Name: Síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda síntese de proteínas livre de células usando extratos de Escherichia coli deficientes em exonucleases e modelos lineares de DNA. Este método simplifica a prototipagem rápida em biotecnologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ACB e JLF reconhecem o apoio financeiro pela subvenção ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF e JB reconhecem o apoio financeiro da bolsa ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). A MSA e a JLF reconhecem o apoio financeiro da subvenção ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). O JB reconhece o apoio do ERC ao iniciar o "COMPUCELL" (número de concessão 657579). O Centre de Biochimie Structurale reconhece o apoio da Infraestrutura Francesa de Biologia Estrutural Integrada (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK reconhece o apoio financeiro do departamento MICA da INRAe, Université Paris-Saclay, DIM-RFSI da região de Ile-de-France (IdF) e ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Este trabalho foi apoiado por financiamento através do Prémio Consolidador do Conselho Europeu de Investigação (865973 ao CLB).

<ol><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).</li>
<li>McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+use+of+linear+DNA+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective use of linear DNA in cell-free expression systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).</li>
<li>Schinn, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+directly+from+PCR%3A+progress+and+applications+of+cell-free+protein+synthesis+with+linear+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA.</a> New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).</li>
<li>Prell, A., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+linear+and+circular+DNA+with+gaps+by+the+recBC+enzyme+of+Escherichia+coli.+Effects+of+gap+length+and+the+presence+of+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts.</a> European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+containing+%CF%87+sites+enhances+DNA+stability+and+gene+expression+in+E.+coli+cell-free+transcription-translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).</li>
<li>Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+linear+DNA+templates+in+cell-free+expression+systems+from+diverse+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
<li>Zhu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell-free+gene+expression+yields+from+linear+templates+in+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens+extracts+by+using+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).</li>
<li>Batista, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+optimized+cell-free+buffer+enables+robust+expression+from+unprotected+linear+DNA+in+exonuclease-deficient+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> JoVE. (144), e58882(2019).</li>
<li>Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+Coli-based+cell-free+protein+expression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
</ol>

Aqui, mostramos que o lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 com um knockout genômico para o operon recB ou recBCD suporta alta expressão proteica a partir de modelos lineares de DNA. Este protocolo elabora um procedimento de calibração passo-a-passo de lisado específico para modelos lineares de DNA (Figura 2), que é uma etapa crítica que leva à alta expressão de promotores σ70 em DNA linear, atingindo níveis quase plasmídicos para concentrações...

Os sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) estão sendo cada vez mais utilizados como um método rápido, simples e eficiente para engenharia de biossensores, fabricação descentralizada e prototipagem de circuitos genéticos1. Devido ao seu grande potencial, os sistemas CFPS são utilizados regularmente no campo da biologia sintética. No entanto, até agora, os sistemas CFPS dependem de plasmídeos circulares que podem limitar a tecnologia de atingir todo o seu potencial. A preparação do DNA plasmídico depende de muitas etapas demoradas durante a clonagem e de grandes quantidades de isolamento de DNA. Por outro lado, a amplificação por PCR a partir de um plasmídeo, ou um molde de DNA sintetizado, pode ser usada para simplesmente preparar modelos de CFPS dentro de algumas horas 2,3. Portanto, a aplicação de DNA linear oferece uma solução promissora para a SFCP. No entanto, o DNA linear é rapidamente degradado pelas exonucleases naturalmente presentes nos extratos celulares4. Existem soluções que abordam esse problema, como o uso da proteína λ-fago GamS5 ou DNA contendo sítios Chi6 como agentes protetores, ou a proteção direta do DNA linear por modificação química de suas extremidades 2,7,8,9. Todos esses métodos requerem suplementações ao extrato celular, que são caros e demorados. Sabe-se há muito tempo que o complexo exonuclease V (RecBCD) degrada o DNA linear em lisados celulares4. Recentemente, mostramos que o DNA linear pode ser muito melhor protegido em lisados de células nocauteadas por genes exonuclease (recBCD)10.
Neste protocolo, as etapas para a preparação de lisados livres de células da cepa E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lise sonicação são descritas em detalhes. A lise sonicativa é uma técnica comum e acessível empregada por vários laboratórios11,12. Os extratos produzidos a partir desta estirpe não necessitam da adição de qualquer componente extra ou modificação do molde de ADN para suportar a expressão a partir de moldes de ADN lineares. O método baseia-se na etapa essencial de otimização de tampão para extratos celulares especificamente para a expressão linear de DNA de promotores nativos de E. coli. Demonstrou-se que essa otimização específica do tampão para a expressão linear do DNA é a chave para que os promotores nativos do σ70 produzam alta produção de proteínas sem suplementação de proteína GamS ou DNA Chi, evitando até mesmo a purificação dos produtos de PCR10. A concentração ótima de Mg-glu para a expressão linear do DNA foi semelhante à do DNA plasmídico. No entanto, a concentração ótima de K-glu mostrou uma diferença substancial entre o DNA linear e plasmídico, provavelmente devido a um mecanismo relacionado à transcrição10. A funcionalidade das proteínas expressas por esse método tem sido demonstrada para diversas aplicações, como a triagem rápida de interruptores de dedo do pé e a avaliação da atividade de variantes enzimáticas10.
Este protocolo fornece uma solução simples, eficiente e econômica para o uso de modelos lineares de DNA em sistemas livres de células de E. coli simplesmente usando extratos de células ΔrecBCD mutantes e calibração específica para DNA linear como modelo.

<table><tbody><tr><td>Caldo 2-YT</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>tubos Safe-Lock de 1,5 mL</td><td>Microtubo Eppendorf</td><td>30120086</td> Microplaca de fundo quadrado de 384 <td>mL de 1,5 mL</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Ácido fosfoglicérico dissódico)</td><td>Selo de placa adesiva Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Ágar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina 5'-trifosfato dissódico sal hidratado)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 e Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenosina 3' 5'-monofosfato cíclico)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (hidrato de coenzima A)</td>Tubos de centrífuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL PP, rack embalado com tampa CentriStar, tubo estéril</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Corning 50 mL PP, fundo cônico com tampa CentriStar, tubo estéril</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>CTP (citidina 5'-trifosfato, sal dissódico hidrato)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiotreitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico (ácido folínico sólido sal de cálcio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosina 5?-Trifosfato,&nbsp; Sal Dissódico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K fosfato dibásico (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K fosfato monobásico (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unidade de Filtro de Seringa, 0.22 &micro; m, filtro de membrana de polietersulfona</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 &micro; m</td></tr><tr><td>PCR monarca e Kit de limpeza de DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR e Kit de limpeza de DNA</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Plasmid Miniprep</td></tr><tr><td>Kit NAD (B-nicotinamida adenina dinucleotídeo hydrate)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NIST-rastreável FITC padrão</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plasmid Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>leitor de placas</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Proteína EGFP Recombinante Purificada</td><td>Cromotek</td><td>egfp-250</td><td>eGFP recombinante</td></tr><tr><td>Q5 Alta Fidelidade 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA polimerase</td></tr><tr><td>Q5 Alta Fidelidade 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA polimerase</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de ensaio</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>ensaio fluorométrico com corante de ligação ao DNA</td></tr><tr><td>RTS Amostrador de Aminoácidos</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td> estéril <td>Água purificada do sistema Millipore RiOs 8, esterilizada por autoclavagem.</td></tr><tr><td>Produtos de ciências da vida</td> <td>à base de Tris</td> Cytiva <td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Processador ultrassônico Vibra cell VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>sonicator</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridina 5'- trifosfato, sal trissódico hidratado)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Água, água sem nuclease</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>sem nuclease</td></tr></tbody></table>

síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de dna

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) tornou-se recentemente muito popular no campo da biologia sintética devido às suas inúmeras vantagens. O uso de modelos lineares de DNA para CFPS permitirá que a tecnologia atinja todo o seu potencial, diminuindo o tempo experimental, eliminando as etapas de clonagem, transformação e extração de plasmídeos. O DNA linear pode ser rápida e facilmente amplificado por PCR para obter altas concentrações do molde, evitando potencial toxicidade de expressão in vivo. No entanto, os modelos lineares de DNA são rapidamente degradados por exonucleases que estão naturalmente presentes nos extratos celulares. Existem várias estratégias que têm sido propostas para enfrentar este problema, tais como a adição de inibidores de nuclease ou modificação química de extremidades lineares de DNA para proteção. Todas essas estratégias custam tempo e recursos extras e ainda não obtiveram níveis quase plasmídicos de expressão proteica. Um protocolo detalhado para uma estratégia alternativa é apresentado aqui para o uso de modelos de DNA linear para CFPS. Usando extratos celulares de células nocauteadoras deficientes em exonuclease, os modelos lineares de DNA permanecem intactos sem a necessidade de modificações finais. Apresentamos as etapas de preparação do lisado celular da cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lise sonicação e calibração tampão para Mg-glutamato (Mg-glu) e K-glutamato (K-glu) especificamente para DNA linear. Este método é capaz de atingir níveis de expressão de proteínas comparáveis aos do DNA plasmídico em E. coli CFPS.

Resultados representativos são mostrados aqui após a calibração do lisado para os níveis ideais de Mg-glutamato e K-glutamato separadamente para DNA linear e plasmidial (Figura 1). A concentração ótima de Mg-glutamato é semelhante entre os extratos Δ recB e ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). No entanto, a concentração ótima de K-glutamato para o DNA plasmídico é de 140 mM, enquanto a concentração ótima de K-glutamato para o DNA linear para o mesmo ext...

Apresenta-se aqui um protocolo para a preparação e calibração tampão de extratos celulares de cepas knockout de exonuclease V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Esta é uma abordagem rápida, fácil e direta para a expressão em sistemas de síntese de proteínas livres de células usando modelos lineares de DNA.

Síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de DNA

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

O protocolo é muito significativo porque permite o uso rápido, fácil e direto de modelos lineares de DNA em sistemas de síntese de proteínas livres de células, mesmo a partir de parâmetros nativos de E.coli. As principais vantagens são a quantidade de tempo economizada ao evitar a clonagem, modificações químicas de extremidades lineares de DNA e suplementos protetores como DNA gama ou chi. Como os extratos de síntese de autorrelato estão sendo desenvolvidos para diferentes organismos de interesse, nosso método apresenta uma maneira de acelerar a prototipagem nesses extratos usando DNA linear.Para começar, estique BL21 Rosetta-2 delta recBCD de menos 80 graus Celsius glicerol em uma placa de ágar YTP 2x que contém 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, inocular uma única colônia da placa de ágar em um pouco mais de 40 mililitros de 2x YTP suplementados com 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com agitação de 200 RPM. Em seguida, faça uma subcultura diluindo a cultura noturna 100 vezes em quatro litros de meio YTP fresco 2x contendo 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol.Divida os quatro litros do meio em quatro frascos separados. Incubar a 37 graus Celsius, 200 RPM, por cerca de três a quatro horas de crescimento para atingir uma densidade óptica de 1,5 a 2,0. Coloque a cultura no gelo, gire as células a 5.000 G por 12 minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o sobrenadante por decantação.Em seguida, ressuspeite os pellets de células em 800 mililitros de S30A refrigerado com TDT. Novamente, gire as células a 5.000 G por 12 minutos a quatro graus Celsius, como demonstrado anteriormente, e descarte o sobrenadante por decantação. Depois de ressuspender os pellets de células em 160 mililitros de S30A refrigerado com TDT, transfira as células para tubos refrigerados e pré-pesados de 50 mililitros.Gire as células a 2000 G por oito minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o sobrenadante por decantação. Novamente, gire as células a 2000 G por quatro minutos a quatro graus Celsius e, em seguida, remova o sobrenadante restante cuidadosamente usando uma pipeta. Em seguida, remeça o peso do tubo para calcular o peso do pellet celular e mantenha os pellets de célula a menos 80 graus Celsius.Depois de tomar os pellets de célula de menos 80 graus Celsius, descongele-os no gelo por uma a duas horas e ressuspenda os pellets de célula em 0,9 mililitros de S30A com tampão TDT por grama do peso do pellet celular. Em seguida, pipete lentamente para ressuspender as células, evitando a espuma superior, tanto quanto possível. Coloque alíquotas de um mililitro das células ressuspensas em microtubos de 1,5 mililitro e mantenha-as no gelo ou em um bloco frio pré-resfriado a quatro graus Celsius.Em seguida, sonicate cada tubo em um sonicator com uma configuração de 20% de amplitude por três ciclos e gire para baixo o lisado a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de coletar o sobrenadante com uma pipeta, transfira para um tubo de 50 mililitros. Incubar o lisado celular a 37 graus Celsius a 200 RPM de agitação por 80 minutos.Depois de girar o lisado e coletar o sobrenadante em microtubos pré-resfriados de 1,5 mililitro, alíquota de 30 microlitros em tubos pré-resfriados de PCR 8 tiras, mantendo todos os tubos no gelo. Congelar rapidamente as alíquotas de lisado no gelo seco e armazenar a menos 80 graus Celsius. Prepare uma master mix de acordo com a guia de preparação do buffer, conforme descrito no manuscrito.Para um volume de reação de 10,5 microlitros, adicione 1,05 microlitro de diferentes concentrações de estoque de Mg-glutamato e 9,45 microlitros da mistura mestra e misture suavemente. Pipete 10 microlitros das reações acima em uma microplaca inferior quadrada de 384 poços e cubra-a usando um selo de placa adesiva. Meça a expressão gênica como saída de fluorescência registrando dados de fluorescência com um leitor de placas em intervalos regulares por oito horas de incubação a 30 graus Celsius com agitação orbital contínua a 307 ciclos por minuto.Depois de identificar a concentração de Mg-glutamato que resulta no maior valor de fluorescência no ponto final, prossiga para a calibração de K-glutamato. Execute o experimento e identifique o maior valor de fluorescência entre as concentrações de K-glutamato testadas, identificando assim a composição tampão ideal para Mg-glutamato e K-glutamato para este lisado. Uma vez estabelecidos os valores de Mg-glutamato e K-glutamato, preparar tubos de estoque da composição otimizada do tampão de acordo com o volume do lote obtido.Depois de calcular o número de tubos tampão necessários, alíquota 38 microlitros por tubo e armazenar a menos 80 graus Celsius. Primeiro, rotule um microtubo de 1,5 mililitro para a preparação ideal da mistura master. Adicione os volumes corretos do buffer e lisado e misture-os suavemente.Em seguida, pipete as amostras de DNA primeiro, seguido por água livre de nuclease e, finalmente, a mistura mestre ideal. Misture a reação sem células suavemente com uma pipeta antes de adicionar ao leitor de placas e evite bolhas. Depois de configurar as reações no leitor de placas, as corridas cinéticas registraram dados de fluorescência em intervalos regulares por oito horas de incubação a 30 graus Celsius com agitação orbital contínua a 307 ciclos por minuto.Após a calibração do lisado, a concentração ótima de Mg-glutamato foi semelhante em oito milimolares entre os extratos para DNA linear e plasmídico. No entanto, a concentração ideal de K-glutamato para o DNA plasmídico é de 140 milimolares, enquanto a concentração ótima de K-glutamato para o DNA linear é de 20 milimolares. Após as etapas de calibração, os níveis de expressões de GFP foram comparados entre o DNA linear e plasmidial nos extratos wild-type, delta recB e delta recBCD.A expressão de GFP do DNA linear atingiu 102% e 138% da expressão do DNA plasmídico em extratos das cepas delta recB e delta recBCD, respectivamente. As coisas mais importantes no protocolo são a lise de sonicação da célula e as etapas de calibração do tampão separadamente para o DNA linear e plasmídico, particularmente ao usar os parâmetros nativos. Essa técnica ajudaria a acelerar o teste de projetos biológicos em sistemas livres de células, por exemplo, a triagem de biossensores, enzimas e vias, ou prototipagem de circuitos genéticos sintéticos.

cell-free-protein-synthesis-from-exonuclease-deficient-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Expressão de proteína livre de células usando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão de proteínas livres de células bacterianas baseado em lisado bruto de Vibrio natriegens para realizar transcrição e tradução in vitro acopladas. Ele destaca a preparação de uma mistura mestre com componentes essenciais e a síntese passo a passo de proteínas funcionais a partir de um molde de DNA.

Expressão de proteína livre de células usando um extrato de células brutas bacterianas

Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Sistemas de expressão livre de célula são ferramentas poderosas e custo-eficiente para a síntese de alta produtividade e rastreio de proteínas importantes. Aqui, descrevemos a preparação do sistema de expressão de proteínas sem célula usando Vibrio natriegens para a produção de proteína rápida usando DNA Plasmideo DNA linear e do mRNA.

Proteína celular livre expressão usando o rapidamente crescendo bactéria Vibrio natriegens

Clonamos e analisamos genes de repórteres gerando RNAs circulares. Esses genes de repórter são maiores do que construções para analisar emendas lineares e conter elementos Alu. Para investigar os RNAs circulares, os construtos são transfeccionados em células e o RNA resultante é analisado usando RT-PCR após a remoção do RNA linear.

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

Este protocolo descreve um método rápido e simples para produzir lisenato bacteriano para expressão genética livre de células, usando uma cepa projetada de Escherichia coli e exigindo apenas equipamentos de laboratório padrão.

Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas

Partes genéticas bem caracterizadas são necessárias para o projeto de novos circuitos genéticos. Aqui descrevemos um método econômico e de alto rendimento para caracterizar rapidamente as partes genéticas. Nosso método reduz o custo e o tempo combinando lisatos livres de células, DNA linear para evitar a clonagem e manuseio de líquidos acústicos para aumentar o rendimento e reduzir os volumes de reação.

Caracterização Rápida de Partes Genéticas com Sistemas Livres de Células

Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.

De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células

Este protocolo descreve o sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) usado na construção de células sintéticas. Ele descreve os principais estágios com resultados representativos em diferentes microcompartimentos. O protocolo visa estabelecer as melhores práticas para diversos laboratórios na comunidade de células sintéticas, promovendo o progresso no desenvolvimento de células sintéticas.

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

Aprenda síntese de proteínas livre de células usando extratos de Escherichia coli deficientes em exonucleases e modelos lineares de DNA. Este método simplifica a prototipagem rápida em biotecnologia.

Síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de DNA (Vídeo) | JoVE Journal

Síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de DNA

Explorar mais vídeos