Purificação polissóbica de nódulos simbióticos de soja
1 de julho de 2022
Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.
Este protocolo é significativo porque é, pelo nosso conhecimento, o primeiro a descrever um novo metal à base de centrífuga para purificação de pórsome cinético a partir de nódulos simbióticos de soja. A grande vantagem dessa técnica é que, em combinação com o RNA-Seq, permite o estudo da relação e organizada em um tecido complexo como o nódulo simbiótico. Para começar, pese aproximadamente 0,2 gramas de nódulos intactos em um prato de pesagem, e transfira-os para um tubo pré-resfriado de dois mililitros.
Em seguida, adicione 1,2 mililitros de tampão de extração de pórsome, deixe a amostra descongelar por dois minutos e homogeneize com um moedor de tecido até a interrupção completa e homogeneização dos nódulos. Em seguida, incubar as amostras no gelo com agitação suave por 10 minutos ou até que todas as amostras tenham sido processadas e centrífuga a 16.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius para pelotar os detritos. Então, recupere o supernatante, e repita o passo da centrífuga.
Depois de recuperar cuidadosamente o extrato citosolico esclarecido, transfira uma alíquota de 200 microliter para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro limpo para isolamento total. Em seguida, despeje 4,5 mililitros da camada de sacarose de 33,5% nos tubos de centrífugas e adicione 4,5 mililitros da camada de 12% cuidadosamente e lentamente com uma micropipette P-1000. Em seguida, coloque os tubos no gelo até a adição do extrato citosolico esclarecido.
Carregue um mililitro do extrato citosolico esclarecido em cima da almofada de sacarose, tubos cuidadosamente na parede lateral do tubo. Em seguida, transfira os tubos de ultra centrífugas para baldes pré-resfriados, e centrífugas a 217,874 G por duas horas a quatro graus Celsius. Depois de descartar o extrato citosolico restante e a almofada de sacarose, suspenda a pelota polissômica com 200 microliters de tampão de re-suspensão pré-resfriado.
Em seguida, incubar por 30 minutos no gelo e, em seguida, transferir a suspensão polissomal para tubos pré-resfriados de 1,5 mililitro para prosseguir com a extração de RNA. Após homogeneizar as amostras com 750 microlitres do reagente de isolamento RNA incubar por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 200 microliters de clorofórmio frio, e agite os tubos vigorosamente por 15 segundos.
Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugar a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius para separação de fase, e transferir 500 microliters da fase aquosa superior para um tubo limpo sem perturbar a fase orgânica rosa. Em seguida, adicione 375 microliters de isopropanol frio e 0,5 microliters de Glicogênio livre RNAs.
Depois, misture bem por pipetar para cima e para baixo. Incubar a mistura por 10 minutos a quatro graus Celsius, e centrífuga a 12.000 vezes G por 15 minutos. Em seguida, descarte o supernascido, e lave o RNA precipitado com um mililitro de frio, 75% de etanol.
Misture por um breve vórtice. Em seguida, centrífuga a 7.500 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e seque a pelota de RNA.
Em seguida, dissolva a pelota em 50 microliters de água livre rnas, e incubar a 65 graus Celsius por cinco minutos. Avalie a concentração e integridade do RNA com eletroforese capilar altamente sensível e, ou eletroforese em um gel de agarose livre de 2%RNAs. Após estimar o volume amostral, adicione 0,1 volumes de três acetatos de sódio molar, três volumes de etanol frio e 0,5 microliters de RNAs, glicogênio livre.
Em seguida, misture-os completamente. A eletroforese capilar foi realizada para várias frações totais e polissômicas associadas à amostra de RNA, que demonstraram bandas de RNA ribossômicas afiadas, sem qualquer aparência manchada. No entanto, isso não se reflete nos valores do RIN, pois variam entre 5,9 e 7,5, o que corresponde a amostras não intactas.
O bioanalífero não conseguiu identificar os picos 18S e 25S como visto nos eletroferogramas, tanto para amostras de RNA total quanto polisso. Não havia sinal visual de degradação da amostra. No entanto, uma amostra foi analisada para visualizar o resultado de uma amostra quase inteiramente degradada, para comparação.
O mais importante é trabalhar em condições de preservação de pórsome e RNA durante todo o protocolo. Após sequenciar os padrões padrão de frações de RNA totais e par para a expressão genética analisada pode ser usado para identificar genes expressos diferenciais na transcrição e no nível de tradução.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para purificação de polissomos eucarióticos a partir de nódulos de soja intactos. Esta técnica permite o estudo da expressão gênica nos níveis de transcriptoma e translatoma.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Vegetal
- Análise de Expressão Gênica
Contexto
- A purificação de polissomos é essencial para o estudo da regulação da tradução.
- O entendimento da expressão gênica em nódulos simbióticos pode fornecer insights sobre as interações planta-microorganismo.
- Este método é o primeiro a utilizar uma abordagem baseada em centrífuga para a purificação cinética de polissomos a partir de nódulos de soja.
- O RNA-Seq pode ser combinado com esta técnica para uma análise abrangente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para a purificação de polissomos a partir de nódulos de soja.
- Facilitar o estudo da expressão gênica em tecidos complexos.
- Aprimorar a compreensão da relação entre transcriptoma e translatoma.
Métodos Utilizados
- Pesagem de nódulos de soja intactos e transferência para um tubo.
- Homogeneização dos nódulos com um triturador de tecidos em tampão de extração de polissomos.
- Incubação das amostras em gelo e centrifugação para sedimentar os detritos.
- Recuperação do sobrenadante e repetição da centrifugação para purificação.
Resultados Principais
- O método purifica com sucesso polissomos de nódulos de soja.
- Permite a realização de análises subsequentes de RNA-Seq para identificar genes diferencialmente expressos.
- Demonstra o potencial para o estudo de interações teciduais complexas.
- Estabelece um novo protocolo para pesquisas futuras em biologia vegetal.
Conclusões
- Este protocolo fornece uma abordagem inovadora para a purificação de polissomos.
- Abre novas perspectivas para o entendimento da expressão gênica em relações simbióticas.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para obter insights mais profundos sobre a biologia vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A purificação de polissomos de nódulos simbióticos de soja permite a investigação direta da regulação traducional em tecidos vegetais complexos, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao isolar tanto o mRNA total quanto o associado a polissomos para RNA-seq, este método fornece uma análise quantitativa da expressão gênica nos níveis do transcriptoma e do translatoma. Essas capacidades aumentam a confiança preditiva na validação de alvos e na análise de vias metabólicas em pipelines de biotecnologia vegetal.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a avaliação funcional do controle traducional em sistemas vegetais relevantes para doenças.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas ao distinguir a regulação transcricional da traducional.
- Facilita a validação de alvos por meio da comparação quantitativa de pools de mRNA.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara amostras de RNA de alta qualidade e reprodutíveis para fluxos de trabalho downstream de RNA-seq.
- Padroniza a avaliação da integridade das amostras utilizando eletroforese capilar para verificação da aptidão para sequenciamento.
- Permite análise robusta de expressão gênica diferencial em níveis transcricionais e traducionais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha os resultados da expressão gênica com a descoberta de biomarcadores traducionais em modelos de interação planta-microbio.
- Garante a continuidade do descobrimento molecular até a validação funcional em tecidos complexos.
- Apoia o avanço ajustado ao risco de alvos candidatos com base em evidências traducionais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a pesquisa translacional em biotecnologia vegetal.
- Biologia da Descoberta: Permite análise orientada por hipóteses da regulação traducional em nódulos simbióticos.
- Triagem: Fornece saídas reprodutíveis e quantitativas de RNA para análise comparativa.
- Análises: Fornece frações de mRNA de alta qualidade para análise diferencial de expressão e de vias metabólicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas moleculares a resultados funcionais em tecidos vegetais complexos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado adaptável a outros sistemas vegetais que exijam perfilagem traducional.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao resolver a regulação traducional.
- Valor Operacional: Fornece purificação padronizada e escalável de RNA para sequenciamento de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir/não prosseguir ao integrar dados de transcriptoma e translatoma.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em evidências traducionais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manuseio de tecidos vegetais e na avaliação da integridade do RNA.
- Requer acesso a instrumentação de ultracentrifugação e eletroforese capilar.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para garantir qualidade reprodutível do RNA.
- Pode exigir adaptação para outras espécies vegetais ou tipos de tecido.
- A integridade da amostra deve ser preservada durante todo o processo para assegurar análises confiáveis em etapas subsequentes.
