Name: Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Aprenda a realizar imagem de molécula única em bicamadas lipídicas suportadas sintéticas repletas de polímeros usando microscopia smTIRF. Este método permite analisar ligação, difusão e montagem de biomoléculas em ambientes confinados.

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Os autores reconhecem o Prof. Benjamin Schuler por compartilhar a expressão plasmídeo para a proteína ClyA. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Ciência de Fronteira Humana (RGP0047-2020).

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, demonstramos experimentos de molécula única em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) que manifestam um ambiente lotado para biomoléculas embutidas em membrana. O ambiente lotado gera um efeito de volume excluído, levando ao aumento das reações biomoleculares 1,2,39,40. Para o sistema lipídico PEG, onde o polímero ocupa principalmente o volume fora da bicamada, esse efeito é especialmente ...

As membranas celulares são sistemas altamente lotados e complexos1. O apinhamento molecular pode ter um impacto considerável na difusão de entidades ligadas à membrana, como proteínas e lipídios 2,3,4. Da mesma forma, reações bimoleculares em membranas lipídicas como a dimerização de receptores ou a oligomerização de complexos de membranas são influenciadas pelo apinhamento 5,6,7. A natureza, a configuração e a concentração de crowders podem governar a ligação da membrana, a difusividade e a interação proteína-proteína de várias maneiras 8,9. Como controlar o aglomeramento de membranas nas membranas celulares e interpretar sua influência sobre as biomoléculas embutidas é um desafio, os pesquisadores têm tentado estabelecer sistemas in vitro alternativos10.
Uma abordagem popular para membranas artificiais apinhadas é a dopagem das membranas bicamadas com lipídios enxertados com polímero (como polietilenoglicol, PEG)11,12. Durante a visualização da dinâmica de proteínas e lipídios em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), esses polímeros adicionalmente protegem os componentes embutidos na membrana do substrato subjacente carregado negativamente (como o vidro), levantando efetivamente a bicamada para longe do suporte subjacente. Variando o tamanho e a concentração do polímero, pode-se controlar a extensão do apinhamento molecular, bem como sua separação do suporte sólido subjacente13,14. Esta é claramente uma vantagem sobre as bicamadas lipídicas suportadas em substratos sólidos sem almofadas poliméricas15,16, onde as biomoléculas transmembranares podem perder sua atividade17,18,19. Mais importante, nos permite recapitular o ambiente lotado da membrana celular in vitro, o que é crítico para muitos processos de membrana.
Polímeros enxertados superficialmente em membranas também sofrem alterações em sua configuração dependendo de sua densidade de enxerto12. Em baixas concentrações, eles permanecem em uma configuração entropicalmente enrolada, conhecida como cogumelo, acima da superfície da membrana. Com o aumento da concentração, eles começam a interagir e tendem a se desenrolar e se estender, finalmente produzindo uma densa formação em forma de escova na membrana21. Uma vez que a transição do cogumelo para o regime de escova é altamente heterogênea e se manifesta em condições mal caracterizadas do polímero, é importante usar condições bem caracterizadas para apinhamento em membranas enxertadas com polímero. Em comparação com um estudo recente20, identificamos e relatamos composições de membranas lotadas que mantêm o transporte difusivo e a atividade das biomoléculas transmembranares.
Neste protocolo, discutimos como gerar membranas lipídicas PEGiladas e fornecemos recomendações para densidades de PEG que imitam o apinhamento em dois regimes diferentes de configuração polimérica (a saber, cogumelo e escova). O protocolo também descreve a ligação de molécula única, o rastreamento de partículas e a aquisição e análise de dados de fotobranqueamento para moléculas embutidas nessas membranas lotadas. Primeiro, descrevemos as etapas de limpeza completas, a montagem da câmara de imagem e a geração de PEG-SLBs. Em segundo lugar, fornecemos detalhes para os experimentos de ligação de molécula única, rastreamento de partículas e fotobranqueamento. Em terceiro lugar, discutimos i) extrair as afinidades relativas de ligação, ii) caracterizar a difusão molecular e iii) contar subunidades em um conjunto de proteínas a partir de filmes de moléculas individuais na membrana.
Embora tenhamos caracterizado esse sistema com imagens de molécula única, o protocolo é útil para todos os biofísicos de membrana interessados em entender o efeito do aglomeração em reações biomoleculares em membranas lipídicas. No geral, apresentamos um pipeline robusto para a fabricação de bicamadas lipídicas lotadas e suportadas, juntamente com vários ensaios de molécula única realizados sobre eles e as rotinas de análise correspondentes.

<table><tbody><tr><td>Seringas de 2,5 ml</td><td>HMD Healthcare</td> Dispo Van, <td>seringa de plástico</td><td>tuberculina de 2,5 ml</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Finar Chemicals</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>Folha</td><td></td><td></td> de acrílico Folha de <td>acrílico de 2 mm de espessura</td></tr><tr><td></td><td>BigiMall</td><td></td><td>2 mm,</td></tr><tr><td>Sonicador de banho</td> transparente <td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td></td><td>Sigma 528730</td><td>&nbsp; Colesterol de grau HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>8 Jarra de Slides com Tampa</td></tr> de <tr><td>Vidro Lamínulas</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm X 50 mm</td></tr><tr><td>Cy3-DNA Strand</td><td>IDT</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3</td></tr><tr><td>Corante de Cianina (Cy3)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D3911</td><td>Dil Stain (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-perclorato de tetrametilindocarbocianina ('DiI'; DiIC18(3)))Conector</td></tr> de <tr><td>DNA Strand 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC </td></tr><tr><td>T DNA Connector Strand 2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>DNA Tocoferol</td><td>Strand Biomers</td><td></td><td>Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amónio)</td></tr><tr><td>Fita dupla face</td><td>Brocas de LF93010LE</td><td></td><td></td>3M</tr><tr><td>(revestidas a diamante)</td><td></td><td></td><td>0,5 - 1 mm</td></tr><tr><td>Máquina de perfuração</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>Workstation</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Esferas de fluorescência</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de Vidro</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Micro Slides, Frascos de Vidro PIC-1</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>Solução de 30%, Labolene de Grau AR</td></tr><tr><td></td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>&nbsp; Laser detergente</td></tr><tr><td>532 nm</td><td>Cortador</td> a <td>laser de safira</td><td></td></tr><tr><td></td><td>coerente Universal Laser Systems</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine DOPE</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (lissamina rodamina B sulfonil) (sal de amônio)</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Finar Chemicals</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salino (PBS)</td><td></td><td></td> <td>1X</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina</td></tr><tr><td>Bomba de seringa programável</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1010</td><td>Bomba de seringa de alta pressão</td></tr><tr><td>PTFE Caps</td><td>Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de PTFE</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>SD Fine Chemicals</td><td></td><td>98%, Objetivo TIRF de grau AR</td></tr><tr><td></td><td>Dessecador</td><td>a vácuo Olympus UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

difusão e montagem de molécula Única em membranas lipídicas repletas de polímeros

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

As membranas celulares são ambientes altamente lotados para reações biomoleculares e sinalização. No entanto, a maioria dos experimentos in vitro que investigam a interação de proteínas com lipídios emprega membranas bicamadas nuas. Tais sistemas carecem das complexidades do apinhamento por proteínas e glicanos embutidos na membrana e excluem os efeitos de volume associados encontrados nas superfícies da membrana celular. Além disso, a superfície de vidro carregada negativamente na qual as bicamadas lipídicas são formadas impede a difusão livre de biomoléculas transmembranares. Aqui, apresentamos uma membrana polimérico-lipídica bem caracterizada como uma mímica para membranas lipídicas lotadas. Este protocolo utiliza lipídios conjugados com polietilenoglicol (PEG) como uma abordagem generalizada para incorporar crowders na bicamada lipídica suportada (SLB). Primeiro, um procedimento de limpeza das lâminas microscópicas e coverslips para a realização de experimentos de molécula única é apresentado. Em seguida, são discutidos métodos para caracterizar os PEG-SLBs e realizar experimentos de molécula única de ligação, difusão e montagem de biomoléculas usando rastreamento de molécula única e fotobranqueamento. Finalmente, este protocolo demonstra como monitorar a montagem de nanoporos da toxina formadora de poros bacterianos Citolisina A (ClyA) em membranas lipídicas lotadas com análise de fotobranqueamento de molécula única. Os códigos MATLAB com conjuntos de dados de exemplo também são incluídos para executar algumas das análises comuns, como rastreamento de partículas, extração de comportamento difusivo e contagem de subunidades.

Monitorização da ligação da proteína ClyA nas membranas PEGiladas Após a etapa 4.5, a cinética de ligação é estimada plotando o número de partículas que se ligam à superfície da membrana ao longo do tempo (Vídeo 1). À medida que a proteína ClyA se liga a uma membrana com 5 mol% de lipídios PEG2000, a densidade de partículas aumenta e atinge a saturação (Figura 5). Um ajuste de decaimento exponencial às partículas ligadas (círculos cianos) dá a constante d...

Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

As membranas celulares são altamente lotadas devido à presença de proteínas e açúcares incorporados. Demonstramos imagens de molécula única em bicamadas lipídicas sintéticas com aglomeração. Esta plataforma é útil para investigar o efeito do apinhamento nas reações biomoleculares da membrana, a nível molecular.O protocolo explica a análise de ligação, difusão e montagem de biomoléculas de membrana. O sucesso no experimento depende da limpeza rigorosa do substrato, evitando danos à bicamada e mantendo uma alta relação sinal-ruído em imagens de molécula única. Demonstrando o procedimento comigo está Aditya Upasani e Vishwesh Haricharan Rai, estudantes de pós-graduação do laboratório.Comece colocando a lâmina de acrílico tratada com plasma em papel de seda limpo. Descasque a fita de corte a laser de dupla face e cole-a na lâmina. Usando uma ponta de pipeta, achate a fita para evitar vazamentos de um canal para o outro.Feche a câmara colocando a tampa tratada com plasma na lâmina gravada. Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente a tampa nas regiões coladas para tornar o canal à prova d'água. Se estiver usando lâminas de vidro, sele as bordas usando resina epóxi.Armazene as câmaras de imagem microfluídicas preparadas por uma a duas semanas sob condições dessecadas. Pegue um frasco para injetáveis de vidro pré-limpo com solução de piranha e adicione a solução de clorofórmio de POPC e DOPE-PEG(2000) na fração molar desejada de lípidos PEG 2000 para obter a concentração lipídica final de três milimolares, após a adição do tampão. Da mesma forma, outras composições de membrana de lipídios podem ser preparadas.Em seguida, seque o clorofórmio do frasco para injetáveis utilizando um fluxo suave de azoto com um pequeno redemoinho para que os lípidos desejados sejam uniformemente revestidos na superfície do frasco para injetáveis. Remova o clorofórmio residual mantendo o frasco para injetáveis num exsicador a vácuo durante uma hora. Em seguida, adicione um mililitro de PBS ao frasco para injetáveis e incube durante a noite a 37 graus Celsius.Após a incubação durante a noite, vórtice suave o frasco para injetáveis durante um a dois minutos até que a solução se torne turva e leitosa. Agora transfira 100 microlitros desta solução para um pequeno tubo de centrífuga de 500 microlitros. Para gerar pequenas vesículas unilamelares de 50 a 100 nanômetros de diâmetro, sonicate a solução por cerca de uma hora em um sonicator de banho.No final da sonicação, a solução se tornará clara, se a solução ainda estiver turva, sonicate por mais 30 minutos. Em seguida, adicione cloreto de cálcio às vesículas sonicadas a uma concentração final de 30 milimolares na solução lipídica. Corte uma ponta de micropipeta para injetar a solução de amostra para que ela se encaixe firmemente no orifício.Misture a solução lipídica e injete-a através de um dos orifícios na câmara de imagem. Limpe o excesso de solução que sai da câmara da saída com tecido limpo para evitar a contaminação dos canais adjacentes. Prepare uma câmara de umidificação colocando tecido molhado no final de um tubo de centrífuga de 50 mililitros.Coloque o slide no tubo e feche a tampa do tubo. Coloque o tubo de lado e deixe este conjunto em uma câmara umidificada por 90 minutos, de preferência em uma incubadora a 37 graus Celsius. Lave bem a câmara com uma grande quantidade de tampão PBS, evitando que as bolhas de ar entrem na câmara durante a lavagem, pois isso pode gerar defeitos na membrana.Antes de realizar qualquer experimento sobre mobilidade e montagem, alinhe o microscópio TIRF preparando uma amostra de contas fluorescentes e adicionando-as ao canal microfluídico em baixas concentrações, de modo que as manchas fluorescentes de contas únicas não se sobreponham nas imagens. Primeiro, visualize as contas no modo de epifluorescência. Enquanto a iluminação estiver no modo de epifluorescência, mova o espelho M5 sentado em um estágio de tradução de tal forma que o feixe que sai da objetiva se dobre até que a configuração de reflexão interna total seja alcançada.Para verificar se a iluminação TIR foi alcançada, verifique se apenas as contas na superfície são visíveis quando o campo evanescente TIR está iluminando a amostra de contas e se as contas flutuantes livres longe da superfície não são observadas. No início do experimento, defina a potência do laser no plano focal traseiro objetivo para cinco a 10 miliwatts para evitar a destruição da foto dos fluoróforos. Mantenha a lâmina no estágio do microscópio e concentre-se na membrana nua primeiro, pequenos traços de impurezas nas membranas lipídicas são suficientes para visualizar a membrana.Injete a amostra usando uma micropipeta na câmara de imagem revestida com PEG SLB. Para medir a cinética de ligação de uma única molécula, use uma bomba de seringa para fluir as biomoléculas marcadas através dos orifícios de entrada para a câmara microfluídica a uma taxa de fluxo de 50 a 500 microlitros por minuto. Para gravar 5.000 quadros a 25 a 50 quadros por segundo, defina os parâmetros de aquisição de filmes necessários.Inicie a aquisição do filme e adquira mais de 5.000 quadros sob fluxo contínuo da bomba da seringa até que não haja aumento adicional no aparecimento de novas manchas na superfície da membrana, e analise a cinética de ligação conforme descrito no manuscrito. Para o rastreamento de partículas únicas, adicione as biomoléculas marcadas em baixas concentrações ao canal usando uma micropipeta. Para garantir a alta fidelidade das trilhas recuperadas dos conjuntos de dados, otimize a concentração para uma densidade inferior a 0,1 partículas por micrômetro quadrado, de modo que as partículas individuais raramente se cruzem.Se necessário, incube a câmara em um ambiente de umidificação e lave com o tampão antes da imagem. Para a análise da trajetória de uma única partícula, adquira de 200 a 500 quadros a 10 a 100 quadros por segundo e mantenha a lente objetiva focada no plano da bicamada com o mínimo de desvio de estágio durante a aquisição da imagem. Para subunidades de medição, adicione a concentração relevante de biomoléculas marcadas à câmara de imagem microfluídica e incube a lâmina em uma câmara de umidificação na temperatura desejada pelo tempo necessário.Antes da imagem, lave a câmara de imagem com um tampão. Coloque a lâmina em um microscópio e ajuste o foco para visualizar as moléculas marcadas. Defina a potência do laser para um nível em que o branqueamento do fluoróforo ocorra gradualmente.Idealmente, para cada complexo montado controle a potência do laser para manter a taxa de escalonamento da foto entre 10 a 20 quadros de distância, conforme descrito no manuscrito, e adquirir as imagens até que todas as moléculas estejam completamente branqueadas por foto. Execute uma medição de montagem dependente do tempo, iniciando a aquisição do filme assim que a amostra for introduzida na câmara e adquirindo novos filmes de fotobranqueamento em intervalos de tempo fixos após a ligação da membrana de diferentes segmentos do PEG SLB. A ligação da citolisina A às membranas lipídicas com cinco moles por cento DOPE-PEG(2000) apresentou aumento da densidade de partículas e saturação atingida.Uma função de decaimento exponencial ajustada às partículas ligadas dá a constante de tempo para a ligação da membrana da citulisina A. Sem qualquer polímero PEG na membrana, a maioria dos traçadores exibia difusão restrita em SLBs. Pequenos níveis de PEG 2000 na bicamada da membrana se afastavam da superfície subjacente, permitindo que as moléculas traçadoras se difundissem sem restrições de superfície.No entanto, o confinamento extremo é observado em uma alta concentração de PEG na membrana de bicamada. A distribuição ISD2 para a difusão do traçador de DNA lipofílico em duas membranas lipídicas diferentes do PEG 2000 mostrou diminuição da mobilidade em altas concentrações de PEG. Após incubação na membrana de bicamada lipídica lotada, a citolisina A exibiu muitas etapas distintas de fotobranqueamento, sugerindo a formação de vários intermediários de montagem.Após correção para a eficiência de marcação, a distribuição final dos oligômeros mostrou a espécie de citolisina A dodecamérica como estrutura dominante. A montagem da ligação às proteínas da membrana e outras reações devem ser realizadas em ambientes apropriados de apinhamento da membrana. Deve-se prestar atenção à limpeza da câmara de imagem, evitando interromper a bicamada e configurando o microscópio TIRF.

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