Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

Este protocolo permite que os pesquisadores determinem as afinidades de ligação dos aptâmeros contra alvos livres de solução, ao mesmo tempo em que fornecem informações sobre o mecanismo de ligação. Como o ITC mede as mudanças no calor devido à ligação, nem o aptâmero nem o ligante precisam ser rotulados ou funcionalizados, como seria o caso de técnicas como o SPR. Novos usuários devem prestar muita atenção aos buffers correspondentes em todos os componentes de ligação.

Além disso, esteja ciente de que a técnica tem altos requisitos de amostra que podem ser difíceis de atender para ligantes maiores, como proteínas. Para começar, ative a membrana da coluna de diálise, preencha com tampão PBS, equilibre-se por 10 minutos à temperatura ambiente e centrifuga-se a 5.000 vezes G por 15 minutos. Remova o tampão e carregue 500 microlitros de amostras de aptâmero na coluna.

Centrifugar a 5.000 vezes G e repeti-lo quatro vezes para trocar o buffer original por PBS. Colete o aptâmero de DNA dialisado usando uma pipeta e transfira-o para o novo tubo de 1,5 mililitro. Recolha o último tampão de fluxo para dissolver a tetraciclina.

Certifique-se de que o buffer para o experimento na seringa corresponde ao buffer na célula de referência. Determine a concentração de aptâmero novamente usando um espectrômetro UV-visível. Use o último tampão de troca para ajustar a concentração para tetraciclina de 40 micromolares e aptâmero de dois micromolares.

Dobre o aptâmero de DNA aquecendo a 90 graus Celsius por 10 minutos, resfriando a quatro graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, retornando à temperatura ambiente por 20 minutos. Desgaseifique o aptâmero dobrado e a tetraciclina dialisada usando uma estação de desgaseificação ou bomba de vácuo por 25 minutos para eliminar os gases dissolvidos. Depois de limpar e confirmar a limpeza da máquina, teste a precisão da máquina com um kit padrão que inclui EDTA e cloreto de cálcio usando o programa padrão e seguindo as instruções do fabricante.

Configure os parâmetros em execução. Verifique os volumes necessários usando uma calculadora de programa em execução. Com este parâmetro de execução, realize a medição de ITC com 230 microlitros de tetraciclina de 40 micromolares na seringa ITC e 485 microlitros de aptâmero de dois micromolares na célula de amostra de ITC usando o ITC.

Carregue as placas de seringa de tetraciclina dialisada e o aptâmero dobrado na célula da amostra, evitando bolhas, utilizando uma pipeta. Comece a executar o instrumento ITC clicando no botão Iniciar no software. Abra o software de análise de dados clicando duas vezes para começar a analisar os dados.

Abra o caminho dos dados brutos salvos para saber a tendência de vinculação. Abra a guia Modelagem e use modelos de vinculação diferentes para encontrar o melhor ajuste para a curva de dados. Em seguida, o software calcula automaticamente o termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, incluindo entalpia, entropia, energia livre, constante de ligação de equilíbrio e estequiometria.

Colete os parâmetros termodinâmicos determinados a partir dos dados e informações do modelo de ajuste. Crie um relatório incluindo imagens do termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos. O aptâmero selecionado por Kim, et al liga-se à tetraciclina com afinidades de ligação de constante de dissociação uma igual a 13 micromolares e constante de dissociação duas igual a 53 nanomolares.

O modelo de ajuste e a estequiometria do ITC refletem que o aptâmero se liga à tetraciclina através de uma relação de ligação de 2:1 com o modelo de ligação sequencial. Os parâmetros termodinâmicos determinados pela medição ITC para o local dois indicaram que a superação da entalpia relativamente significativa impulsiona a forte ligação. A ligação impulsionada pela entalpia com perda de entropia refere-se a alterações conformacionais do ácido nucleico, que foram relatadas como comportamentos de ligação entre o RNA e uma pequena molécula.

O aptâmero e o ligante devem estar no mesmo tampão. O aptâmero deve ser redobrado se desenvolvido com redobramento, e as amostras devem ser desgaseificadas. Abordar essas considerações garantirá que apenas as interações aptâmero-ligante contribuam para o sinal medido.

Devido ao tamanho do alvo do aptâmero, um método de acompanhamento apropriado poderia ser a termoforese em microescala para confirmar a afinidade de ligação medida livre em solução.