Avaliação e manipulação da atividade neural utilizando microscopia holográfica de dois fótons

Este protocolo fornece informações espaço-temporais precisas sobre neuroatividade. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de manipular e avaliar a neuroatividade com alta resolução espaço-temporal. Pode ser útil para ilustrar os patógenos de transtornos neuropsiquiátricos que levam a anormalidades na atividade neural.

Este método pode ser aplicado ao estudo de neurônios, bem como a saúde nos outros órgãos. Quem demonstrará o procedimento será Zhongtian Guo, aluno de pós-graduação de doutorado do nosso laboratório. Um dia após o implante da placa cefálica, administrar 1,32 miligramas por quilograma de fosfato sódico de dexametasona por via intraperitoneal uma hora antes da cirurgia para evitar edema cerebral.

Sob um estereoscópio, realizar uma craniotomia circular de aproximadamente dois milímetros de diâmetro utilizando uma broca odontológica. Para reduzir os danos cerebrais, opere a broca dentária cuidadosamente com movimentos leves constantes e leve pressão para baixo. Remova os fragmentos ósseos várias vezes usando um sistema de sucção.

Depois de remover o fragmento ósseo, use um líquido espinhal artificial ou solução de ACSF para remover e lavar quaisquer detritos remanescentes na superfície do cérebro. Repita este procedimento de limpeza várias vezes para suprimir as reações inflamatórias. Usando um sistema de injeção de pressão, ajuste a pressão apropriada para injetar 500 nanolitros de solução de AAV através de um capilar de vidro com um diâmetro de ponta de 10 a 20 micrômetros por 10 minutos.

Se o nível da solução de AAV no capilar de vidro diminui gradualmente, a solução de AAV está sendo administrada ao cérebro. Deixe o capilar de vidro no lugar por mais 10 minutos para evitar o refluxo. Repita isso três vezes para administrar um total de 1,5 microlitros de solução de AAV no cérebro.

Aplique agarose de fusão 2% baixa na superfície cerebral de S1 usando uma micropipeta e, em seguida, coloque uma janela de vidro sobre a craniotomia com dois óculos de cobertura. Pressione o vidro da tampa contra a agarose enquanto ela ainda estiver líquida. Isso evita a formação de bolhas de ar na agarose.

Sele as bordas da janela craniana com cimento resinoso adesivo dental. Para calibrar o sistema de estimulação holográfica, coloque a superfície de uma lâmina fluorescente vermelha no plano da amostra e coloque o microscópio no modo de imagem ao vivo com uma luz de excitação fraca. Execute a GUI de calibração.

mfile, verifique o painel de parâmetros e clique no botão Salvar. Clique no botão Z Scan no painel da etapa um se ele gerar automaticamente três pontos aleatórios em 21 planos axiais diferentes a dois micrômetros de distância de cada plano. Mova a barra de slides e verifique a imagem ao vivo.

Encontre o plano perfeito onde os pontos aparecem menores e mais brilhantes e, em seguida, clique no botão Salvar. Isso gerará automaticamente uma frente de onda esférica deslocada para o holograma digital. Clique no botão Ir no painel da etapa dois e, em seguida, clique em seis pontos no quadrado esquerdo.

Confira a imagem ao vivo. Se houver seis pontos fluorescentes distinguíveis, digite seus eixos x e Y nas caixas de edição e clique no botão Salvar. Isso gerará automaticamente um coeficiente de transformação fina para coordenar a calibração entre a estimulação holográfica e o sistema de imagem.

Em seguida, clique no botão Digitalizar no painel da etapa três. Ele gerará 441 hologramas digitais para realizar varredura de ponto único em todo o campo de visão em 21 por 21 etapas. Verifique as imagens ao alterar padrões na caixa de listagem.

Ajuste a potência do laser para obter imagens pontuais dentro da faixa dinâmica do dispositivo de imagem. Coloque o dispositivo de imagem no modo de gravação e clique no botão Reproduzir. Após a conclusão da reprodução, clique em Gerar Mapa de Peso no painel da etapa quatro e escolha uma imagem empilhada.

Em seguida, feche a janela GUI de calibração. Ele irá gerar automaticamente um mapa de peso para compensar a intensidade desequilibrada em cada ponto. Coloque o camundongo injetado em AAV com uma placa de cabeça sob o microscópio e realize imagens de dois fótons usando um microscópio holográfico e um laser de safira de titânio bloqueado por modo sintonizado em 920 nanômetros com uma objetiva de 25x.

Abra o software de imagem comercial no modo de imagem ao vivo. Ajuste a voltagem do detector de imagem e a potência do laser de imagem para otimizar o brilho dos neurônios que expressam GCaMP8f. Capturar imagens dos neurônios que expressam essa proteína.

Para iluminar os neurônios específicos com iluminação holográfica, execute o SLMcontrol. m arquivo de script. Clique na imagem de referência e escolha a imagem adquirida.

Em seguida, clique no botão Spot para escolher pixels específicos nos neurônios na imagem e pressione o botão Enter no teclado para finalizá-lo. Para detectar atividade neural com alta resolução temporal usando um sensor de imagem, defina o tempo de exposição, área de imagem e binning e, em seguida, realize a aquisição da imagem. Depois de colocar o mouse sob o microscópio e realizar imagens de dois fótons, abra o software de imagem comercial.

No modo de imagem ao vivo, ajuste a voltagem do detector de imagem e a potência do laser de imagem para otimizar o brilho dos neurônios que expressam GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Capture imagens dos neurônios que expressam essas proteínas e, em seguida, ilumine os neurônios específicos seguindo o procedimento mostrado anteriormente. Para investigar a conectividade funcional dentro das camadas dois e três neurônios, use um modulador espacial de luz para gerar padrões holográficos de estimulação optogenética e combiná-lo com imagens de cálcio de dois fótons.

Defina a intensidade do laser de imagem para 920 nanômetros em 10 a 20 miliwatts e o campo de visão para 256 micrômetros por 256 micrômetros medidos a uma profundidade de 100 a 150 micrômetros da superfície cortical. Defina o tempo de permanência do pixel em 1,5 microssegundos para dois hertz ou 100 nanossegundos para 30 hertz. Use dois hertz e 30 hertz como taxa de quadros de imagem para ver se um único estímulo holográfico causou uma resposta de cálcio nos neurônios.

Defina a intensidade do laser de estimulação holográfica que estimula um único neurônio em 10 miliwatts, o que é suficiente para induzir a atividade neural. Simultaneamente, obter imagens da resposta do cálcio ferro a 920 nanômetros com 10 estímulos holográficos a 1040 nanômetros e intervalos de oito segundos para uma duração de 50 milissegundos após um período basal de 10 segundos. Depois disso, devolva o rato à sua gaiola inicial.

A imagem representativa e os traços de neurônios expressando GCaMP8f em imagens de 100 hertz com estimulação holográfica e um sensor de imagem são mostrados aqui. Este gráfico mostra a resposta neural à estimulação holográfica a cada potência do laser. Os traços representativos de Cálcio 2+ durante a estimulação holográfica de 10 neurônios diferentes em taxas de quadros de imagem de dois hertz e 30 hertz são apresentados aqui.

A mesma cor indica o mesmo neurônio. Um diagrama esquemático avaliando conexões funcionais entre neurônios é descrito aqui. Quando o neurônio laranja é estimulado, os neurônios vermelhos respondem ao mesmo tempo indicando que há conectividade funcional entre esses neurônios.

Uma imagem típica dos neurônios primários do córtex somatossensorial expressando GCaMP6m no tipo selvagem é mostrada aqui. Essas imagens gráficas representam os traços típicos de Cálcio 2+ durante a estimulação holográfica em taxas de quadros de imagem de dois hertz e 30 hertz. A neuro-responsividade à estimulação holográfica pode ser detectada em velocidades de imagem de dois hertz e 30 hertz.

Estes passos são importantes para reduzir o movimento cerebral e dois, obter resultados estáveis. Acreditamos que este microscópio possa induzir comportamento na escrita de neurônios com padrões específicos. Com essa técnica, agora podemos avaliar e manipular a atividade do neurônio individual e caracterizar a neuropsiquiatria em detalhes.