Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

O protocolo descrito permite a análise fenotípica de células-tronco hematopoéticas e progenitoras da medula óssea e células estromais da medula óssea. Ele pode ser usado para estudar perturbações nessas populações em diferentes cenários. Comparada com outros métodos previamente descritos, esta técnica permite a análise fenotípica de células hematopoéticas, especificamente nas duas áreas funcionais da medula, endosteal e medula óssea central, bem como células estromais da medula óssea.

Para começar, coloque o animal eutanasiado com a barriga para cima em uma placa de Petri e borrife com etanol 70%. Faça um corte acima do abdômen usando uma tesoura e afaste a pele até os tornozelos. Pegue uma das patas e corte em seu fundo para separá-la do animal usando uma tesoura.

Em seguida, retire o pé da perna cortando o tornozelo e coloque a perna em PBS 2% FBS gelado. Em seguida, pegue o osso do quadril usando uma pinça e corte atrás dele para separá-lo do animal usando uma tesoura. Coloque o osso do quadril em PBS 2% FBS gelado.

Depois de colocar o osso da perna e do quadril em uma placa de Petri, limpe os ossos usando um bisturi estéril. Em seguida, separe a tíbia e o fêmur cortando o joelho com o bisturi e coloque os ossos limpos em PBS 2% FBS gelado. Coloque o fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão.

Em seguida, pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mililitros para homogeneizar e transferi-la para um tubo de 50 mililitros através de um filtro de células de 40 micrômetros colocado em cima do tubo. Enxágue a argamassa com mais PBS 2% FBS e transfira a solução para o mesmo tubo de 50 mililitros através do mesmo filtro de células de 40 micrômetros. Centrifugar o tubo de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de tampão de lise eritrocitária à temperatura ambiente, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, adicione 15 mililitros de PBS 2% FBS e centrifugar o tubo de 50 mililitros. Se o pellet de célula não parecer avermelhado, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBS 2% FBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa inferior de V de 96 poços para coloração.

Depois de esmagar o osso, como demonstrado anteriormente, corte a ponta de uma pipeta P1000 usando uma tesoura e use-a para transferir todo o conteúdo da argamassa para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar o tubo de 50 mililitros a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após o descarte do sobrenadante, ressuspender o pellet em três mililitros de colagenase IV e esta solução dispase-II.

Incubar o tubo a 37 graus Celsius durante 40 minutos. Completar o tubo para 25 mililitros com PBS 2% FBS e vórtice para misturar. Em seguida, transfira o conteúdo para um novo tubo de 50 mililitros através de um filtro de células de 100 micrômetros.

Em seguida, adicione 15 mililitros de PBS 2% FBS ao antigo tubo de 50 mililitros e transfira a solução para o novo tubo de 50 mililitros através do filtro de células de 100 micrômetros. Depois de centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet de célula em cinco mililitros de tampão de lise eritrocitária, pipetando para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta. Após a incubação de dois minutos à temperatura ambiente, adicione 15 mililitros de PBS 2% FBS.

Novamente, centrifugar o tubo e, se o pellet de célula não parecer avermelhado após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBS 2% FBS e transfira a suspensão da célula para um poço de uma placa inferior de V de 96 poços para coloração. Em seguida, centrifugar a placa a 500 G por três minutos a quatro graus Celsius. Coloque o fêmur em uma placa de Petri e corte as extremidades do osso usando um bisturi estéril.

Em seguida, lave a parte central do osso passando 100 microlitros de PBS 2% FBS através do interior do osso uma vez de cada lado usando uma seringa de insulina sem volume morto de 0,5 mililitros e coletando a solução em um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de PBS 2% FBS. Subsequentemente, transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros marcado como medula óssea lavada contendo quatro mililitros de PBS 2% FBS. Esmague as extremidades do osso em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado, pressionando-as suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão.

Uma vez homogeneizada a suspensão celular, transfira-a para um tubo de 50 mililitros marcado como medula óssea esmagada através de um filtro de células de 40 micrômetros. Por fim, enxágue a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transfira a solução para o mesmo tubo. A análise por citometria de fluxo de células-tronco hematopoéticas e progenitores multipotentes foi realizada na medula óssea total em um camundongo C57BL6J adulto jovem e saudável.

Na análise de células estromais, células endoteliais e células-tronco mesenquimais na medula óssea total, células-tronco mesenquimais podem ser prontamente identificadas com base na expressão do receptor de leptina e células endoteliais podem ser identificadas com base na expressão de CD31 e SCA-1. Análise por citometria de fluxo de células endoteliais na medula óssea total mostrando a discriminação entre células endoteliais arteriolares e sinusoidais com base em ICAM1. A quantificação de células endoteliais arteriais e sinusoidais da medula óssea no tecido central e endosteal da medula óssea mostra que as células endoteliais da medula óssea arterial são mais abundantes nas regiões endosteais, enquanto os sinusóides são mais frequentes nas áreas centrais da medula óssea.

Ao obter a medula óssea lavada, o volume ou o número de vezes indicado para passar PBS 2% FBS através do interior da parte central do osso não deve ser excedido. A combinação do método descrito com ensaios funcionais das populações celulares analisadas fenotipicamente forneceria informações valiosas sobre as possíveis perturbações nessas populações que ocorrem nas condições estudadas. O protocolo descrito permite a análise fenotípica de células hematopoéticas diferencialmente na medula óssea endosteal e central, possibilitando aos pesquisadores investigar perturbações na hematopiese potencialmente ocorrendo especificamente nessas localizações da medula óssea.