Name: Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a quantificar formação e extensão de D-loops durante recombinação homóloga em Saccharomyces cerevisiae usando ligadura de proximidade e PCR quantitativa. Esta técnica viabiliza o estudo de proteínas no metabolismo de D-loops.

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O trabalho no laboratório Heyer é apoiado pelas subvenções GM58015 e GM137751 a W.-D.H. A investigação no laboratório Piazza é apoiada pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC-StG 3D-loop, grande acordo 851006). A D.R. é apoiada pelo T32CA108459 e pela Fundação A.P. Giannini. Agradecemos a Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) por compartilhar seus resultados de ensaio DLC / DLE e por validar adicionalmente as alterações nos ensaios que são detalhadas neste protocolo.

1. Pré-crescimento, indução do DSB e coleta de amostras
NOTA: A suplementação de todos os meios com adenina a 0,01% é recomendada para cepas de Ade-.
<ol><li>Retire as estirpes haploides apropriadas (ver Tabela 1) na levedura peptona dextrose adenina (YPDA) (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, glicose a 2%, ágar a 2%, adenina a 0,001%) e cresça durante 2 dias a 30 °C.</li>
	<li>Use uma única colônia para inocular 5 mL de YPDA em um tubo de cultura de vidro de 15 mL. Cultivar culturas até à saturação a 30 °C com agitação ou rotação para aeração.</li>
	<li>Ensaio de DLC: Preparar a solução-mãe de psoraleno 5x (0,5 mg/mL de trioxsalen em etanol à prova de 200) em um exaustor dissolvendo psoraleno em um tubo cônico de 50 mL envolto em folha de alumínio durante a noite à temperatura ambiente com agitação contínua ou inversão. Sele o topo do parafuso com uma película transparente para evitar a evaporação. Não prepare mais de 7 ml de 5x solução de psoraleno por tubo cónico de 50 ml para garantir a dissolução adequada do psoraleno.</li>
	<li>No dia seguinte, use 5 mL da cultura YPDA cultivada durante a noite para inocular 50-100 mL de YEP-lactato (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, lactato a 2% p/m, adenina a 0,001%) em um frasco de tamanho apropriado (levedura em brotamento cresce otimamente em um frasco que é pelo menos 5x o volume da cultura) para um OD600 de ~0,03.</li>
	<li>Cultive a cultura por ~16 h a 30 °C com agitação a 220 rpm. Após ~16 h, meça o OD600 da cultura e deve ser ~0,5-0,8. Não use culturas sub ou cobertas de vegetação.</li>
	<li>Para cada ponto de tempo, colete o volume apropriado de células em um tubo cônico e coloque no gelo. Tipicamente, trata-se de 1 x 108 células (aproximadamente 7,5 mL de cultura em OD 600 1,0 para uma cepa haploide do tipo selvagem) para o ensaio DLC e 5 x 107 células (aproximadamente 2,5 mL de cultura em OD600 1,0) para o ensaio DLE.</li>
	<li>Para garantir a precisão dos valores de OD 600, prepare diluições de 1:5 para culturas com uma OD600≥0,2 para manter a leitura da OD em 0,2 ou abaixo. Para cepas do tipo selvagem, os pontos de tempo ideais para análise DLC estão entre 2 h e 6 h, e os pontos de tempo ideais para análise DLE estão entre 4 h e 8 h (ver Figura 3 e Figura 4).</li>
	<li>Ensaio DLC<ol><li>Antes de cada ponto de tempo, prepare uma solução suficiente de 1x psoraleno (0,1 mg/mL de trioxsaleno, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% de etanol) em um exaustor para todas as amostras em um tubo cônico de 50 mL envolto em folha. Saia na RT.</li>
		<li>Centrifugar as amostras a 2,500 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuscite o pellet em 2,5 mL de solução de psoraleno 1x em um exaustor e transfira para uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm. Alternativamente, ressuscite o pellet em 2,5 ml de solução TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) para um controlo sem reticulação.</li>
		<li>Cruze as amostras. Para um crosslinker UV com lâmpadas de ondas longas (365 nm), posicione as placas de Petri 1-2 cm abaixo da fonte de luz UV com a tampa removida no topo de uma placa de plástico ou plexiglass que tenha sido pré-resfriada a -20 ° C. Para uma caixa de luz UV, coloque as placas de Petri diretamente sobre a fonte de luz UV. Expor as amostras por 10 minutos com agitação suave. NOTA: Recomenda-se definir a fonte de luz UV no topo de um agitador orbital ajustado a ~ 50 rpm.</li>
		<li>Em um exaustor, transfira a amostra para um novo tubo de 15 mL. Lave a placa de Petri com 2,5 ml de solução de TE1 e adicione-a ao tubo. Centrifugar as amostras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar adequadamente o sobrenadante e armazenar o pellet a -20 °C. As amostras podem ser armazenadas até 1 semana antes de passar para o passo seguinte.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio DLE<ol><li>Centrifugar as amostras a 2,500 x g durante 5 min a 4 °C. Lave o pellet celular em 2,5 ml de solução fria de TE1 antes de repetir a rotação e armazenar os pellets a -20 °C. As amostras podem ser armazenadas por até 1 semana antes de passar para a próxima etapa.</li>
	</ol></li>
	<li>Para a coleta da amostra às 0 h, coletar as amostras antes da adição de 20% de galactose. Para os momentos subsequentes, induzir a formação de DSB adicionando 20% de galactose às culturas a uma concentração final de 2%. Coletar as amostras restantes, conforme descrito acima, pellet, e congelar em relação ao tempo pós-indução de DSB (ou seja, a amostra de 4 h é coletada 4 h após a adição de 20% de galactose).</li>
</ol>2. Restauração do local de esferolastização, lise e restrição celular
<ol><li>Descongele as amostras no gelo. Pré-aqueça um banho seco a 30 °C.</li>
	<li>Ressuspender as amostras em 1 mL de tampão esferoplaste (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, tampão fosfato de sódio 40 mM pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 3,5 μL de solução de zimloliase (glicose a 2%, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, 5 mg/mL de zimolyase 100T; concentração final de 17,5 μg/mL de zimloliase). Misture suavemente batendo ou inversão. Incubar a 30 °C durante 15 min e, em seguida, colocar sobre o gelo. Durante os 15 min de incubação, obtenha nitrogênio líquido ou gelo seco.</li>
	<li>Centrifugar durante 3 min a 2 500 x g a 4 °C e colocar as amostras sobre gelo. Lavar as amostras 3x em 1 ml de tampão esferoplastal. Centrifugar as amostras durante 3 minutos a 2.500 x g a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender as amostras em 1 mL de tampão enzimático frio de restrição 1x (acetato de potássio 50 mM, acetato de Tris de 20 mM, acetato de magnésio de 10 mM, pH BSA de 100 μg/mL ~8,0 no RT) e centrifugar por 3 min a 16.000 x g a 4 °C. Coloque as amostras no gelo. Repita a lavagem 1x.</li>
	<li>Ressuspender as amostras em 1 mL de tampão enzimático de restrição 1x frio. Divida a amostra (0,5 mL cada) em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar as amostras durante 3 minutos a 16.000 x g a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender um tubo de cada amostra em 180 μL de tampão enzimático de restrição de 1,4x com oligos hibridizantes (ver Tabela 2) e um tubo em 180 μL de tampão enzimático de restrição de 1,4x sem oligos hibridizantes. Cada oligo hibridizante é ressuspenso em 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) e utilizado a uma concentração final de 7 nM. O 1x TE substitui os oligos hibridizantes no tampão enzimático de restrição 1,4x sem oligos hibridizantes. NOTA: Os oligos hibridizantes devem ser armazenados a -20 °C em pequenas alíquotas na diluição de trabalho. A concentração dos oligos hibridizantes pode exigir otimização; veja Discussão.</li>
	<li>Congelar rapidamente as amostras em azoto líquido ou gelo/etanol seco e conservar a -80 °C. As amostras podem ser armazenadas nesta fase por vários meses.</li>
</ol>3. Digestão enzimática de restrição e ligadura intramolecular
<ol><li>Descongele as amostras no gelo. Pré-aqueça um banho seco a 65 °C e outro a 37 °C.</li>
	<li>Pipetar 36 μL da amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL no gelo. Devolver imediatamente a amostra restante a -80 °C para armazenamento.</li>
	<li>Adicionar 4 μL de 1% de SDS (concentração final de 0,1%) e misturar batendo suavemente no lado do tubo. Incubar a 65 °C durante 15 minutos com batidas suaves a cada 5 minutos. Coloque as amostras no gelo imediatamente após a incubação. NOTA: Este tratamento SDS promove a desnaturação de proteínas associadas ao DNA, solubilização do envelope nuclear e acessibilidade à cromatina antes das etapas de digestão da enzima de restrição e ligadura intramolecular.</li>
	<li>Adicionar 4,5 μL de Triton X-100 a 10% (concentração final de 1%) e misturar por pipetagem. Adicionar 20-50 U de enzima de restrição (EcoRI-HF ou HindIII-HF) a cada amostra e incubar a 37 °C durante 1 h com agitação suave a cada 20-30 min. Durante este tempo, pré-aqueça um banho seco a 55 °C e predefina um banho-maria a 16 °C.</li>
	<li>Adicionar 8,6 μL de SDS a 10% (concentração final de 1,5%) a cada amostra e misturar por pipetagem e batimento. Incubar a 55 °C durante 10 min. Adicionar 80 μL de Triton X-100 a 10% (concentração final de 6%) a cada amostra e misturar por pipetagem.</li>
	<li>Adicionar 660 μL de tampão de ligadura 1x sem ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligase (8 U/amostra) a cada amostra e misturar por inversão suave. Incubar a 16 °C durante 1,5 h com inversão a cada 30 min. Coloque as amostras no gelo imediatamente após a incubação.</li>
</ol>4. Purificação do DNA
<ol><li>Pré-aqueça um banho seco a 65 °C e outro a 37 °C. Adicionar 1 μL de 10 mg/ml de proteinase K (preparado em 1x TE pH 8,0) a cada amostra (concentração final de 12,5 μg/ml). Incubar a 65 °C durante 30 min e colocar as amostras no gelo imediatamente a seguir à incubação até que tenham arrefecido.</li>
	<li>Transfira as amostras para tubos de 2 mL. Trabalhando em um exaustor, adicione um volume igual (~800 μL) de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (P/C/IA; pH 8,0) a cada amostra. Vórtice as amostras por ~30 s e centrifugar as amostras por 5-10 min a 16.000 x g em uma microcentrífuga.</li>
	<li>Remova cuidadosamente 600 μL da fase superior de cada amostra para um novo tubo de 1,5 mL. Descarte corretamente a fase inferior e os tubos de 2 mL.</li>
	<li>Precipitar o ADN adicionando um volume de 1/10 de 3 M de acetato de sódio pH 5,2 (~60 μL) a cada amostra, seguido de 1 volume de isopropanol (~660 μL). Inverter as amostras 5x-10x e incubar em RT por 30 min.</li>
	<li>Colocar as amostras no gelo durante 2 min e, em seguida, centrifugar as amostras a 16.500 x g durante 15 min a 4 °C numa microcentrífuga. Devolva as amostras ao gelo, despeje o sobrenadante e escorra o tubo em uma toalha de papel.</li>
	<li>Lave o pellet de DNA com 200 μL de etanol a 70%. Centrifugar a 16.500 x g durante 3 min a 4 °C, colocar as amostras de novo no gelo, despejar o sobrenadante e remover o álcool residual com um pipeta. Secar as amostras com as tampas dos tubos abertas a 37 °C durante 15-20 min.</li>
	<li>Ressuspeite os pellets de DNA em 50 μL de 1x TE por vórtice. Incubar no RT por 30 min, vórtice, e depois incubar a 37 °C em banho seco por 30 min. Vórtice as amostras novamente e, em seguida, coloque-as no gelo. As amostras podem ser armazenadas nesta fase a -20 °C durante vários meses, mas é aconselhável proceder imediatamente para as etapas de descrosslinking (apenas DLC) e qPCR.</li>
</ol>5. Reversão de crosslink de psoraleno (apenas para ensaio DLC)
<ol><li>Pipetar 9 μL de DNA purificado em um tubo de PCR no gelo. Adicionar 1 μL de 1 M KOH (concentração final de 0,1 M). Incubar as amostras a 90 °C durante 30 min num termociclador.</li>
	<li>Adicionar 19,73 μL de solução de acetato de sódio (0,1 M acetato de sódio, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). As amostras podem ser armazenadas nesta fase a -20 °C durante vários meses, mas é aconselhável prosseguir imediatamente para a etapa de qPCR.</li>
</ol>6. PCR quantitativo, controles e análise
<ol><li>Usando 2 μL de DNA purificado, com ou sem reticulação, configure uma reação qPCR de 20 μL de acordo com as instruções do fabricante. Configure cada reação em duplicata. Para os ensaios DLC e DLE, existem cinco reações de controle e uma reação de quantificação DLC/DLE, ou um total de seis reações por amostra, executadas em duplicata. A Tabela Suplementar S1 e a Tabela Suplementar S2 fornecem um modelo para configurar essas reações e análises, e as sequências dos primers qPCR estão listadas na Tabela 3.</li>
	<li>As condições de ciclo de qPCR precisam ser otimizadas para cada kit de qPCR.<ol><li>Utilizar as seguintes condições de qPCR DLC, dependendo dos kits de qPCR utilizados: desnaturação inicial (95 °C durante 3 min); 50 rodadas de amplificação (95 °C para 15 s, 61 °C para 25 s, 72 °C para 15 s com uma única aquisição); análise da curva de fusão (95 °C para 5 s, 65 °C para 1 min, 97 °C com aquisição contínua); e resfriamento (37 °C por 30 s).</li>
		<li>Utilizar as seguintes condições de qPCR para o ensaio DLE: desnaturação inicial (95 °C durante 5 min); 50 rodadas de amplificação (95 °C para 15 s, 60 °C para 30 s, 72 °C para 15 s com uma única aquisição); análise da curva de fusão (95 °C para 5 s, 65 °C para 1 min, 97 °C com aquisição contínua); e resfriamento (37 °C por 30 s). Observe que a otimização para diferentes máquinas/kits de qPCR pode ser necessária.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio DLC<ol><li>Controles: Veja a lista de iniciadores qPCR na Tabela 3. Um mapa dos locais de ligação do primer é mostrado na Figura S1. Para obter arquivos de sequência suplementares para as características genômicas relevantes e amplificadores, verifique os arquivos A plasmid Editor (ApE); Arquivos de sequência suplementares 1-5.<ol><li>DNA genômico no ARG4: Use olWDH1760/olWDH1761 para amplificar o dsDNA localizado no ARG4. Use essa reação como um controle de carga e normalize todas as outras reações, exceto a reação de sinal DLC a esse controle.</li>
			<li>Eficiência da ligadura intramolecular na DAP2: Use o fragmento de 1.904 pb criado pela digestão EcoRI para ligadura intramolecular em paralelo com a ligadura DLC. A amplificação através desta junção de ligadura relata a eficiência da ligadura intramolecular e serve como um controle para o qual o sinal DLC é normalizado.</li>
			<li>Indução de DSB: Use olWDH1766/olWDH1767 para amplificar uma região que abrange o DSB induzido.</li>
			<li>Psoralen crosslinking and resection: Use olWDH2019/olWDH2020 para amplificar a região PhiX exclusiva a jusante do site de reconhecimento EcoRI. Sem reversão de reticulação, use a razão entre o ssDNA (sem reticulação) sobre o ARG4 (dsDNA reticulado) para determinar a eficiência da reticulação. Com a reversão de reticulação, a ressecção levará a uma diminuição progressiva de 1 para 0,5 do sinal em relação ao ARG4.</li>
			<li>EcoR I restauração e corte do local de reconhecimento: Use olWDH1768/olWDH1764 para amplificar uma região que abrange o local de reconhecimento EcoRI restaurado a montante do DSB na vertente ressecada. olWDH1769/olWDH1763 amplificam uma região que abrange o local da enzima de restrição EcoRI na DAP2. Realizar a clivagem EcoRI neste local para usar como controle de ligadura intramolecular.</li>
		</ol></li>
		<li>Sinal DLC: Use olWDH1764/olWDH1765 para amplificar a molécula de DNA quimérica criada pela ligadura intramolecular da fita ressecada (invasora) e do doador.</li>
		<li>Análise: Calcular a média e o desvio padrão dos valores de Cp para cada uma das reações duplicadas. Use os valores de Cp qPCR do DNA genômico ARG4 como referência para normalizar todas as outras qPCRs de controle. Normalizar o sinal de DLC para o controle da ligadura intramolecular na DAP2. Consulte a Figura 3 para valores típicos de sinal DLC em 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio DLE<ol><li>Controles: Veja a lista de iniciadores qPCR na Tabela 3. Um mapa dos locais de ligação do primer é mostrado na Figura S1. Para obter arquivos de sequência suplementares para os recursos genômicos relevantes e amplificadores, verifique os arquivos A plasmid Editor (ApE) (Arquivos de Sequência Suplementar 1-5).<ol><li>ADN genómico no ARG4: Ver secção 6.3.1.1.</li>
			<li>Eficiência de ligadura intramolecular em YLR050C: Use a digestão HindIII para criar um fragmento de 765 pb que sofrerá ligadura intramolecular em paralelo com a ligadura DLE. A amplificação através desta junção de ligadura relata a eficiência da ligadura intramolecular e serve como um controle para o qual o sinal DLE é normalizado.</li>
			<li>Indução DSB: Ver secção 6.3.1.3.</li>
			<li>Corça III restauração e corte do local de reconhecimento: Use olWDH2010/olWDH2012 e olWDH2009/2011 para amplificar uma região que abrange os locais da enzima de restrição HindIII na fita quebrada onde foi ressecada e estendida, respectivamente.</li>
		</ol></li>
		<li>Sinal DLE: Use olWDH2009/olWDH2010 para amplificar a molécula de DNA quimérico criada pela ligadura intramolecular da extremidade ressecada da cadeia invasora a montante do DSB até a extremidade recém-estendida a jusante do DSB.</li>
		<li>Análise: Calcular a média e o desvio padrão dos valores de Cp para cada uma das reações duplicadas. Use os valores de Cp qPCR do DNA genômico ARG4 como referência para normalizar todas as outras qPCRs de controle. Normalizar o sinal DLE para o controle da ligadura intramolecular em YLR050C. Os valores típicos do sinal DLE às 6 h estão relatados na Figura 4 e em publicações anteriores9.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li>
<li>Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os ensaios apresentados permitem a detecção de alças D nascentes e estendidas (ensaio DLC), extensão D-loop (ensaio DLE) e formação de produtos BIR (ensaio DLE sem oligonucleotídeos hibridizantes) usando ligadura de proximidade e qPCR. O ChIP-qPCR do Rad51 para locais distantes do DSB já foi usado anteriormente como proxy para a busca de homologia mediada pelo Rad51 e a formação de D-loop. No entanto, esse sinal ChIP-qPCR é independente da homologia de sequência entre o local de ruptura e um potencial doador, bem como do...

A recombinação homóloga (FC) é um mecanismo de alta fidelidade de reparo de quebras de fita dupla (DSBs) de DNA, ligações cruzadas entre fitas e lacunas de ssDNA, bem como um caminho para a tolerância a danos ao DNA. A FC difere das vias propensas a erros para reparo/tolerância a danos no DNA, como a junção final não homóloga (NHEJ) e a síntese translesão, na medida em que utiliza um DNA duplex homólogo intacto como doador para modelar o evento de reparo. Além disso, muitos dos principais intermediários na via da FC são reversíveis, permitindo uma regulação requintada das etapas individuais da via. Durante as fases S, G2 e M do ciclo celular, a HR compete com a NHEJ pelo reparo dos DSBs 1 de duasextremidades. Além disso, a FC é essencial para a replicação do DNA para o reparo de danos ao DNA associados à replicação, incluindo lacunas de ssDNA e DSBs unilaterais, e como um mecanismo de bypass de lesão de DNA2.
Um intermediário crítico na via HR é o loop de deslocamento, ou D-loop (Figura 1). Após a ressecção final, a recombinase central na reação, Rad51, carrega no ssDNA recém-ressecado da molécula quebrada, formando um filamento helicoidal2. Rad51 então realiza uma pesquisa de homologia para identificar um doador homólogo adequado, tipicamente a cromátide irmã em células somáticas. A alça D é formada quando o filamento Rad51-ssDNA invade um DNA duplex homólogo, o que leva ao emparelhamento de bases Watson-Crick da fita quebrada com a fita complementar do doador, deslocando a fita doadora oposta. A extensão da extremidade 3' da fita quebrada por uma DNA polimerase substitui as bases que foram perdidas durante o evento de dano ao DNA e promove a resolução do intermediário estendido D-loop em um produto dsDNA através do recozimento de fita dependente de síntese (SDSA), da junção de Holliday duplo (dHJ) ou das subvias HR de replicação induzida por quebra (BIR).
Ensaios que monitoram fisicamente os intermediários na via de FC permitem a análise dos requisitos genéticos para cada etapa (ou seja, análise de via). A formação de DSB, ressecção final, dHJs, bolhas de replicação BIR e produtos HR são prontamente observados pelo Southern blotting 3,4,5,6,7. No entanto, o Southern blotting não relata alças D nascentes e estendidas e, portanto, é necessário um método alternativo para medir de forma confiável essas moléculas articulares 4,8,9. Uma estratégia amplamente utilizada para analisar a formação nascente de alça D é a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) de Rad51 juntamente com a PCR quantitativa (qPCR)10,11. Entretanto, a associação de Rad51 com dsDNA medida por ChIP-qPCR é independente da homologia de sequência e do fator acessório Rad51 Rad5410,11. Em contraste, um sinal apreciável usando o método de análise de loop D aqui apresentado, chamado de ensaio de captura de loop D (DLC), depende da formação de DSB, homologia de sequência, Rad51 e das proteínas acessórias Rad51 Rad52 e Rad548. O achado de que a formação de D-loop promovida por Saccharomyces cerevisiae Rad51 depende do Rad54 in vivo está de acordo com numerosos experimentos de reconstituição in vitro, indicando que o Rad54 é necessário para a busca de homologia e a formação de alça D pela levedura Rad51 8,12,13,14,15.
As abordagens atuais para medir a extensão do D-loop, principalmente por meio de PCR semiquantitativa, são igualmente problemáticas. Um ensaio típico baseado em PCR para detectar a extensão da alça D amplifica uma sequência única, resultante da recombinação entre um local de ruptura e um doador ectópico e a subsequente síntese de DNA associada à recombinação, através de um primer a montante da região de homologia na fita quebrada e outro primer a jusante da região de homologia na cadeia doadora. Utilizando esse método, a detecção da síntese de DNA associada à recombinação requer o fator de processividade não essencial Pol δ Pol3216. Esse achado entra em conflito com a observação de que a deleção do POL32 tem apenas um efeito leve na conversão gênica in vivo17. Além disso, esses ensaios baseados em PCR não conseguem resolver temporalmente a extensão da alça D e a formação de produtos BIR, sugerindo que o sinal resulta de produtos de dsDNA e não de intermediários de ssDNA17,18,19. O ensaio de extensão D-loop (DLE) foi recentemente desenvolvido para abordar essas discrepâncias. O ensaio DLE quantifica a síntese de DNA associada à recombinação em um local ~ 400 pares de bases (pb) a jusante do final inicial de 3' invasor9. Por este método, a extensão D-loop é independente do Pol32 e é detectável dentro de 4 h após a indução DSB, enquanto os produtos BIR são observados pela primeira vez às 6 h. De fato, uma publicação recente dos laboratórios Haber e Malkova observou que o uso desse método de preparação de DNA genômico resulta singularmente na preservação do ssDNA 9,20.
Aqui, os ensaios DLC e DLE são descritos em detalhes. Esses ensaios dependem da ligadura de proximidade para detectar alças D nascentes e estendidas em S. cerevisiae (Figura 2)8,9. Os produtos BIR podem ser quantificados usando este mesmo sistema de ensaio. Para ambos os ensaios, a formação de DSB em um local de corte de endonuclease HO localizado no locus URA3 no cromossomo (Chr.) V é induzida pela expressão da endonuclease HO sob o controle de um promotor induzível por galactose. A invasão da cadeia de DNA mediada por Rad51 leva à formação nascente de alça D no local de um doador ectópico localizado no locus LYS2 em Chr. II. Como o lado direito do DSB não tem homologia com o doador, o reparo via formação de SDSA e dHJ não é viável. O reparo inicial do DSB por BIR é possível, mas a formação de produtos viáveis é inibida pela presença do centrômero21. Esse projeto deliberado impede o reparo produtivo do DSB, evitando assim a retomada do crescimento por células com DBSs reparados, que de outra forma poderiam ultrapassar a cultura durante a análise do curso de tempo.
No ensaio DLC, a reticulação psoralênica das duas cadeias do DNA heteroduplex dentro da alça D preserva o intermediário de recombinação. Após a restauração do sítio enzimático de restrição na fita quebrada (ressecada) e digestão, a reticulação permite a ligadura das sequências únicas a montante dos DNAs homólogos quebrados e doadores. Usando qPCR, o nível de molécula de DNA quimérico presente em cada amostra é quantificado. No ensaio DLE, a reticulação não é necessária, e a restauração e digestão do sítio da enzima de restrição, seguidas de ligadura intramolecular, ligam a extremidade 5' da molécula quebrada à extremidade 3' recém-estendida. Novamente, qPCR é usado para quantificar as quantidades relativas deste produto quimérico em cada amostra. Na ausência de restauração do sítio da enzima de restrição, o ensaio DLE relata os níveis relativos do produto BIR (dsDNA) que é formado após a extensão da alça D.
Resultados representativos para cada ensaio utilizando uma cepa do tipo selvagem são mostrados, e os leitores são encaminhados para Piazza et al.8 e Piazza et al.9 para o uso desses ensaios para a análise de mutantes de recombinação 8,9. A intenção desta contribuição é permitir que outros laboratórios adotem os ensaios DLC e DLE, e o suporte para eles está disponível mediante solicitação.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Pré-crescimento, indução de DSB e coleta de amostras</forte><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 e 50 mL tubos</td><td></td><td></td><td></td>cônicos</tr><tr><td>de 15 mL frascos</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>250 mL, 500 mL ou 1 L Placas</td> de Petri opticamente transparentes <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 60 mm x 15 mm com fundo</td><td></td> plano<td></td><td>Sugerido: Corning, número de catálogo 430166; ou Genesee Scientific, número de catálogo 32-150G</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada com adaptadores</td><td></td><td></td><td></td>de tubo cônico de 15 e 50 mL</tr><tr><td>Agitador orbital de bancada ou rotador/revólver</td><td></td><td></td><td></td>de tubo</tr><tr><td>Rotador Reticulador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV ou caixa de luz com lâmpadas UV de 365 nm colocadas sobre um agitador</td><td></td><td></td> <td>orbitalSugerido: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) ou Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, número de catálogo 611110831</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% p/p xarope de DL-lactato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1375</td><td>Para preparação de meios</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423500</td><td>Para preparação de meios</td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD Difco</td><td>211840</td><td>Para preparação de meios</td></tr><tr><td>Extrato de levedura bacto</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td>Para preparação de meios</td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>BD Difco</td><td>0155-17-4</td><td>Para preparação de meios</td></tr><tr><td>Trioxsalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137</td><td>Para reticulação de psoraleno</td></tr><tr><td><forte>2. Restauração do local da enzima de esferoplastagem, lise e restrição</forte><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forte>Suprimentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Banho</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Nitrogênio líquido ou gelo seco/etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga ou microcentrífuga</td> <td>refrigerada</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X tampão de enzima de restrição (CutSmart) (500 mM de acetato de potássio, 200 mM de Tris-acetato, 100 mM de acetato de magnésio, 1 mg/mL de BSA, pH 7,8-8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>US Biological</td><td>Z1004</td><td>Para esferoplastação</td></tr><tr><td><forte>3. Digestão enzimática de restrição e ligação intramolecular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suprimentosbanho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101</td><td>Digestão enzimática de restrição para ensaio DLC</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104</td><td>Digestão enzimática de restrição para</td></tr> ensaio <tr><td>DLE T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligação intramolecular</td></tr><tr><td><forte>4. Purificação de DNA</forte><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forte>Suprimentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Tubos <td></td><td></td><td></td>de <td>microcentrífuga de 1,5 e 2 mL</td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (P/C/IA) a 25:24:1</td><td>Purificação</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de DNA Sigma-Aldrich P2069<forte>5. Reversão de reticulação de psoraleno</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Suprimentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclador/máquina</td><td></td><td></td><td></td> de PCR</tr><tr><td><forte>6. qPCR<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>Máquina de qPCR usada pelos autores</td></tr><tr><td>Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>máquina de qPCR usada pelos autores</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Placa de 96 poços, placas brancas</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>96 poços para qPCR</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>kit de qPCR usado pelos autores</td></tr><tr><td>SYBR Green I Master Mix</td><td>Kit</td><td>Roche 4707516001</td><td>qPCR usado pelos autores</td></tr></tbody></table>

detecção de intermediários de recombinação homóloga via ligadura de proximidade e pcr quantitativa em saccharomyces cerevisiae

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

Os danos ao DNA, incluindo quebras de fita dupla do DNA e ligações cruzadas entre fitas, incorridos durante as fases S e G2 do ciclo celular podem ser reparados por recombinação homóloga (HR). Além disso, o RH representa um importante mecanismo de resgate de fork de replicação após estol ou colapso. A regulação dos muitos passos reversíveis e irreversíveis desta complexa via promove a sua fidelidade. A análise física dos intermediários de recombinação formados durante a FC possibilita a caracterização desses controles por diversos fatores nucleoproteicos e seus interatores. Embora existam métodos bem estabelecidos para testar eventos específicos e intermediários na via de recombinação, a detecção de formação e extensão de alça D, duas etapas críticas nessa via, provou ser desafiadora até recentemente. Aqui, métodos eficientes para detectar eventos-chave na via HR, ou seja, formação de quebra de fita dupla de DNA, formação de alça D, extensão de alça D e formação de produtos via replicação induzida por quebra (BIR) em Saccharomyces cerevisiae são descritos . Esses ensaios detectam seus intermediários de recombinação relevantes e produtos com alta sensibilidade e são independentes da viabilidade celular. A detecção de D-loops, extensão D-loop e o produto BIR é baseada na ligadura de proximidade. Juntos, esses ensaios permitem o estudo da cinética da FC no nível da população para abordar finamente as funções das proteínas e reguladores da FC em etapas significativas na via.

Ensaio DLC O ensaio DLC detecta loops D nascentes e estendidos formados pela invasão de um DSB site-specific em um único doador (Figura 2). A reticulação de psoraleno liga fisicamente a fita quebrada e o doador através do DNA heteroduplex dentro da alça D. A restauração do sítio enzimático de restrição com um oligo longo e hibridizante na fita ressecada da ruptura permite a clivagem enzimática de restrição, seguida de ligadura da fita quebrada ao doador proximal ...

Os ensaios de captura de loop D (DLC) e extensão de loop D (DLE) utilizam o princípio da ligadura de proximidade juntamente com a PCR quantitativa para quantificar a formação de D-loop, a extensão de D-loop e a formação de produtos no local de uma ruptura induzível de fita dupla em Saccharomyces cerevisiae.

Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Os ensaios de captura e extensão do D-loop são os primeiros a permitir a quantificação imparcial e direta das etapas de formação e extensão do D-loop durante a recombinação homóloga em células de levedura de crescimento mitoticamente. Esta técnica independente de viabilidade permite o estudo de proteínas no metabolismo da alça D que de outra forma não seriam possíveis de se desvencilhar de papéis posteriores, apenas olhando para os produtos BIR. No futuro, imaginamos a transição desses ensaios para células humanas para entender melhor o papel das proteínas-chave, incluindo o BRCA2 e os casos de bloom e Warner kilo na recombinação homóloga.Comece centrifugando as amostras por cinco minutos. Ressuscite o pellet em 2,5 mililitros de solução de 1x psoraleno e transfira-o para uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Para nenhum controle de reticulação, ressuspenda o pellet em 2,5 mililitros da solução TE1.Em seguida, defina a fonte de luz UV na parte superior do agitador orbital, ajustado em 50 RPM. Para reticular as amostras usando um reticulante UV com lâmpadas de ondas longas de 365 nanômetros. Posicione as placas de Petri um a dois centímetros abaixo da fonte de luz UV por 10 minutos com agitação suave em uma placa de plástico ou plexiglass pré-resfriada.Em seguida, transfira a amostra para um novo tubo de 15 mililitros. Lave a placa de Petri com 2,5 mililitros de solução de TE1 e adicione-a ao tubo. Centrifugar as amostras durante cinco minutos.Descarte o sobrenadante e armazene o pellet a menos 20 graus Celsius. Coloque as amostras no gelo para descongelamento. Simultaneamente, pré-aqueça um banho seco a 30 graus Celsius.Ressuspeite as amostras em um mililitro de tampão de esferoplaste e transfira-as para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 3,5 microlitros de solução de zimóliase e misture suavemente batendo. Incubar a 30 graus Celsius por 15 minutos.E então coloque os tubos no gelo. Centrifugar durante três minutos e colocar as amostras no gelo. Lavar as amostras três vezes em um tampão de esferoplaste mililitro e centrifugar as amostras por três minutos.Ressuspenda as amostras em um mililitro de tampão enzimático de restrição a frio. Centrifugar durante três minutos e colocar as amostras no gelo. Repita a lavagem uma vez.Ressuspenda as amostras em um mililitro de tampão enzimático de restrição frio 1x. Divida a amostra igualmente em duas. Centrifugar as amostras durante três minutos a 16 000 G a quatro graus Celsius.Ressuspender um tubo de cada amostra em 180 microlitros de tampão enzimático de restrição de 1,4x com oligos hibridizantes e outro tubo em 180 microlitros de tampão enzimático de restrição de 1,4x sem oligos hibridizantes. Congelar as amostras em nitrogênio líquido. Descongele as amostras no gelo.Pré-aqueça um banho seco a 65 e outro a 37 graus Celsius. Aliquota 36 microlitros da amostra em um novo tubo de microcentrífuga e quatro microlitros de 1%SDS e misturado batendo suavemente no lado do tubo. Incube a 65 graus Celsius por 15 minutos com batidas suaves a cada cinco minutos.Coloque as amostras no gelo imediatamente após a incubação. Adicione 4,5 microlitros de 10%Triton X-100 e misture por pipetagem. Adicione 20 a 50 unidades de enzima de restrição EcoR1 ou HindIII de alta fidelidade a cada amostra.E incubar a 37 graus Celsius por uma hora com agitação suave a cada 20 a 30 minutos. Durante este tempo, banho seco pré-aquecido a 55 graus Celsius e um banho de água a 16 graus Celsius. Adicione 8,6 microlitros de 10% SDS a cada amostra e misture pipetando e batendo.Incubar a 55 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 80 microlitros de 10%Triton X-100 a cada amostra e misture por pipetagem. Adicione 660 microlitros de tampão de ligadura 1x sem ATP, um ATP milimolar a pH 8,0 e oito unidades de ligase de DNA T4 a cada amostra e misture suavemente por inversão.Incubar 16 graus Celsius por 1,5 horas com uma inversão a cada 30 minutos. Coloque as amostras no gelo imediatamente após a incubação. Após a purificação do DNA, conforme descrito no protocolo, use dois microlitros de DNA purificado para configurar uma reação qPCR de 20 microlitros de acordo com as instruções do fabricante.Para cada amostra, configure cinco reações de controle e uma reação de quantificação e execute-as em duplicata. A análise do ensaio de DLC duas horas após a quebra de fita dupla ou indução de DSB mostrou que a reticulação do psoraleno é crítica e a eficiência depende do tempo entre a coleta da amostra e a qPCR. Os valores de Cp ARG4 foram semelhantes entre as amostras reticuladas, mas menores para a amostra sem reticulação, uma vez que o DNA sem ligações cruzadas amplifica de forma mais eficiente.Para todas as amostras, o controle de qPCR da ligadura intermolecular estava dentro da faixa. A indução robusta de DSB foi evidenciada por um sinal de baixa qPCR para o controle que se amplifica em todo o local de reconhecimento da endonuclease HO. Resultados semelhantes foram observados para o controle de qPCR EcoR1.O sinal de DLC com oligo hibridizante foi calculado normalizando para o controle da ligadura intermolecular. A análise do ensaio de DLE realizada em seis horas após a indução do DSB mostrou que os valores de CP ARG4 foram semelhantes entre a amostra de oligos com e sem hibridização. O controle da qPCR de ligadura intermolecular revelou um sinal aceitável para a amostra de oligos com e sem hibridização, mas um sinal menor para a amostra com falha.Nas três amostras, houve indução robusta de DSB. Uma vez que a clivagem HindIII depende da restauração do sítio da enzima de restrição pelo oligo hibridizante. Houve diferença significativa na amplificação através do local de clivagem HindIII na fita ressecada entre a largura e sem oligo amostras.Uma diferença menor na amplificação através do local na fita estendida foi observada porque aqui a clivagem HindIII também depende da extensão. As amostras e o tampão precisam ser mantidos frios em todos os momentos. As amostras devem ser congeladas por flash após ressuspensão em tampão enzimático de restrição a frio de 1,4x com ou sem oligos hibridizantes.Os efeitos a jusante da formação e extensão da alça D na formação do produto podem ser estudados usando Southern blotting ou ensaios de desfecho genético. Os efeitos na pesquisa de homologia podem ser investigados usando CP alta. A imunoprecipitação da cromatina pode fornecer informações sobre o recrutamento de uma proteína de interesse.

detection-homologous-recombination-intermediates-via-proximity

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O ensaio de translocação HO-estimulado monitores vertente única de recozimento após a criação do DNA dupla fita-breaks em loci múltiplos em...

Quantificação e análise da formação de HO-endonuclease Stimulated translocações cromossômicas por Strand Único Annealing em Saccharomyces cerevisiae</em

Neste vídeo, descrevemos a técnica de Southern blotting para identificar eventos de recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos usando sondas radiomarcadas. As regiões de DNA contendo eventos de recombinação homóloga aparecem como bandas distintas quando a membrana contendo o DNA ligado à sonda é exposta a raios-X.

Southern Blotting para detectar recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Nós descrevemos a clivagem endógena da cromatina, juntamente com a sequenciação de alto rendimento (ChEC-seq), um método ortogonal de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) para mapear os locais de ligação de proteínas genômicas com proteínas de fusão de nucleases microcócicas (MNase).

Mapeamento genômico de interações proteína-DNA com ChEC-seq em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo apresenta um método de isolamento de cromatina locus-específico baseado em recombinação sítio-específica para purificar um locus gênico de cópia única de interesse em seu contexto de cromatina nativa a partir de levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae.

Purificação de cromatina de locus gênico de cópia única em Saccharomyces cerevisiae

Aprenda a quantificar formação e extensão de D-loops durante recombinação homóloga em Saccharomyces cerevisiae usando ligadura de proximidade e PCR quantitativa. Esta técnica viabiliza o estudo de proteínas no metabolismo de D-loops.

Detecção de Intermediários de Recombinação Homóloga via Ligadura de Proximidade e PCR Quantitativa em Saccharomyces cerevisiae

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