Name: Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprenda a induzir autofagia no corpo gorduroso de larvas de Drosophila melanogaster por depleção de aminoácidos. Este protocolo utiliza análise clonal e microscopia para comparar padrões de autofagia entre clones mutantes e células selvagens.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Somos gratos à THFC e à BDSC por fornecerem as cepas de mosca. O Dr. Tong Chao é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32030027, 91754103, 92157201) e fundos de pesquisa fundamental para as universidades centrais. Agradecemos à instalação central do Instituto de Ciências da Vida (LSI) pela prestação de serviços.

1. Cruzamento de Drosophila e postura de ovos
<ol><li>Introduzir 3 moscas adultas machos (genótipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) e 15 fêmeas (genótipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) (ver Tabela de Materiais) num frasco para injetáveis de cultura (com meio padrão de fubá/melaço/ágar Drosophila a 25 °C) para acasalamento. NOTA: Devem ser criados vários frascos de cultura da mesma cruz para garantir larvas suficientes para experiências posteriores. A linhagem de mosca macho com genótipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a carrega um sítio de FRT no cromossomo X próximo ao centrômero (FRT19A). Também expressa FLP após choque térmico a 37 °C. Um transgene com expressão ubíqua de RFP é inserido no cromossomo X. GFP-Atg8a é expressa sob o controle de cgGal4 no corpo adiposo de larvas22. A linhagem fêmea da mosca com genótipo y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP carrega uma mutação letal (Mu) e FRT19A no cromossomo X. O esquema detalhado de cruzamento é mostrado na Figura 1.</li>
	<li>Para a postura de ovos, transfira as moscas para um novo frasco de cultura. Às 48 h após a introdução, toque no frasco para injetáveis de "acasalamento" até que as moscas fiquem atordoadas e caiam na mídia na base do frasco.<ol><li>Desligue o frasco para injetáveis de "acasalamento" e cubra a boca com um frasco para injetáveis invertido sem plugue com meios frescos (frasco para injetáveis de cultura fresca). Em seguida, transfira as moscas para o frasco de cultura fresco virando e tocando os frascos.</li>
		<li>Ligue o frasco para injetáveis de cultura frescos (com as moscas transferidas) e elimine o frasco de cultura antigo. Coloque este frasco para injetáveis de cultura fresca numa incubadora a 25 °C para a postura de ovos no meio fresco. NOTA: Pré-aquecer os frascos de cultura fresca a 25 °C durante 15 minutos antes do processo de transferência de moscas ajudará as moscas a adaptarem-se rapidamente ao novo ambiente e a acelerar a postura de ovos.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire as moscas após 6 h de postura dos ovos. Se as experiências tiverem de ser repetidas, transfira essas moscas para outro frasco para injetáveis de cultura (conforme descrito no passo 1.2). Caso contrário, descarte as moscas despejando-as em um frasco contendo etanol 75%).<ol><li>Incubar o frasco para injetáveis com embriões em banho-maria a 37 °C durante 1 h para induzir a expressão de FLP. Posteriormente, coloque-os numa incubadora a 25 °C e permita que os embriões continuem a desenvolver-se. NOTA: A formação bem-sucedida de clones mutantes pode ser confirmada posteriormente através de imagens. A ausência de sinais de RFP marca os clones mutantes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. A inanição de aminoácidos induz autofagia
<ol><li>Usando uma espátula de laboratório, retire os meios contendo as larvas em desenvolvimento em uma placa de Petri 75 h após a postura dos ovos. Adicionar 3 mL de PBS 1x ao prato e separar suavemente o meio de cultura e as larvas usando pinça longa. Selecione 10 a 15 larvas de terceiro ínstar precoces. NOTA: Larvas de terceiro ínstar precoce precisam ser escolhidas com cuidado. O estágio de desenvolvimento das larvas é crítico para o sucesso deste protocolo. Devido à duração restrita da postura de ovos, espera-se que a maioria das larvas no frasco de cultura esteja no estágio inicial de terceiro ínstar por 75 h de incubação. No entanto, diferentes receitas de meios de cultura podem levar a variações no tempo de desenvolvimento das larvas. Os critérios para distinguir larvas de terceiro estádio precoce são o comprimento do corpo, a presença de espiráculos anterior e posterior, bem como os ganchos mandibulares do aparelho bucal23.</li>
	<li>Encha os poços de uma placa spot de depressão de vidro de 9 poços (consulte Tabela de Materiais) com 1x PBS. Coloque as larvas separadas do terceiro ínstar nos poços usando pinças longas e lave bem as larvas para remover todos os resíduos do meio.</li>
	<li>Tome 5 ml de solução de sacarose a 20% (em 1x PBS) num frasco para injetáveis vazio e coloque as larvas limpas de terceiro ínstar nesta solução utilizando pinças longas. Incubar este frasco para injetáveis numa incubadora a 25 °C durante 6 h antes de os colher para dissecção. NOTA: A solução de sacarose a 20% (em 1x PBS) serve como meio de privação deficiente em aminoácidos.</li>
</ol>3. Dissecção de larvas de terceiro ínstar e processamento de amostras de tecido
<ol><li>Afie dois pares de pinças #5 (veja Tabela de Materiais) uniformemente em ambos os lados com uma pedra afiada.</li>
	<li>Adicione 400 μL de 1x PBS em cada poço da placa de ponto de depressão de vidro de 9 poços e transfira as larvas para os poços com pinças longas. Coloque uma larva em um poço com o lado dorsal (o lado com a traqueia) voltado para cima.<ol><li>Segure a cutícula da larva com duas pinças #5 no meio do tronco da larva e rasgue suavemente as cutículas. Os corpos gordurosos expostos, juntamente com outros tecidos internos da larva, ainda estarão aderidos à carcaça da larva. Puxe o suficiente para expor os órgãos internos tanto quanto possível. Repita este passo para todas as larvas. NOTA: Cada larva tem dois grandes pedaços de corpo gorduroso ao longo do tronco do corpo. O tecido adiposo é uma monocamada branca, opaca e plana que pode ser facilmente distinguida ao microscópio dedissecção24.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferir a carcaça da larva para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4%. Incubar durante 30 min a 25 °C sem agitar os tubos. CUIDADO: 4% PFA é tóxico. Use luvas e máscaras para proteção. Observação : recomenda-se preparar 4% PFA em 1x buffer PBS. O pó de PFA não se dissolve em 1x PBS instantaneamente. Assim, a mistura deve ser incubada a 65 °C numa incubadora durante a noite ou agitada intermitentemente durante 45 minutos a 25 °C.</li>
	<li>Após 30 min de incubação da carcaça com PFA a 4%, pipetar a solução de PFA, adicionar 500 μL de 1x PBS no tubo e agitar suavemente o tubo em um rotador plano por 10 min antes de descartar a solução de 1x PBS (repetir 3x).</li>
	<li>Usando pinças longas, transfira a carcaça da larva fixa e lavada para um poço na placa spot de 9 depressões preenchida com 1x PBS. Usando pinças #5, remova todos os tecidos corporais não gordurosos.</li>
	<li>Use pinças #5 para montar os pedaços do corpo gordo em uma lâmina de microscópio usando glicerol 80% como meio de montagem e coloque uma lamínula por cima. NOTA: Antes de montar, verifique o pH do glicerol a 80% (usando papéis de pH, pH = 7 é ideal) para proteger o sinal de GFP. O meio de montagem (ver Tabela de Materiais) com DAPI em glicerol a 80% ajudará na obtenção de imagens dos núcleos das células do corpo adiposo. Essas lâminas são estáveis por 1 semana quando armazenadas no escuro a 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+Molecular+machinery+for+self-eating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li>
<li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%3A+Management+of+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li>
<li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eaten+alive%3A+A+history+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li>
<li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagosome%3A+Origins+unknown%2C+biogenesis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosomes%2C+phagosomes%2C+autolysosomes%2C+phagolysosomes%2C+autophagolysosomes...Wait%2CI%27mconfused%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li>
<li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li>
<li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li>
<li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li>
<li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Atg5%2FAtg7-independent+alternative+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li>
<li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li>
<li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li>
<li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li>
<li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila%3A+It%27s+more+than+just+a+garbage+chute%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li>
<li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li>
<li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F%2FDp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753(2021).</li>
<li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemerec%2C+M+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).</li>
<li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+fat+body+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li>
<li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li>
<li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li>
<li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180(2021).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O presente protocolo descreve os métodos para (1) gerar moscas portadoras de clones mutantes nos corpos gordurosos das larvas, (2) induzir autofagia através da inanição de aminoácidos e (3) dissecar os corpos gordurosos das larvas. A fim de gerar clones com sucesso nos corpos gordurosos das larvas, as seguintes etapas críticas precisam ser realizadas diligentemente. (1) Cronometrar o choque térmico com precisão é crucial, pois a recombinação mitótica só ocorre quando o tecido está sofrendo mitose, e (2) tanto a temperatu...

A autofagia é um processo de "autoalimentação" induzido por vários estresses, incluindo a inanição de aminoácidos1. A macroautofagia (doravante denominada autofagia) é o tipo de autofagia mais bem estudado e desempenha um papel insubstituível na manutenção da homeostase celular2. O mau funcionamento da autofagia está associado a diversas doençashumanas3. Além disso, alguns genes relacionados à autofagia são alvos potenciais para o tratamento de váriasdoenças4. 
A autofagia é regulada de forma altamente sofisticada5. Após a inanição, as membranas de isolamento sequestram materiais citoplasmáticos para formar autofagossomos de membrana dupla6. Os autofagossomos então se fundem com endossomos e lisossomos para formar anfissomos e autolisossomos. Com a ajuda de enzimas hidrolíticas lisossômicas, o conteúdo citoplasmático engolido é degradado e os nutrientes são reciclados7. 
A autofagia é um processo conservado evolutivamente8. Drosophila melanogaster é um ótimo modelo para o estudo do processo de autofagia in vivo. A inanição de aminoácidos induz facilmente autofagia no tecido adiposo das moscas, um análogo do fígado e do tecido adiposo humanos9. Defeitos na autofagia interrompem os distintos padrões puncta de várias proteínas relacionadas à autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1, p62, entre outras10. Portanto, a análise dos padrões desses marcadores de autofagia ajudará a discernir a ocorrência de defeitos de autofagia e a etapa de autofagia defeituosa. Por exemplo, a proteína semelhante à ubiquitina Atg8 é o marcador de autofagia mais comumente usado11. Em Drosophila melanogaster, cepas transgênicas com uma proteína fluorescente verde (GFP) marcada com Atg8a foram desenvolvidas com sucesso12. GFP-Atg8a é difundida no citosol e núcleos nas células alimentadas. Após a inanição, a GFP-Atg8a é processada e modificada pela fosfatidiletanolamina (PE) e forma puncta, que marcam as membranas de isolamento e os autofagossomos totalmente desenvolvidos13,14. Através da microscopia direta de fluorescência, a indução da autofagia pode ser facilmente observada como um aumento na formação de puncta GFP-Atg815. Atg8a puncta não se formaria em resposta à inanição na presença de um defeito de iniciação da autofagia. Como GFP-Atg8a pode ser extinta e digerida pelo pH baixo em autolisossomos, GFP-Atg8a puncta pode aumentar em número se a autofagia for bloqueada em estágios tardios16.
Como a autofagia é altamente sensível à disponibilidade nutricional17, pequenas diferenças nas condições de cultura frequentemente levam a variações nos fenótipos. Portanto, a análise clonal, método que analisa células mutantes versus células controle selvagens de um mesmo tecido, tem grande vantagem na dissecção de defeitos autofágicos18. Aproveitando a recombinação sítio-específica mediada por flippase/flippase (FLP/FRT) entre cromossomos homólogos, moscas portadoras de tecidos em mosaico são prontamente confeccionadas19,20. As células selvagens que circundam as células mutantes formam um controle interno perfeito para evitar diferenças individuais21.
O presente estudo descreve como induzir autofagia por inanição de aminoácidos e gerar tecidos corporais de gordura em mosaico que expressam GFP-Atg8a. Esses protocolos podem ser utilizados para analisar diferenças na autofagia entre clones mutantes.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr> <tr><td># 5 Fórceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>9 Dressions Placa pontual</td><td>PYREX</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100854-0100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610440-0500</td><td>Composição de 1x solução PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600445-0500</td><td>Composição de 1x solução PBS</td></tr><tr><td>Espátula de laboratório</td><td>Fisher</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinça longa</td><td>R' DEER RST-14</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio</td><td>CITOTEST</td><td>80340-1130</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>Composição de 1x solução de PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>Composição de 1x solução de PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Farinha de milho padrão / melaço / ágar mosca comida</td><td></td><td></td><td>Tong Microscópio estéreo feito em laboratório</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sinopharm Reagente químico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>Meio de montagem anti-desvanecimento Vectashield com DAPI</td><td>Vectorlabratory</td><td>H-1200-10</td><td>Meio</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de montagem recomendado<tr><td><forte>Estoques para moscas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y'w* Iso FRT19A</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td><td></td><td></td><td>Tong Lab</td></tr></tbody></table>

análise da autofagia induzida pela inanição no corpo gorduroso de larvas de drosophila melanogaster

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

A autofagia é um processo de autodigestão celular. Ele entrega carga aos lisossomos para degradação em resposta a vários estresses, incluindo fome. O mau funcionamento da autofagia está associado ao envelhecimento e a múltiplas doenças humanas. A maquinaria de autofagia é altamente conservada - desde leveduras até humanos. O corpo adiposo larval de Drosophila melanogaster, um análogo para fígado e tecido adiposo de vertebrados, fornece um modelo único para o monitoramento da autofagia in vivo. A autofagia pode ser facilmente induzida pela falta de nutrientes no corpo adiposo das larvas. A maioria dos genes relacionados à autofagia é conservada em Drosophila. Muitas linhagens de moscas transgênicas expressando marcadores de autofagia marcados foram desenvolvidas, o que facilita o monitoramento de diferentes etapas do processo de autofagia. A análise clonal permite uma comparação próxima de marcadores de autofagia em células com genótipos diferentes no mesmo pedaço de tecido. O protocolo atual detalha procedimentos para (1) gerar clones somáticos no corpo adiposo larval, (2) induzir autofagia via inanição de aminoácidos e (3) dissecar o corpo adiposo larval, com o objetivo de criar um modelo para análise de diferenças na autofagia utilizando um marcador autofagossomal (GFP-Atg8a) e análise clonal.

Sob condições de alimentação, a proteína semelhante à ubiquitina marcada com GFP, GFP-Atg8a, é difundida dentro das células. Após a fome, forma puncta verde e rotula autofagossomos. Uma vez que os autofagossomos se fundem com os lisossomos, a GFP é extinta nos autolisossomos ácidos, e os puncta verdes desaparecem. Se a autofagia não for induzida ou a maturação do autofagossomo for acelerada, espera-se que o número de pontos de GFP seja baixo. No entanto, se a fusão entre autofagossomos e lisossomos for bloqueada ou o pH ...

O presente protocolo descreve a indução de autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de nutrientes e analisa as alterações na autofagia utilizando linhagens de moscas transgênicas.

Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Este protocolo descreve como induzir autofagia no corpo adiposo de larvas de Drosophila melanogaster via depleção de aminoácidos e como analisar as diferenças na autofagia entre clones mutantes. Como a autofagia é altamente sensível à disponibilidade de nutrição em condições de cultura, a análise clonal, um método que analisa células mutantes versus células selvagens no mesmo tecido, tem uma vantagem em dissecar defeitos de autofagia. Comece introduzindo três machos e 15 fêmeas de moscas adultas em um frasco de cultura com fubá padrão ou melaço ou ágar Drosophila media a 25 graus Celsius para acasalamento.Às 48 horas após a indução, toque no frasco para injetáveis de acasalamento até que as moscas fiquem atordoadas e caiam no meio na base do frasco. Desligue o frasco para injetáveis de acasalamento e cubra a boca com um frasco para injetáveis de cultura invertida sem plugue com meios frescos. Em seguida, vire e toque nos frascos para injetáveis para transferir as moscas para o frasco de cultura fresco.Ligue o frasco para injetáveis de cultura fresca e elimine o frasco para injetáveis velho. Coloque o frasco para injetáveis de cultura fresca numa incubadora de 25 graus Celsius para a postura de ovos no meio fresco. Retire as moscas após seis horas da postura dos ovos e elimine as moscas despejando-as num frasco contendo etanol a 75%.Incubar o frasco para injetáveis com embriões num banho-maria de 37 graus Celsius durante uma hora para induzir a expressão de flippase. Posteriormente, coloque-os em uma incubadora de 25 graus Celsius e permita que os embriões continuem a se desenvolver. Usando uma espátula de laboratório, retire o meio contendo as larvas em desenvolvimento em uma placa de Petri 75 horas após a postura dos ovos.Adicione 1X PBS ao prato e separe delicadamente o meio de cultura e as larvas usando pinças longas. Em seguida, selecione 10 a 15 larvas iniciais de terceiro ínstar. Encha os poços de uma placa de ponto de depressão de vidro de nove poços com 1X PBS e coloque as larvas separadas do terceiro ínstar nos poços usando pinças longas.Lave bem as larvas para remover todos os resíduos do meio. Tome cinco mililitros de solução de sacarose a 20% num frasco para injetáveis vazio e coloque as larvas limpas de terceiro ínstar nesta solução utilizando pinças longas. Incubar este frasco para injetáveis numa incubadora de 25 graus Celsius durante seis horas antes de os colher para dissecção.Adicione 1X PBS em cada poço da placa de ponto de depressão de vidro de nove poços e transfira as larvas para os poços com pinças longas. Coloque uma larva em um poço com o lado dorsal voltado para cima. Segure a cutícula da larva com duas pinças de 5 no meio do tronco da larva e rasgue suavemente as cutículas.Os corpos gordurosos expostos, juntamente com outros tecidos internos da larva, ainda estarão aderidos à carcaça da larva. Puxe o suficiente para expor os órgãos internos tanto quanto possível. Repita este passo para todas as larvas.Transfira a carcaça da larva para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de PFA a 4% e incube por 30 minutos a 25 graus Celsius sem agitar os tubos. Após 30 minutos, pipetar a solução de PFA. Adicione 500 microlitros de 1X PBS no tubo.Agite suavemente o tubo num rotador plano durante 10 minutos e, em seguida, elimine a solução de PBS 1X. Repita isso três vezes. Usando pinças longas, transfira a carcaça da larva fixa e lavada para um poço na placa de nove pontos de depressão preenchida com PBS 1X.Retire todos os tecidos corporais não gordurosos com 5 pinças. Finalmente, monte os pedaços do corpo gorduroso em uma lâmina de microscópio usando 80% de glicerol como meio de montagem e coloque uma lamínula por cima. O mutante um e o mutante dois são dois mutantes letais independentes no cromossomo X e as moscas FRT 19A brancas amarelas isogenizadas servem como controle aqui.Os padrões de GFP-Atg8a foram analisados nos corpos gordurosos de larvas de larvas controle, mutante um ou mutante dois, e os clones mutantes ou controle foram marcados negativamente por RFP. Nos clones controle, os padrões de GFP-Atg8a Puncta foram semelhantes aos das células RFP positivas circundantes. Nos clones mutantes de um mutante, os GFP-Atg8a Puncta foram bastante reduzidos.E em dois clones mutantes, o número e o tamanho de GFP-Atg8a Puncta foram aumentados. O estágio de desenvolvimento das larvas é crítico aqui. O tempo de desenvolvimento e a duração da fome precisam ser modificados de acordo com as receitas do meio de cultura de cada laboratório.Este procedimento pode ser aplicado para explorar a autofagia seletiva. Por exemplo, a mitofagia pode ser monitorada em corpos gordurosos de moscas anexando uma proteína fluorescente a uma sequência de alvos mitocondriais.

analyzing-starvation-induced-autophagy-drosophila-melanogaster-larval

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

Nós apresentamos robustos métodos bioquímicos e microscópicos para...

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

O circuito de alimentação em larvas de Drosophila melanogaster serve um modelo simples, mas poderosa que permite mudanças na taxa de alimentação a ser correlacionada com alterações no circuito neural stomatogastric. Este circuito é composto por neurónios serotonérgicos centrais que enviam projecções para os ganchos na boca, bem como o tubo digestivo anterior.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

Aqui apresentamos um método para medir os níveis de gordura organismais no terceiro estádio (L3) fase larval de Drosophila melanogaster. Este método explora a relativamente baixa densidade de tecido adiposo para diferenciar entre as larvas com reservas de gordura alterados. A análise à base de empuxo é uma valiosa ferramenta para a triagem rápida, reprodutível e econômico.

Um método baseado em flutuabilidade da determinação dos níveis de gordura no<em&gt; Drosophila</em

Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Apresentamos um protocolo para medição de consumo de oxigênio e a acidificação extracelular nos cérebros de larvas e adultos de Drosophila melanogaster . Um analisador metabólico é utilizado com um protocolo adaptado e otimizado. Microtecido restrições são uma componente essencial do presente protocolo e foram concebidas e criadas especificamente para a sua utilização nesta análise.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Descrito aqui é um protocolo que permite a quantificação colorimétrica da quantidade de alimentos comidos dentro de um intervalo definido de tempo por larvas de melanogaster Drosophila expostas a dietas de diferentes qualidades macronutrientes. Esses ensaios são conduzidos no contexto de uma tela termogenética neuronal.

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Este protocolo descreve um ensaio comportamental para registrar o comportamento de busca provocado por açúcar usando Drosophila melanogaster. O ensaio pode ser utilizado para estudar comportamentos relacionados à alimentação e ao forrageamento, bem como os mecanismos neuronais subjacentes.

Rastreando o comportamento de busca local provocado pelo açúcar em Drosophila

Aprenda a induzir autofagia no corpo gorduroso de larvas de Drosophila melanogaster por depleção de aminoácidos. Este protocolo utiliza análise clonal e microscopia para comparar padrões de autofagia entre clones mutantes e células selvagens.

Análise da Autofagia Induzida pela Inanição no Corpo Gorduroso de Larvas de Drosophila melanogaster

Explorar mais vídeos