Name: Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda análise por citometria de fluxo de células-tronco hematopoéticas e células de nicho estromal em medula óssea murina. Este método permite estudar perturbações em populações específicas de células em diferentes condições experimentais.

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LM foi apoiado por uma bolsa do Lady Tata Memorial Trust. JR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Bolseira FCT UI/BD/150833/2021). O ML foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD foi apoiado por bolsas da Sociedade Americana de Hematologia, da Fundação Pablove, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) e da Sociedade Portuguesa de Hematologia. Agradecemos o apoio da Dra. Catarina Meireles e Emília Cardoso das instalações TRACY no i3s.

Os animais utilizados neste protocolo foram alojados no biotério i3S em condições específicas livres de patógenos, em um ciclo claro-escuro de 12 h e ambiente com temperatura controlada. O acesso gratuito à ração padrão para roedores e água foi fornecido. Todos os animais receberam cuidados humanos de acordo com os critérios delineados pela Federação das Associações Europeias de Zootecnia de Laboratório para o cuidado e manuseio de animais de laboratório (Diretiva UE 2010/63/UE). O procedimento experimental realizado nos animais (eutanásia) foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do i3S (ref. DD_2019_15) e pela Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Detalhes dos materiais utilizados ao longo deste protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de soluções e coquetéis corantes
<ol><li>Solução salina tamponada com fosfato (PBS): Dissolva cinco comprimidos de PBS em 1 L de água destilada. Conservar à temperatura ambiente (TR).</li>
	<li>PBS 2% de soro fetal bovino (FBS): Adicionar 10 mL de FBS a 500 mL de PBS. Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Tampão de lise de hemácias (1x): Adicionar 50 mL de tampão de lise de hemácias 10x a 450 mL de água deionizada. Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Solução de colagenase IV e dispase II: Dissolver 30 mg de colagenase IV e 60 mg de dispase II em 30 mL de HBSS para uma solução de colagenase IV e 2 mg/mL dispase II. Preparar fresco antes de usar.</li>
	<li>Solução de bloqueio dos receptores Fc: Adicionar 10 μL de anticorpo anti-camundongo CD16/32 purificado a 490 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C até à utilização.</li>
	<li>Solução corante de viabilidade celular fluorescente: Adicionar 2 μL de corante de viabilidade celular fluorescente a 1 mL de PBS. Preparar fresco antes de usar.</li>
	<li>Coquetel de linhagem de biotina: Misture 100 μL de cada um dos seguintes anticorpos: biotina anti-camundongo CD3ε, biotina anti-camundongo CD4, biotina anti-camundongo CD8a, biotina anti-camundongo/humano CD11b, biotina anti-camundongo/humano CD45R/B220, biotina anti-camundongo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) e biotina anti-camundongo TER-119/células eritroides. Conservar a 4 °C até à utilização.</li>
	<li>Coquetel de coloração primária de CTHs: Adicionar 10 μL de coquetel de linhagem de biotina, 10 μL de CD150 anti-camundongo (SLAM) marcado com imunofluorescência, 10 μL de ficoeritrina (PE) anti-Flk2 de camundongo (CD135), 10 μL de proteína de peridinina-clorofila (PerCP) anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de CD48 anti-camundongo PE/Cyanine7 e 10 μL de aloficocianina (APC)/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.</li>
	<li>Coquetel de coloração primária do estroma: Adicionar 5 μL de anticorpo biotinilado de leptina R de camundongo, 6,7 μL de anticorpo anti-endomucina de camundongo anti-PE, 10 μL de PerCP anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL de EP/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse CD45, e 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/células eritroides para 954 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.</li>
	<li>HSCs/solução de coloração secundária estromal: Adicionar 1 μL de estreptavidina APC a 1 mL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.</li>
	<li>Coquetel de coloração CE: Adicionar 10 μL de anticorpo anti-endomucina de camundongo PE, 10 μL de PerCP anti-camundongo Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de PE/Cyanine7 anti-mouse CD31, 10 μL de Alexa Fluor 647 anti-camundongo CD54/ICAM-1, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 e 10 μL de APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/eritroides a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco ou no dia anterior. Conservar a 4 °C protegido da luz até à utilização.</li>
	<li>Solução corante DAPI: Adicionar 1 gota de reagente DAPI a 500 μL de PBS. Preparar fresco antes de usar.</li>
</ol>2. Extração da amostra
<ol><li>Eutanásia do animal por deslocamento cervical (detalhes dos animais utilizados para a produção dos dados apresentados neste estudo podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1). Coloque o animal com a barriga para cima em uma placa de Petri e borrife com etanol 70%. Faça um corte acima do abdômen usando uma tesoura e afaste a pele até os tornozelos.</li>
	<li>Pegue uma perna e, usando uma tesoura, corte em sua parte inferior (onde está a articulação entre a perna e o quadril) para separá-la do animal. Esta etapa servirá também como um método confirmatório secundário da eutanásia. Retire o pé da perna cortando o tornozelo. Coloque a perna em PBS 2% FBS gelado. Se necessário, repita o passo com a outra perna.</li>
	<li>Pegue o osso do quadril e, usando uma tesoura, corte atrás dele para separá-lo do animal. Coloque o osso do quadril em PBS 2% FBS gelado. Se necessário, repita o passo com o outro osso do quadril.</li>
	<li>Coloque a(s) perna(s) e o(s) osso(s) do quadril em uma placa de Petri e, usando um bisturi estéril, limpe os ossos. Separe a tíbia e o fêmur cortando o joelho com o bisturi. Coloque os ossos limpos em PBS 2% FBS gelado.</li>
</ol>3. Processamento de amostras para análise de populações de células hematopoéticas na medula óssea total
<ol><li>Coloque um fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. As células BM são liberadas na solução contida na argamassa.</li>
	<li>Pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL para homogeneizar e transferir para um tubo de 50 mL através de um filtro de células de 40 μm colocado sobre o tubo.</li>
	<li>Se os ossos esmagados não parecerem brancos neste ponto, adicione mais PBS 2% FBS à argamassa e repita o esmagamento e, em seguida, pipete para cima e para baixo e transfira a solução para o mesmo tubo de 50 mL através do mesmo filtro de células de 40 μm.</li>
	<li>Enxaguar a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL através do mesmo filtro celular de 40 μm. Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 5 mL de tampão de lise eritrocitário (1x) em RT pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de 2 minutos em RT, adicionar 15 mL de PBS 2% FBS.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se a pastilha de célula ainda parecer avermelhada, volte para a etapa 3.5. Caso contrário, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 200 μL de solução corante fluorescente. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Placa de centrifugação a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS 2% FBS para lavar.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 500 x g por 3 min a 4 °C, descartar o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspender a pastilha em 100 μL de solução de bloqueio dos receptores Fc. Incubar a placa durante 10 min a 4 °C protegida da luz.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g por 3 min a 4 °C, descartar o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de coquetel de coloração primária de CTH. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de solução corante secundária de CTH. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 minutos a 4 °C e eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo. NOTA: Se estiver interessado em determinar o número absoluto de populações de células hematopoéticas, adicionar contas de calibrite aos tubos de poliestireno antes da análise no citômetro16.</li>
</ol>4. Processamento de amostras para análise de populações de células estromais na medula óssea total
<ol><li>Coloque um fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. Corte a ponta de uma ponta P1000 com uma tesoura e use-a para transferir todo o conteúdo da argamassa para um tubo de 50 mL (não passe por um filtro de células).</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 50 mL a 500 x g por 5 min a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 3 mL de solução de colagenase IV e dispase II. Incubar o tubo a 37 °C durante 40 minutos.</li>
	<li>Completar o tubo para 25 mL com PBS 2% FBS e vórtice para misturar. Transfira o conteúdo do tubo de 50 mL para um novo tubo de 50 mL através de um filtro celular de 100 μm. Adicionar 15 mL de PBS 2% FBS ao antigo tubo de 50 mL e transferir a solução para o mesmo novo tubo de 50 mL através do mesmo filtro celular. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 5 mL de tampão de lise eritrocitário (1x) em RT pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de 2 minutos em RT, adicionar 15 mL de PBS 2% FBS.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C. Se a pastilha de célula ainda parecer avermelhada, volte para a etapa 4.4. Caso contrário, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS 2% FBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.</li>
	<li>Se estiver a realizar a coloração estromal, avance para o passo 4.7. Se estiver a realizar a coloração CE, avance para o passo 4.12.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 100 μL de coquetel de coloração primária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante virando a placa para papel absorvente e ressuspender o pellet em 100 μL de solução corante secundária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz.</li>
	<li>Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo contendo a suspensão celular para análise por citometria de fluxo e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente e ressuspenda o pellet em 100 μL de coquetel de coloração CE. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante virando a placa em papel absorvente. Ressuspender o pellet em 250 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro celular de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz.</li>
	<li>Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo contendo a suspensão celular para análise por citometria de fluxo e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo. NOTA: Se estiver interessado em determinar os números absolutos das populações de células estromais e endoteliais, adicionar contas de calibrita aos tubos de poliestireno antes da análise no citômetro16.</li>
</ol>5. Processamento de amostras para análise de populações de células hematopoéticas em BM triturada e lavada
<ol><li>Coloque um fêmur em uma placa de Petri e corte as extremidades do osso usando um bisturi estéril.</li>
	<li>Lavar a parte central do osso (diáfise) passando 100 μL de PBS 2% FBS através do interior do osso uma vez de cada lado usando uma seringa de insulina sem volume morto de 0,5 mL e coletando a solução em um tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de PBS 2% FBS. Em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mL marcado como BM lavado contendo 4 mL de PBS 2% FBS. Continue no gelo.</li>
	<li>Coloque as extremidades do osso em uma argamassa com PBS 2% FBS gelada e esmague pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão. Pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mL para homogeneizar e transferir para um tubo de 50 mL marcado como BM esmagado através de um filtro de células de 40 μm.</li>
	<li>Se o osso triturado não parecer branco neste ponto, adicione mais PBS 2% FBS à argamassa e repita o esmagamento. Em seguida, pipetar para cima e para baixo e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL (BM triturado) através do mesmo filtro celular de 40 μm.</li>
	<li>Enxaguar a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transferir a solução para o mesmo tubo de 50 mL (BM triturado) através do mesmo filtro celular de 40 μm.</li>
	<li>Centrifugar os tubos de 50 ml correspondentes às amostras lavadas e trituradas a 500 x g durante 3 min a 4 °C.</li>
	<li>Siga os passos 3.5 a 3.13 (secção 3) com as amostras de BM lavadas e trituradas.</li>
</ol>6. Preparação de controles unicolores (CCEs) para análise por citometria de fluxo
<ol><li>Siga os passos 3.1 a 3.6 (secção 3) com um osso extra de um dos animais não utilizados para a análise principal, transferindo a suspensão celular final para um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de PBS 2% FBS em vez de um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços.</li>
	<li>Transferir 100 μL da suspensão celular para 8 poços de uma placa de fundo em V de 96 poços, 100 μL para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL contendo 100 μL de PBS 2% FBS marcado como DAPI SCC, e a suspensão celular restante para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL contendo 100 μL de PBS 2% FBS marcado como não corado. Mantenha os tubos sobre gelo protegidos da luz.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C e eliminar os sobrenadantes virando a placa para papel absorvente.</li>
	<li>Ressuspender um pellet em 100 μL de solução corante fluorescente e os demais em 100 μL de PBS 2% FBS.</li>
	<li>Adicionar 0,5 μL dos seguintes anticorpos, além do coquetel de linhagem de anticorpos para o qual adicionar 2 μL e o anticorpo PECy7 CD31 para o qual adicionar 0,3 μL, a cada um dos poços com suspensão celular em PBS 2% FBS (um anticorpo por poço, mesmos anticorpos usados nos painéis de análise principais ou mesmos anticorpos fluoróforos com intensidade de fluorescência e abundância de epítopos semelhantes): coquetel de linhagem de biotina, imunofluorescentemente marcado 510 anti-mouse CD150 (SLAM), PE anti-mouse Flk2 (CD135), PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1), imunofluorescentemente marcado 647 anti-mouse CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-mouse CD48, e APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit). Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS a cada poço e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C e eliminar os sobrenadantes virando a placa para papel absorvente.</li>
	<li>Ressuspender todos os pellets, exceto o correspondente às células incubadas com o coquetel de linhagem de anticorpos em 180 μL de PBS 2% FBS e transferir as suspensões celulares para tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de filtros celulares de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.</li>
	<li>Ressuspender as células incubadas com o coquetel de anticorpos da linhagem em 100 μL de HSCs/solução de coloração secundária estromal. Incubar a placa por 15 min no TR no escuro.</li>
	<li>Adicione 100 μL de PBS 2% FBS e pipete para cima e para baixo algumas vezes para lavar. Centrifugar a placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender o pellet em 180 μL de PBS 2% FBS e transferir a suspensão celular para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL através de um filtro de células de 40 μm. Manter no gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.</li>
	<li>Imediatamente antes de ir para o citômetro, adicione 35 μL de solução corante DAPI ao tubo DAPI SCC e incube o tubo em RT por 5 min no escuro. Após esta incubação, manter o gelo protegido da luz até a análise por citometria de fluxo.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Embora o protocolo descrito seja simples e de fácil execução, atenção especial deve ser dada a etapas específicas. Por exemplo, ao se obter BM lavada (passo 5.2), o volume ou o número de vezes indicado para passar PBS 2% FBS pelo interior da parte central do osso não deve ser excedido, pois isso pode resultar em contaminação significativa da amostra lavada por populações de células endosteais.
Alterações no protocolo podem ser feitas para facilitar sua execução pelo pesquisador. Na extracção d...

A citometria de fluxo é um método inestimável para caracterizar e isolar prospectivamente células imunes e hematopoéticas. Também está sendo cada vez mais utilizado para analisar populações estromais e epiteliais de diferentes tecidos. As células-tronco hematopoéticas (CTH) possuem propriedades únicas de auto-renovação e multipotência. Em mamíferos adultos, as CTHs residem principalmente na medula óssea (MO), onde recebem sinais de quiescência e sobrevivência do microambiente ou nicho1 circundante. As HSCs são formalmente definidas de acordo com ensaios funcionais2. No entanto, vários trabalhos marcantes têm mostrado a utilidade da citometria de fluxo na identificação de CTH. Através do uso de marcadores limitados de superfície celular, é possível discriminar populações hematopoéticas altamente enriquecidas emCTH3. A citometria de fluxo é, portanto, um método central no campo das células-tronco. Tem sido extensivamente utilizado para avaliar o impacto de supostos tipos celulares de nicho e fatores de nicho sobre as CTH. Combinando citometria de fluxo com ensaios de imagem e funcionais, demonstrou-se que as HSCs são criticamente suportadas por células-tronco mesenquimais perivasculares (CTMs) e células endoteliais (CE). As CTMs de MO são um grupo heterogêneo e têm diferentes contribuições de citocinas4, mas está bem estabelecido que as CTMs do receptor de leptina (LepR)+ são células-chave de nicho1. As CE de MC também são altamente heterogêneas e podem fazer parte de sinusóides, arteríolas e vasos transicionais tipoH5. Diferentes estudos têm mostrado a contribuição nuançada dessas diferentes CE. Por exemplo, as CE sinusoidais endostesais estão espacialmente mais próximas das CTH quiescentes6, enquanto as CEH não migratórias com menores níveis de espécies reativas de oxigênio estão localizadas próximas às CE arteriolares7. A localização endosteal versus localização central dos nichos também é muito importante. Os vasos endosteais, do tipo H, estão associados a células estromais perivasculares que são perdidas com o envelhecimento, levando à perda deCTHs8. Na leucemia mieloide aguda, as CE centrais são expandidas, enquanto os vasos endostesais e as HSCs endosteteais são perdidos9.
A maioria dos estudos na área tem se concentrado na hematopoese propriamente dita e na regulação extrínseca das CTHs pelas células. No entanto, tem sido cada vez mais reconhecido que há necessidade de melhor caracterizar os nichos que regulam outros progenitores, nomeadamente os progenitores multipotentes (MPPs), particularmente considerando que estes são os principais causadores de hematopoese em estado estacionário10. Em contraste com uma estrutura hierárquica fixa, estudos recentes têm mostrado que a hematopoese é um continuum no qual as HSCs se diferenciam em MPPs tendenciosas em um estágio inicial11. As MPPs têm sido nomeadas a partir de diferentes esquemas declassificação12, mas um recente consenso da sociedade internacional de hematologia experimental (ISEH) propôs que as MPPs sejam discriminadas como MPPs precoces e de acordo com seu viés linfoide (MPP-Ly), megacariocítico e eritroide (MPP-Mk/E) e mieloide (MPP-G/M)13. O uso da citometria de fluxo será fundamental para aprofundar o estudo da importância dos nichos de MC na regulação dessas populações. Os métodos atuais de citometria de fluxo utilizam estratégias de gating variável para diferenciar HSPCs e identificar células estromais, ou seja, CEs, usando marcadores inconsistentes. O objetivo do método atual é apresentar um fluxo de trabalho simples e reprodutível da coloração de MB para identificar subpopulações de HSPC, grupos heterogêneos de CE e CTMs LepR+. Acreditamos que esta técnica, embora comparável com métodos previamente relatados (ver, por exemplo, referência 14), fornece um protocolo atualizado e de fácil implementação para a análise fenotípica de células hematopoéticas nas duas áreas funcionais da medula, BM endosteal e central8,15, bem como de células de nicho estromal da MO.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 anticorpo anti-camundongo CD54 / ICAM-1</td><td>BioLegend</td><td>116114</td><td></td></tr><tr><td>APC Estreptavidina</td><td>BioLegend</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>APC / Cyanine7 anti-camundongo CD117 (c-kit)</td><td>anticorpo BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>APC / Cyanine7 anti-camundongo CD45</td><td>BioLegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>APC / Cyanine7 anti-camundongo TER-119 / anticorpo de células eritróides</td><td>BioLegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-camundongo CD3&epsilon; anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-camundongo CD4</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-camundongo anticorpo CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-camundongo Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) biotina bioLegend</td><td></td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anticorpo anti-rato TER-119/células eritróides</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-rato/anticorpo humano CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-rato/humano CD45R/B220 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-rato CD150 (SLAM)</td><td>BioLegend</td><td>115929</td><td></td></tr><tr><td>Calibrite 2 Color Beads</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>349502</tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Merck Life Science</td><td>C1889</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Merck Life Science</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Sérum Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor, aprovado pela UE, Origem da América do Sul</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo biotinilado R de leptina de camundongo</td><td>R& Sistemas D</td><td>BAF497</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Reagente de Célula Fixa (DAPI)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37606</td><td>DAPI reagente</td></tr><tr><td>PE anticorpo de endomucina de camundongo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5851-82</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse Flk2 (CD135)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anticorpo CD31 de camundongo</td><td>BioLegend</td><td>102524</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato CD48 PE/Cyanine7 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-rato Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend</td><td>108122</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos salinos tampolados com fosfato (PBS)</td><td>Merck Life Science</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato purificado CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>tampão de lise de hemácias BioLegend 10x</td><td></td><td>BioLegend 420302</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Viabilidade Fixável Violeta Zumbi BioLegend</td><td></td><td>423114</td><td>corante fluorescente</td></tr></tbody></table>

análise por citometria de fluxo de medula Óssea purina, células-tronco e progenitoras hematopoéticas e células de nicho estromal

Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells

A medula óssea (MC) é o tecido mole encontrado dentro dos ossos onde ocorre principalmente a hematopoiese, processo pelo qual novas células sanguíneas são geradas. Como tal, contém células-tronco hematopoéticas e progenitoras (HSPCs), bem como células estromais de suporte que contribuem para a manutenção e regulação de HSPCs. Hematológicas e outras desordens da MB interrompem a hematopoiese afetando as células hematopoiéticas diretamente e/ou através da alteração do nicho da MB. Aqui, descrevemos um método para estudar hematopoese na saúde e malignidade através da análise fenotípica de BM murinos HSPCs e populações de nicho estromal por citometria de fluxo. Nosso método detalha os passos necessários para enriquecer as células BM nas frações endosteal e central de BM, bem como as estratégias apropriadas de gating para identificar os dois principais tipos celulares de nicho envolvidos na regulação da HSPC, as células endoteliais e as células-tronco mesenquimais. A análise fenotípica aqui proposta pode ser combinada com mutantes de camundongos, modelos de doenças e ensaios funcionais para caracterizar o compartimento HSPC e seu nicho.

Gráficos representativos da análise por citometria de fluxo de HSCs e MPPs em um camundongo C57Bl/6 adulto jovem saudável são mostrados na Figura 1. A estratégia de gating segue a mais recente nomenclatura harmonizadora proposta pelo ISEH13. Ao analisar o impacto de uma perturbação, como infecção ou câncer, é importante usar um mouse de controle como referência para portões normais. Os controles de fluorescência menos um (FMO) podem ser particularmente úteis para deli...

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

The bone marrow (BM) is the soft tissue found within bones where hematopoiesis, the process by which new blood cells are generated, primarily occurs. As ...

O protocolo descrito permite a análise fenotípica de células-tronco hematopoéticas e progenitoras da medula óssea e células estromais da medula óssea. Ele pode ser usado para estudar perturbações nessas populações em diferentes cenários. Comparada com outros métodos previamente descritos, esta técnica permite a análise fenotípica de células hematopoéticas, especificamente nas duas áreas funcionais da medula, endosteal e medula óssea central, bem como células estromais da medula óssea.Para começar, coloque o animal eutanasiado com a barriga para cima em uma placa de Petri e borrife com etanol 70%. Faça um corte acima do abdômen usando uma tesoura e afaste a pele até os tornozelos. Pegue uma das patas e corte em seu fundo para separá-la do animal usando uma tesoura.Em seguida, retire o pé da perna cortando o tornozelo e coloque a perna em PBS 2% FBS gelado. Em seguida, pegue o osso do quadril usando uma pinça e corte atrás dele para separá-lo do animal usando uma tesoura. Coloque o osso do quadril em PBS 2% FBS gelado.Depois de colocar o osso da perna e do quadril em uma placa de Petri, limpe os ossos usando um bisturi estéril. Em seguida, separe a tíbia e o fêmur cortando o joelho com o bisturi e coloque os ossos limpos em PBS 2% FBS gelado. Coloque o fêmur ou tíbia em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado e esmague o osso pressionando-o suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão.Em seguida, pipetar a suspensão celular resultante para cima e para baixo usando uma pipeta de 10 mililitros para homogeneizar e transferi-la para um tubo de 50 mililitros através de um filtro de células de 40 micrômetros colocado em cima do tubo. Enxágue a argamassa com mais PBS 2% FBS e transfira a solução para o mesmo tubo de 50 mililitros através do mesmo filtro de células de 40 micrômetros. Centrifugar o tubo de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de tampão de lise eritrocitária à temperatura ambiente, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Após uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, adicione 15 mililitros de PBS 2% FBS e centrifugar o tubo de 50 mililitros. Se o pellet de célula não parecer avermelhado, descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBS 2% FBS e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa inferior de V de 96 poços para coloração.Depois de esmagar o osso, como demonstrado anteriormente, corte a ponta de uma pipeta P1000 usando uma tesoura e use-a para transferir todo o conteúdo da argamassa para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar o tubo de 50 mililitros a 500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após o descarte do sobrenadante, ressuspender o pellet em três mililitros de colagenase IV e esta solução dispase-II.Incubar o tubo a 37 graus Celsius durante 40 minutos. Completar o tubo para 25 mililitros com PBS 2% FBS e vórtice para misturar. Em seguida, transfira o conteúdo para um novo tubo de 50 mililitros através de um filtro de células de 100 micrômetros.Em seguida, adicione 15 mililitros de PBS 2% FBS ao antigo tubo de 50 mililitros e transfira a solução para o novo tubo de 50 mililitros através do filtro de células de 100 micrômetros. Depois de centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet de célula em cinco mililitros de tampão de lise eritrocitária, pipetando para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta. Após a incubação de dois minutos à temperatura ambiente, adicione 15 mililitros de PBS 2% FBS.Novamente, centrifugar o tubo e, se o pellet de célula não parecer avermelhado após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de PBS 2% FBS e transfira a suspensão da célula para um poço de uma placa inferior de V de 96 poços para coloração. Em seguida, centrifugar a placa a 500 G por três minutos a quatro graus Celsius. Coloque o fêmur em uma placa de Petri e corte as extremidades do osso usando um bisturi estéril.Em seguida, lave a parte central do osso passando 100 microlitros de PBS 2% FBS através do interior do osso uma vez de cada lado usando uma seringa de insulina sem volume morto de 0,5 mililitros e coletando a solução em um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de PBS 2% FBS. Subsequentemente, transferir a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros marcado como medula óssea lavada contendo quatro mililitros de PBS 2% FBS. Esmague as extremidades do osso em uma argamassa com PBS 2% FBS gelado, pressionando-as suavemente contra a parede da argamassa usando o pilão.Uma vez homogeneizada a suspensão celular, transfira-a para um tubo de 50 mililitros marcado como medula óssea esmagada através de um filtro de células de 40 micrômetros. Por fim, enxágue a argamassa com mais um pouco de PBS 2% FBS e transfira a solução para o mesmo tubo. A análise por citometria de fluxo de células-tronco hematopoéticas e progenitores multipotentes foi realizada na medula óssea total em um camundongo C57BL6J adulto jovem e saudável.Na análise de células estromais, células endoteliais e células-tronco mesenquimais na medula óssea total, células-tronco mesenquimais podem ser prontamente identificadas com base na expressão do receptor de leptina e células endoteliais podem ser identificadas com base na expressão de CD31 e SCA-1. Análise por citometria de fluxo de células endoteliais na medula óssea total mostrando a discriminação entre células endoteliais arteriolares e sinusoidais com base em ICAM1. A quantificação de células endoteliais arteriais e sinusoidais da medula óssea no tecido central e endosteal da medula óssea mostra que as células endoteliais da medula óssea arterial são mais abundantes nas regiões endosteais, enquanto os sinusóides são mais frequentes nas áreas centrais da medula óssea.Ao obter a medula óssea lavada, o volume ou o número de vezes indicado para passar PBS 2% FBS através do interior da parte central do osso não deve ser excedido. A combinação do método descrito com ensaios funcionais das populações celulares analisadas fenotipicamente forneceria informações valiosas sobre as possíveis perturbações nessas populações que ocorrem nas condições estudadas. O protocolo descrito permite a análise fenotípica de células hematopoéticas diferencialmente na medula óssea endosteal e central, possibilitando aos pesquisadores investigar perturbações na hematopiese potencialmente ocorrendo especificamente nessas localizações da medula óssea.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

É apresentada uma estratégia para analisar quantitativamente os dados histológicos na medula óssea. A microscopia confocal de células marcadas com fluorescência em seções de tecido resulta em imagens bidimensionais, que são analisadas automaticamente. As análises de co-localização de diferentes tipos de células são comparadas com dados de imagens simuladas, fornecendo informações quantitativas sobre as interações celulares.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo--vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.

Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos

Aprenda análise por citometria de fluxo de células-tronco hematopoéticas e células de nicho estromal em medula óssea murina. Este método permite estudar perturbações em populações específicas de células em diferentes condições experimentais.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal (Vídeo) | JoVE Journal

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

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