Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco

O método pode ajudar a responder a questões pré-clínicas relacionadas à segurança cardíaca e toxicidade usando dados reais baseados em humanos para uma transição segura de novos candidatos a medicamentos para estágios clínicos. Em vez de utilizar um conjunto de diferentes técnicas in vitro e in vivo, a principal vantagem deste sistema híbrido é a avaliação simultânea de cardiomiócitos derivados de iPC humano, parâmetros eletrofisiológicos e de viabilidade, e a análise das propriedades contráteis em condições fisiológicas. Este método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, pois abrange alterações eletrofisiológicas, estruturais e contráteis de cardiomiócitos e um sistema de maior rendimento que permite o teste de 69 poços simultaneamente.

Para iniciar o revestimento da placa, deixe o fundo da placa de contração coberto pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade. Para semear cardiomiócitos, prepare uma solução diluída de revestimento em gel EHS transferindo 2,75 mililitros de gel EHS pronto para uso e 8,25 mililitros de DPBS com cálcio e magnésio em um tubo centrífugo estéril. Em seguida, misture a solução.

Remova o protetor de membrana da placa de contração. Transfira a solução de revestimento preparada para um reservatório de reagente estéril no robô de automação de laboratório. Use o programa, adicione 100 microlitros com o robô de automação de laboratório e adicione 100 microlitros da solução de revestimento por poço.

Em seguida, coloque a tampa de volta na placa de 96 poços e incube por três horas a 37 graus Celsius. Após o descongelamento e a contagem das células, ajuste as células no meio de revestimento recomendado de acordo com as instruções do fabricante da célula, resultando em 11 vezes 10 a sextas células por 11 mililitros para semear uma placa inteira de 96 poços. Use o programa remover 100 microlitros para remover a solução de gel EHS dos poços com o robô de automação de laboratório.

Em seguida, transfira os 11 mililitros de suspensão celular para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório e semeie as células com 100 microlitros de suspensão por poço. Usando o programa, as células adicionam 100 microlitros. Imediatamente após a semeadura da célula, transfira a placa flexível de 96 poços para a incubadora com umidade controlada a 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%, e deixe as células se estabelecerem durante a noite.

Aqueça 22 mililitros de meio de manutenção de cardiomiócitos a serem adicionados a cada placa a 37 graus Celsius em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. 18 a 24 horas após a semeadura das placas, transfira o meio fresco para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação de laboratório. Em seguida, execute a remoção média com o programa, remova 100 microlitros.

Em seguida, coloque o reservatório de reagente contendo o meio fresco no robô de automação de laboratório e dispense 200 microlitros do meio fresco por poço com o programa, adicione 100 microlitros. Execute esta etapa duas vezes para atingir 200 microlitros por poço. Imediatamente após a troca média, transfira a placa para a incubadora.

Realize uma troca média a cada dois dias até a adição do composto. Quatro a seis horas antes da adição do composto, execute uma mudança final de meio, transferindo 22 mililitros de tampão de ensaio fresco e quente para um reservatório de reagente estéril e deixando-o ao lado do robô de automação de laboratório. Imediatamente após a troca média, transfira a placa flexível de volta para a incubadora.

Uma hora antes da medição da linha de base, transfira a placa para o respectivo dispositivo de medição. No software de controle, abra Editar Protocolo e selecione o respectivo Modo de Medição, Local de Flexão ou Impedância EFP. Defina a duração ou o comprimento da varredura de uma medição para 30 segundos e um intervalo de repetição para 10 minutos antes de salvar o número do protocolo.

Em seguida, selecione Iniciar Protocolo e continue a preencher os campos solicitados. Quando os parâmetros estiverem definidos, selecione Iniciar medição. Realize um mínimo de três medições basais em intervalos de cinco minutos pouco antes da adição do composto.

Remova 50 microlitros do tampão de ensaio de cada poço sem remover a placa flexível de 96 poços do dispositivo de medição, seguido pela adição de 50 microlitros da solução composta quatro vezes concentrada em cada poço da placa de acordo com o plano de medição. Após a adição do composto, selecione adicionar marcador de reagente para definir o layout da placa composta e o volume da solução composta. Em seguida, selecione Prosseguir com a Medição Padrão ou prosseguir com a Série de Medição de acordo com o plano experimental.

A Análise Representativa mostra os efeitos do inibidor da quinase Erlotinib na contratilidade dos cardiomiócitos humanos derivados da iPSC. Na concentração mais baixa, o erlotinib induziu uma diminuição estatisticamente insignificante da amplitude, enquanto as concentrações micromolares de erlotinib apresentaram efeitos cardiotóxicos dependentes do tempo e da dose. O início do efeito foi observado a partir de 96 horas com um erlotinibe micromolar, enquanto o tratamento com 10 erlotinib micromolares resultou numa diminuição significativa 24 horas após a adição do composto.

Após a aplicação de 10 epirrubicina micromolar, as células pararam de bater dentro de 24 horas. Com a aplicação de uma epirrubicina micromolar, uma diminuição drástica da amplitude após 24 horas foi seguida pela cessação completa do batimento até 48 horas. Aos 100 nanomolares, observou-se uma diminuição dependente do tempo na amplitude do batimento.

Na menor concentração de 10 nanomolares, a amplitude flutuou de forma constante, confirmando que o efeito da epirrubicina foi apenas dose-dependente. O tratamento com doxorrubicina e nifedipina por 24 horas reduz a viabilidade celular de forma dependente da concentração e do tempo. Após a aplicação de concentrações crescentes de nifedipina, os registros de potencial de campo nas células revelam um encurtamento dependente da concentração da duração do campo normalizado.

A avaliação da nifedipina quanto à contratilidade cardíaca também mostrou uma diminuição significativa da amplitude dependente da concentração na medida aguda com concentrações nanomolares e 13 nanomolares. É importante lembrar que as células são geralmente sensíveis a parâmetros ambientais, como mudanças de temperatura e pH, bem como simulação mecânica, que é especialmente suportada nas placas de contração.