Uma plataforma de vacina de nanopartículas "plug-and-display" baseada em vesículas de membrana externa exibindo o domínio de ligação ao receptor SARS-CoV-2

A nanociência pode efetivamente melhorar a resposta imune específica do antígeno após a exibição de antígenos na superfície da A principal vantagem nesta plataforma de vacina pode alcançar a placa de saída e a exibição. Em outras palavras, a plataforma é capaz de exibir a variedade de antígenos em Este método também pode ser aplicado a outras nanopartículas biológicas para exibir motor para portadores de tamanho nano. Para realizar a transformação do cateter espião de citolisina A, comece com a adição de cinco microlitros de solução plasmática a 50 microlitros de cepa competente BL 21.

Sopre suavemente e deixe esfriar no gelo por 30 minutos. Coloque a solução por 90 segundos no banho-maria a 42 graus Celsius e, em seguida, coloque imediatamente a solução misturada no gelo por três minutos. Adicionar 500 microlitros de meio de luria bertani à suspensão bacteriana e após mistura cultura a 220 rotações por minuto a 37 graus Celsius durante uma hora.

Em seguida, pratique toda a placa de ágar luria bertani de transformação contendo ampicilina e cultura durante a noite a 37 graus Celsius. Para a produção de espiões OMV, comece isolando uma única colônia da placa a 20 mililitros de meio luria bertani e cultura durante a noite a 220 rotações por minuto a 37 graus Celsius. Incubar a solução bacteriana em um meio de dois litros e cultivar a 220 rotações por minuto a 37 graus Celsius por cinco horas até que o estágio de crescimento logarítmico seja atingido.

Adicionar o isopropil-beta D-IPTG para que a concentração final da solução bacteriana seja de 0,5 milimolar e, em seguida, cultivar durante a noite a 220 rotações por minuto a 25 graus Celsius. Em seguida, execute a purificação do espião OMV. Comece com centri fundindo a solução bacteriana.

Filtre o sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 micrômetro e, em seguida, concentre-o usando uma coluna de fibra oca. Filtre o concentrado através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetros, depois funda-o a 150.000 vezes G a quatro graus Celsius por duas horas usando um fusível ultracentrista e descarte o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspeite a precipitação com PBS e armazene-a a menos 80 graus Celsius.

Para realizar a transfecção de spytag RBD, comece com a seleção de um sistema de expressão eucariótica apropriado e cultive as células durante a noite a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius após a recuperação. Adicione 20 microlitros HEK 293F de solução celular no contador de células automatizado. Registre o número de células, ajuste a concentração para uma vez 10 para as seis células por mililitro.

E então cultive as células a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius por quatro horas. Filtre o plasmídeo RBD spy tag através de um filtro de membrana de 0,22 micrômetro e adicione 300 microgramas de plasmídeos no meio de cultura celular até que o volume final seja de 10 mililitros. Agite durante 10 segundos.

Aqueça o PEI a 65 graus Celsius no banho de água. Misture 0,7 mililitros de PEI com 9,3 mililitros de meio de cultura celular e agite intermitentemente por 10 segundos. Adicionar solução plasmídica à solução PEI.

Agite a mistura intermitentemente durante 10 segundos e incube-a a 37 graus Celsius durante 15 minutos. Adicione a mistura a 280 mililitros de meio de cultura celular e a cultura a 130 rotações por minuto a 37 graus Celsius durante cinco dias. Em seguida, execute a purificação do spytag RBD.

Comece com a fusão centrírica das células a 6.000 vezes G a 25 graus Celsius por 20 minutos e use uma pipeta para coletar o sobrenadante. Encha a coluna com dois mililitros de níquel NTA agarose e lave-a três vezes com PBS. Adicione imidazol no sobrenadante celular para fazer a concentração final de 20 milimolares e carregue o sobrenadante celular.

Adicionar três volumes de coluna de PBS contendo 20 milimolares de imidazol para lavagem e recolher a fracção de lavagem. Eluir gradiente com três volumes de coluna de PBS contendo concentrações baixas a altas de eluto de imidazol duas vezes para cada concentração. Para determinar a concentração de proteína pelo método BCA, diluir em série a solução padrão de proteína BSA de dois a 0,0625 miligramas por mililitro, diluir o espião OMV purificado e a etiqueta espiã RBD 10 vezes.

Em seguida, misture as soluções de trabalho BCA A e B em uma proporção de 50 para um. Adicione a solução de proteína diluída e misture com a solução de trabalho de BCA. Incubar a 37 graus por 30 minutos.

Meça a absorvância a 562 nanômetros de cada poço e calcule a concentração de proteína a partir da curva padrão. Para realizar a bioconjugação do espião OMV e da tag espiã RBD, misture o espião OMV e o espião RBD e PBS em uma proporção de 40 para um. Gire verticalmente para misturar a mistura durante a noite a 15 rotações por minuto a quatro graus Celsius.

Realizar a purificação do RBD OMV usando a solução PBS usando um procedimento semelhante à purificação do espião OMV. O esquema de design do plasma mostra que o gene do espião está conectado com o gene cly A através de um ligador flexível, enquanto o espião se conecta aos cinco terminais primos do gene RBD com um gene hys tag para purificação e verificação. Após a ultracentrifugação, quase todos os espiões RBD não reagidos permaneceram no sobrenadante.

A segunda ultracentrifugação não proporcionou uma vantagem mais significativa em relação à primeira vez. O diâmetro hidrodinâmico médio z do espião OMV foi de 133 nanômetros, enquanto foi de 152,6 nanômetros para OMV-RBD. Essas diferenças podem ser porque o RBD aumenta o tamanho da partícula OMV após a exibição intensiva.

Os resultados do ETM são consistentes com a distribuição granulométrica obtida a partir dos resultados do DLS. A rotação para misturar a mistura é muito importante. A eficiência da reação pode ser muito menor sem rotação.