, configurações de laser MALDI, parâmetros ópticos de íons e condições de células ICR. Para este método, selecione uma janela de massa de 100 Da de m/z 100 a 200 para o enriquecimento do sinal em fase gasosa no modo de íons negativos usando uma abordagem de acumulação contínua de íons selecionados (CASI),23 que engloba os valores m/z dos metabólitos de interesse.</li>
	<li>Abra o software de aquisição de imagem do instrumento e use o assistente de configuração para definir o nome e o local do arquivo, o método de aquisição de MS, as regiões de interesse a serem amostradas e a resolução espacial da imagem. NOTA: Resoluções espaciais de 100-300 μm são tipicamente empregadas para imagens de macrocolônias bacterianas.</li>
	<li>Uma vez que todos os parâmetros tenham sido definidos, inicie a sequência de aquisição para adquirir em série um espectro de massa em cada pixel em toda a região (s) definida (s) de interesse. NOTA: O tempo de aquisição de imagem depende das configurações do instrumento, mas normalmente varia de 2 a 6 h para imagens contendo 5.000-10.000 pixels.</li>
</ol>6. Análise de dados de espectrometria de massa por imagem e identificação de compostos
<ol><li>Após a aquisição da imagem, salve os dados com uma extensão de arquivo ".mis", que é um formato de arquivo específico do fornecedor para plataformas de espectrometria de massa de imagem. Abra o arquivo de dados em pacotes de software flexImaging ou SCiLS ou exporte para um formato de dados não proprietário, como .mzml, e visualize usando software neutro em relação ao fornecedor (por exemplo, Cardinal24 ou MSIreader25,26). NOTA: Um espectro de massa médio é exibido ao abrir os dados de imagem no flexImaging, que representa as intensidades médias de todos os íons detectados nas regiões amostradas. Picos de interesse podem ser provisoriamente identificados com base em medições de massa precisas. Normalmente, precisões de massa superiores a 5 partes por milhão (ppm) são suficientes para a identificação de metabólitos em espectrômetros de massa FRITCR.</li>
	<li>Usando o software referenciado, defina janelas de massa para picos de interesse para gerar mapas de calor de cores falsas de distribuições de íons nas regiões amostradas.<ol><li>Na exibição média do espectro de massa, amplie o pico de interesse e selecione uma janela de massa apropriada que englobe a área do perfil de pico.</li>
		<li>Clique com o botão direito do mouse na janela de massa destacada e selecione Adicionar filtro de massa.... Rotule o valor de m/z selecionado usando a identificação provisória para o metabólito suspeito, conforme determinado pela medição de massa precisa de alta resolução.</li>
		<li>Selecione o limite de intensidade para ajustar o intervalo dinâmico da imagem do analito exibida pelo mapa de calor de cores falsas. Ajuste ainda mais os parâmetros de filtragem de massa para que a janela de massa englobe a área do perfil de pico e, em seguida, adicione o filtro de massa. NOTA: A normalização da intensidade pode ser realizada conforme apropriado para melhorar a quantificação relativa entre as regiões medidas. Os experimentos aqui utilizados utilizaram os métodos de aquisição de dados CASI (vide infra), o que pode tornar os métodos de normalização da contagem total de íons (TIC) e do quadrado médio da raiz (RMS) imprecisos. Como tal, todas as imagens de íons mostradas aqui são exibidas sem normalização.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Preparação e expedição de tecidos cecais de ratinhos não infectados e de C. difficile
<ol><li>Inocular camundongos machos C57BL/6 de 4-8 semanas de idade com antibióticos (0,5 mg/mL de cefoperazona ou 0,5 mg/mL de cefoperazona + 1 mg/mL de vancomicina) em água potável ad libitum por 5 dias, seguido por um período de recuperação de 2 dias e infecção subsequente.</li>
	<li>Eutanasiar os animais por asfixia de CO2 e colher o órgão do ceco do rato imediatamente. Incorpore em uma mistura de 20% de composto de temperatura de corte ideal (OCT) em água destilada.</li>
	<li>Colocar as amostras no gelo seco e, em seguida, embalar e enviar para análise; conservar a -80 °C até à análise.</li>
</ol>8. Criosecção de tecidos cecais de camundongos infectados com controle verus C. difficile
<ol><li>Limpe todos os equipamentos de criossecção enxaguando com etanol a 100% e deixe secar antes de colocar as amostras na câmara de criostato. Prepare lâminas de microscópio revestidas de ITO usando um ohmímetro para identificar o lado da lâmina com o revestimento condutor. Use um escriba com ponta de diamante para gravar e rotular o lado revestido de ITO da lâmina do microscópio. NOTA: Equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas, óculos de laboratório, jaleco de laboratório e mangas de criostato, devem ser usados.</li>
	<li>Realizar criossecção em um criomicrótomo de pesquisa. Transfira os tecidos cecálicos de rato incorporados em OCT de um congelador de -80 °C para a câmara criomicrótoma (temperatura da câmara de 30 °C, temperatura do objeto de -28 °C) em gelo seco. Monte as amostras de tecido a serem comparadas usando espectrometria de massa de imagem (por exemplo, controle não infectado vs. C. infectado por dificile) na mesma lâmina de microscópio para garantir a preparação idêntica da amostra de ambos os tipos de tecido e permitir comparações precisas de metabólitos.</li>
	<li>Dentro da câmara de criomicrótomos, monte o tecido incorporado em OCT em um mandril de amostra usando solução adicional de OCT. Depois que a solução OCT tiver se solidificado, fixe o mandril na cabeça da amostra. Comece a criosecção em incrementos de 10-50 μm para atingir a profundidade/plano de tecido desejado do órgão.</li>
	<li>Uma vez que uma seção transversal ideal do tecido é atingida, comece a coletar seções com 12 μm de espessura. Manipule suavemente a fatia usando pincéis de artista e coloque-a em uma lâmina de microscópio revestida de Teflon.</li>
	<li>Enrole a lâmina do microscópio revestida de ITO no topo da seção de tecido para pegar o tecido da lâmina revestida de Teflon. Descongele a seção de tecido na lâmina do microscópio pressionando a palma da mão na parte de trás da lâmina revestida de ITO. Continue a descongelar a montagem até que a seção de tecido passe de translúcida para uma textura opaca/fosca.</li>
	<li>Transfira as lâminas de microscópio montadas no tecido em gelo seco para uma caixa seca com dessecante para armazenamento para análise no mesmo dia ou armazene a -80 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>9. Preparação de tecidos cecais de camundongos infectados por C. difficile para aplicação em matriz e espectrometria de massa por imagem MALDI
<ol><li>Realizar a aplicação da matriz MALDI utilizando o mesmo protocolo descrito na etapa 4 (temperatura do bocal de 30°C, oito passagens, vazão de 0,1 mL/min, padrão CC, tempo de secagem de 0 s, 10 psi).</li>
	<li>Realizar espectrometria de massa por imagem MALDI usando os mesmos protocolos descritos nas etapas 5 e 6.</li>
	<li>Analise as imagens de íons de múltiplas replicações biológicas e compare os resultados quanto à significância por meio de comparações de gráfico de caixa de intensidade usando o software estatístico SCiLS mencionado acima. NOTA: Os testes estatísticos e comparações apropriados dependerão da aplicação e podem incluir segmentação espacial, modelos de classificação e análise comparativa para determinar características espectrais discriminativas e correlacionadas. As análises comparativas podem incluir a atribuição de valores de p a características significativas, a geração de análises de componentes principais para comparações de tecidos e a visualização de gráficos de caixa para identificar variações. Também é útil visualizar o tecido usando microscopia de campo brilhante da seção de tecido corada via hematoxilina e eosina (H & E) após espectrometria de massa por imagem. Isso permite a identificação clara de características morfológicas no tecido e pode ser analisado em consulta com um patologista treinado.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Durante a espectrometria de massa por imagem MALDI, é importante ter uma superfície de amostra plana para fornecer um diâmetro focal consistente do laser MALDI incidente no substrato da amostra. Desvios na altura da amostra podem fazer com que o feixe de laser MALDI saia do foco, causando alterações no diâmetro e intensidade do feixe, o que pode afetar a eficiência da ionização MALDI. Essas alterações na eficiência da ionização podem resultar em diferenças na intensidade do analito em toda a superfície do tecido que não ...

O microbioma humano é um ecossistema altamente dinâmico que envolve interações moleculares de bactérias, vírus, archaea e outros eucariotas microbianos. Embora as relações microbianas tenham sido intensamente estudadas nos últimos anos, ainda há muito a ser compreendido sobre os processos microbianos no nível químico 1,2. Isso se deve em parte à indisponibilidade de ferramentas capazes de medir com precisão ambientes microbianos complexos. Os avanços no campo da espectrometria de massa por imagem (IMS) na última década permitiram o mapeamento espacial in situ e livre de rótulos de muitos metabólitos, lipídios e proteínas em substratos biológicos 3,4. A dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) emergiu como a técnica de ionização mais comum utilizada na espectrometria de massa por imagem, envolvendo o uso de um laser UV para ablação de material da superfície de uma seção de tecido fino para medição por espectrometria de massa4. Este processo é facilitado pela aplicação de uma matriz química aplicada homogeneamente à superfície da amostra, permitindo que medições sequenciais sejam feitas em um padrão raster em toda a superfície da amostra. Mapas de calor das intensidades de íons do analito são então gerados após a aquisição de dados. Avanços recentes em fontes de ionização e técnicas de amostragem permitiram a análise de substratos não tradicionais, como espécimes celulares bacterianos5 e 6,7,8 de mamíferos cultivados em ágar nutriente. A informação espacial molecular fornecida pelo IMS pode fornecer uma visão única sobre a comunicação bioquímica das interações micróbio-micróbio e micróbio hospedeiro durante a infecção 9,10,11,12,13,14.
Após a infecção por Clostridioides difficile (CDI), C. difficile é exposto a um ambiente microbiano em rápida mudança no trato gastrointestinal, onde as interações polimicrobianas provavelmente afetarão os desfechos da infecção15,16. Surpreendentemente, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de interações entre C. difficile e microbiota residente durante a infecção. Por exemplo, os enterococos são uma classe de patógenos comensais oportunistas no microbioma intestinal e têm sido associados ao aumento da suscetibilidade e gravidade do CDI17,18,19,20. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares das interações entre esses patógenos. Para visualizar a comunicação de pequenas moléculas entre esses membros do microbioma intestinal, macrocolônias bacterianas foram cultivadas aqui em ágar para simular interações micróbio-micróbio e formação de biofilme bacteriano em um ambiente controlado. No entanto, a obtenção de distribuições metabólicas representativas na análise de espectrometria de massa por imagem MALDI de espécimes de cultura bacteriana é um desafio devido ao alto teor de água e à topografia superficial irregular dessas amostras. Isso é em grande parte causado pela natureza altamente hidrofílica do ágar e pela resposta não uniforme da superfície do ágar durante a remoção da umidade.
O alto teor de água do ágar também pode dificultar a obtenção de um revestimento homogêneo da matriz MALDI e pode interferir na análise MALDI subsequente realizada no vacuo21. Por exemplo, muitas fontes MALDI operam a pressões de 0,1-10 Torr, que é um vácuo suficiente para remover a umidade do ágar e pode causar deformação da amostra. Essas alterações morfológicas no ágar induzidas pelo ambiente de vácuo causam borbulhamento e rachaduras no material de ágar seco. Esses artefatos reduzem a aderência do ágar à lâmina e podem causar desmontagem ou descamação da amostra no sistema de vácuo do instrumento. A espessura das amostras de ágar pode estar a até 5 mm da lâmina, o que pode criar folga insuficiente da óptica iônica dentro do instrumento, causando contaminação e/ou danos à óptica iônica do instrumento. Esses efeitos cumulativos podem resultar em reduções do sinal iônico reflexivo da topografia de superfície, em vez das interações bioquímicas microbianas subjacentes. As amostras de ágar devem ser secas homogeneamente e fortemente aderidas a uma lâmina de microscópio antes da análise em vácuo.
Este trabalho demonstra um fluxo de trabalho de preparação de amostras para a secagem controlada de macrocolônias de cultura bacteriana cultivadas em meio de ágar. Este processo de secagem mais lento e de várias etapas (em relação aos relatados anteriormente) garante que o ágar desidrate uniformemente, minimizando os efeitos do borbulhar ou rachadura de amostras de ágar montadas em lâminas de microscópio. Usando este método de secagem gradual, as amostras são fortemente aderidas à lâmina do microscópio e passíveis de aplicação subsequente da matriz e análise MALDI. Isso é exemplificado usando colônias bacterianas modelo de C. difficile cultivadas em modelos de tecido ágar e murino que abrigam CDI com e sem a presença de patógeno comensal e oportunista, Enterococcus faecalis. As análises de espectrometria de massa por imagem MALDI de modelos bacterianos e teciduais permitem o mapeamento espacial de perfis de metabólitos de aminoácidos, fornecendo uma nova visão sobre o metabolismo e a comunicação microbiana bioenergética.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Filtros de seringa de nylon Titan3</td><td>Thermo Scientific</td><td>42225-NN</td><td></td></tr><tr><td>1,5-diaminonaftaleno matriz MALDI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2243-62-1</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Seringas Henke Ject luer lock</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200.000V0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vacuômetro de convecção da série 275i</td><td>Kurt J. Lesker company</td><td>KJL275807LL</td><td></td></tr><tr><td>espectrômetro de massa 7T solariX FTICR equipado com um sistema de laser Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm)&nbsp;</td>Solução de ácido acético <td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, adequada para HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, adequada para HPLC, grau gradiente, &ge; 99,9%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de amônio, 28% NH3 em H2O, &ge; 99,99% de base de metais traços</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Sacos de risco biológico autoclaváveis: 55 gal</td> Sacos de transporte de amostras de risco biológico <td>Grainger</td><td>45TV10</td><td></td></tr><tr><td>(8 x 8 pol.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-800-07</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de infusão de coração cerebral</td><td>BD Biosciences</td><td>90003-040</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 camundongos machos&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CanoScan 9000F Mark II scanner de fotos e documentos</td><td>Canon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM 3050S criomicrótomo de pesquisa</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de dessecador</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z268135</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de diamante, Microscopia Eletrônica Ciências&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-254-51</td><td></td></tr><tr><td>Drierite pellets dessecantes</td><td>Drierite</td><td>21005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Provas</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>flexImaging software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ftmsControl software</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armadilha de vácuo de vidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z549460</td><td></td></tr><tr><td>Pulverizador robótico HTX M5 TM</td> Lâminas de microscópio revestidas com óxido de índio e estanho (ITO) da <td>HTX Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro HEPA em linha para bomba de vácuo</td><td></td> Delta Technologies CG-81IN-S115 <td></td> LABCONCO 7386500 <td></td></tr><tr><td>Metanol, Grau HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>&nbsp; 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> MTP adaptador de lâmina II Bruker Daltonics 235380 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Composto de temperatura de corte ideal (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Peridox RTU Esporicida, Desinfetante e Limpador</td><td>CONTEC</td><td>CR85335&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas impressas em PTFE (Teflon), Electron Microscopy Sciences</td><td>VWR</td><td>100488-874</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo de palhetas rotativas RV8</td><td>Edwards</td><td>A65401903</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Lâminas de micrótomo descartáveis de alto perfil</td><td>Tubos</td><td></td> de vácuo transparente Cole <td></td></tr><tr><td></td><td>Palmer</td><td>EW-06414-30</td><td></td></tr><tr><td>Ultragrade 19 óleo de bomba de vácuo</td><td>Edwards</td><td>H11025011</td><td></td></tr><tr><td>Transformador de tensão variável</td><td>Powerstat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água, adequado para HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de dewar de boca larga</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z120790</td><td></td></tr></tbody></table>

investigação da cooperação microbiana via análise de espectrometria de massa por imagem de colônias bacterianas cultivadas em Ágar e em tecido durante a infecção

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Compreender as consequências metabólicas das interações microbianas que ocorrem durante a infecção apresenta um desafio único para o campo da imagem biomédica. A espectrometria de massa por dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) representa uma modalidade de imagem in situ livre de rótulos, capaz de gerar mapas espaciais para uma ampla variedade de metabólitos. Embora as amostras de tecido de seção fina sejam agora rotineiramente analisadas por meio dessa tecnologia, as análises de espectrometria de massa de imagens de substratos não tradicionais, como colônias bacterianas comumente cultivadas em ágar em pesquisas em microbiologia, permanecem desafiadoras devido ao alto teor de água e à topografia irregular dessas amostras. Este artigo demonstra um fluxo de trabalho de preparação de amostras para permitir análises de espectrometria de massa por imagem desses tipos de amostras. Este processo é exemplificado usando macrocolônias de co-cultura bacteriana de dois patógenos gastrointestinais: Clostridioides difficile e Enterococcus faecalis. O estudo das interações microbianas neste ambiente de ágar bem definido também é mostrado para complementar os estudos teciduais destinados a compreender a cooperação metabólica microbiana entre esses dois organismos patogênicos em modelos de infecção em camundongos. Análises de espectrometria de massa por imagem dos metabólitos de aminoácidos arginina e ornitina são apresentadas como dados representativos. Este método é amplamente aplicável a outros analitos, patógenos ou doenças microbianas e tipos de tecidos em que uma medida espacial da bioquímica celular ou tecidual é desejada.

Realizamos espectrometria de massa por imagem de metabólitos MALDI de colônias bacterianas modelo e camundongos co-colonizados com E. faecalis e C. difficile para estudar o papel dos aminoácidos nas interações micróbio-micróbio. Macrocolônias bacterianas cultivadas em ágar servem como um modelo bem definido para analisar mudanças bioquímicas distintas na formação de biofilme bacteriano. É importante garantir um processo de secagem controlado para macrocolônias de cultura bacteriana cultivadas em meio de...

Um novo método de preparação de amostras é demonstrado para a análise de macrocolônias bacterianas à base de ágar por meio de espectrometria de massa por imagem de dessorção/ionização a laser assistida por matriz.

Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

Nosso protocolo permite a visualização do metabolismo espacial das interações microbianas que ocorrem durante a infecção. Desenvolvemos este fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imagem para coculturas bacterianas cultivadas em modelos de ágar e tecido. A análise de substratos não tradicionais, como culturas bacterianas cultivadas em ágar, apresenta muitos desafios.Usando nosso protocolo, as amostras bacterianas podem ser secas adequadamente para facilitar a aplicação da matriz MALDI na análise subsequente de espectrometria de massa por imagem. Este método é amplamente aplicável a uma variedade de metabólitos, patógenos ou doenças microbianas e tipos de amostras em que uma medida espacial da bioquímica celular ou tecidual é desejada, particularmente ao estudar tipos de amostras que requerem desidratação antes da análise. Depois de preparar as macrocolônias de cultura bacteriana, remova as colônias bacterianas de agarose montadas em lâminas de microscópio revestidas de ITO do material de embalagem.Colocar as amostras numa caixa seca com dessecante durante 48 a 72 horas à temperatura ambiente. Inspecione visualmente as colônias em busca de deformações na superfície do ágar. Em seguida, feche a linha de vácuo para a câmara de amostra e ligue o interruptor de energia para a bomba de palhetas rotativas para permitir que a bomba de vácuo aqueça e atinja a pressão de vácuo adequada.Ligue o transformador de tensão variável para aquecer o filamento de fio enrolado em torno da câmara. Ajuste a fonte de alimentação variável até que a temperatura interna da câmara de vácuo atinja aproximadamente 50 graus Celsius. Enquanto a bomba está aquecendo, coloque uma pasta de gelo seco e etanol a 100% no condensador de armadilha fria.Abra a câmara de vácuo usando uma chave inglesa para soltar os grampos de flange de pano duplo de 16 milímetros. Insira as amostras de agarose na câmara e sele firmemente a câmara com os grampos de flange de pano duplo de 16 milímetros. Em seguida, abra a válvula da bomba para evacuar a câmara e deixe as amostras secarem por 60 a 120 minutos.Quando estiver completo, ventile lentamente a câmara de vácuo à pressão ambiente, fechando a válvula na bomba de palhetas rotativas e abrindo a flange de vácuo para o ar ambiente. Abra a câmara, como demonstrado anteriormente, e remova a amostra de agarose seca da câmara. Use a matriz MALDI de 1, 5-Diaminonaftaleno para sua dessorção e ionização favoráveis de aminoácidos e modo de íons negativos.Prenda a amostra à bandeja do pulverizador e carregue as soluções preparadas na linha do pulverizador. Usando o software de computador, especifique os parâmetros necessários para um revestimento uniforme do composto da matriz. Monitore a sequência de pulverização até que ela seja concluída.Retire a amostra da bandeja do pulverizador e guarde-a em um gabinete de dessecação até a análise. Insira a amostra revestida de matriz no adaptador de lâmina do microscópio de placa alvo MALDI. Inscreva pelo menos três marcadores fiduciais que abranjam a área da amostra usando marcadores permanentes.Use um scanner de mesa para adquirir uma imagem óptica da lâmina do microscópio, incluindo os marcadores fiduciários. Agora defina um método de instrumento de espectrometria de massa como descrito no manuscrito. No modo de íons negativos, selecione a janela de massa de 100 dalton de massa por carga 100 a 200 para enriquecimento de sinal em fase gasosa usando uma abordagem de acumulação contínua de íons selecionados que engloba os valores de massa por carga dos metabólitos de interesse.Abra o software de aquisição de imagem do instrumento e use o assistente de configuração para definir o nome e o local do arquivo, o modo de aquisição de MS, as regiões de interesse a serem amostradas e a resolução espacial da imagem. Ensine a amostra usando os marcadores fiduciais da imagem óptica para sincronizar com o suporte da amostra do instrumento. Em seguida, defina as regiões de interesse na imagem óptica usando a ferramenta de seleção de regiões de interesse do software.Uma vez que todos os parâmetros tenham sido definidos, inicie a sequência de aquisição para adquirir em série um espectro de massa em cada pixel em toda a região de interesse definida. Após a aquisição da imagem, salve os dados com uma extensão de arquivo MIS, que é um formato de arquivo específico do fornecedor para plataformas de espectrometria de massa de imagem. Abra o arquivo de dados em pacotes de software flexImaging ou SCiLS ou exporte para um formato de dados não proprietário, como mzML, e visualize usando software neutro do fornecedor.Usando o software de referência, defina janelas de massa para picos de interesse para gerar mapas de calor coloridos falsos de distribuições de íons nas regiões amostradas. Na exibição média do espectro de massa, amplie o pico de interesse e selecione uma janela de massa apropriada que englobe a área do perfil de pico. Agora, clique com o botão direito do mouse na janela de massa destacada e selecione Adicionar filtro de massa.Rotular a massa selecionada por valor de carga usando a identificação provisória do metabolito suspeito, conforme determinado pela medição de massa precisa de alta resolução. Selecione o limite de intensidade para ajustar o intervalo dinâmico da imagem do analito exibido pelo mapa de calor de cores falsas. Ajuste ainda mais os parâmetros de filtragem de massa para que a janela de massa englobe a área do perfil de pico e, em seguida, adicione o filtro de massa.Limpe todos os equipamentos de criossecção, enxaguando-os com etanol a 100%, e deixe secar antes de colocar as amostras na câmara de criostato. Prepare lâminas de microscópio revestidas de ITO usando um ohmímetro para identificar o lado da lâmina com o revestimento condutor. Usando um escriba com ponta de diamante, grave e rotule o lado revestido de ITO da lâmina do microscópio.Em seguida, realize a criossecção em um criomicrótomo de pesquisa. Transfira os tecidos cecálicos de rato incorporados em OCT de um congelador Celsius de 80 graus para a câmara criomicrótoma em gelo seco. Dentro da câmara de criomicrótomos, monte o tecido incorporado em OCT em um mandril de amostra usando uma solução adicional de OCT.Após a solidificação da solução OCT, fixe o mandril na cabeça da amostra e inicie a criossecção a incrementos de 10 a 50 micrômetros para atingir a profundidade ou o plano desejado do tecido do órgão. Uma vez que uma seção transversal ideal do tecido é atingida, comece a coletar seções com 12 micrômetros de espessura. Manipule suavemente a fatia usando pincéis de artista e coloque-a em uma lâmina de microscópio revestida de Teflon.Para pegar o tecido da lâmina revestida de Teflon, enrole a lâmina do microscópio revestida de ITO no topo da seção de tecido. Descongele a seção de tecido na lâmina do microscópio pressionando a palma da mão na parte de trás da lâmina revestida de ITO. Continue a descongelar até que a seção do tecido passe de translúcida para uma textura opaca ou fosca.Para análise no mesmo dia, transfira as lâminas do microscópio montadas no tecido em gelo seco para uma caixa seca com dessecante para armazenamento. Execute a aplicação da matriz MALDI e a espectrometria de massa de imagem MALDI, conforme demonstrado anteriormente. Analise as imagens de íons de múltiplas replicações biológicas e compare os resultados para uma significância através de comparações de gráfico de caixa de intensidade usando o software estatístico SCiLS.A análise MALDI em modo iônico negativo de amostras de cultura bacteriana permite detectar dezenas de metabólitos. Medições de massa precisas de alta resolução permitem a identificação provisória de ornitina e arginina. As regiões de medição para análise por espectrometria de massa por imagem são mostradas.A espectrometria de massa por imagem dessas amostras permite o mapeamento espacial de metabólitos de aminoácidos de ornitina e arginina que se encontram alterados e diferencialmente localizados na presença de Enterococcus faecalis. A morfologia tecidual da ceca de camundongo infectado foi visualizada por meio da coloração de hematoxilina e eosina. Imagens ópticas de tecidos cecais de camundongos após a aplicação de uma camada de matriz MALDI de 1, 5-Diaminonaftaleno são mostradas.As imagens de íons MALDI para ornitina e arginina exibem distribuições espaciais únicas entre as amostras de tecido. A consideração mais importante para este protocolo é manter a secagem suave e o manuseio de amostras de cultura bacteriana para minimizar borbulhamento, rachaduras e outras deformações da amostra. Após espectrometria de massa por imagem, análises de microscopia de campo brilhante e fluorescência de amostras de tecido podem ser realizadas para avaliar a morfologia do tecido.Isso também pode permitir a validação direcionada de vias moleculares usando métodos de imagem baseados em anticorpos.

investigation-microbial-cooperation-via-imaging-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fonte: Specker, J. T., et al. Investigação da cooperação microbiana por meio de análise por espectrometria de massa por imagem de colônias bacterianas cultivadas em ágar e tecido durante infecções. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o uso da espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) para visualizar a distribuição de aminoácidos em tecidos intestinais de camundongos infectados com Clostridioides difficile, sozinho ou em combinação com Enterococcus...

Visualização de Metabólitos de Aminoácidos em Tecidos Intestinais de Ratos Infectados

Este vídeo demonstra um método baseado em microscopia de fluorescência para estudar a competição bacteriana no nível de uma única célula. Este método fornece informações sobre a estrutura e função das comunidades bacterianas.

Ensaio de co-incubação bacteriana: uma técnica baseada em microscopia de fluorescência para visualizar a competição bacteriana intraespecífica no nível de célula única

Descrevemos a fixação, incorporação de parafina e técnicas de corte finas para biofilmes microbianos de colônia. Em amostras preparadas, padrões de expressão de subestrutura e repórter de biofilme podem ser visualizados por microscopia.

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Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

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A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.

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Este protocolo de imagem celular live-bacteria permite a visualização de interações entre múltiplas espécies bacterianas no nível de célula única ao longo do tempo. A imagem de lapso de tempo permite a observação de cada espécie bacteriana em monocultura ou cocultura para interrogar interações entre espécies em comunidades bacterianas multiespécies, incluindo motilidade e viabilidade celular individual.

Visualização cinética de interespécies interespécies unicelulares interespécies

A Espectroscopia De Microscopia-Infravermelha da Força Atômica (AFM-IR) fornece uma plataforma poderosa para estudos bacterianos, permitindo alcançar a resolução de nanoescala. Ambos, o mapeamento de alterações subcelulares (por exemplo, na divisão celular) quanto estudos comparativos de composição química (por exemplo, decorrentes da resistência a medicamentos) podem ser conduzidos a um único nível celular em bactérias.

Microscopia da Força Atômica Combinada com Espectroscopia Infravermelha como ferramenta para sondar química de bacterium único

Este protocolo simplificado detalha um fluxo de trabalho para detectar e imaginar bactérias em amostras complexas de tecido, desde a fixação do tecido até micróbios de coloração com hibridização fluorescente in situ .

Visualização de Interações de Microbiota intestinal via Fluorescência In Situ Hibridização, Mancha de Lectina e Imagem

Este manuscrito descreve um método para o uso de microscopia de fluorescência unicelular para visualizar e quantificar a competição bacteriana na cocultura.

Quantificação da Competição Interbacteriana usando imagens de fluorescência unicelular

Aprenda a visualizar o metabolismo espacial de interações microbianas durante infecções usando espectrometria de massa por imagem MALDI-IMS. Este método permite analisar co-culturas bacterianas em ágar e tecidos com precisão.

Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção (Vídeo) | JoVE Journal

Investigação da Cooperação Microbiana via Análise de Espectrometria de Massa por Imagem de Colônias Bacterianas Cultivadas em Ágar e em Tecido Durante a Infecção

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