Name: Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a avaliar segurança cardíaca pré-clínica usando cardiomiócitos derivados de iPSC humanos em sistema híbrido de 96 poços. Este método permite monitoramento simultâneo de parâmetros eletrofisiológicos, viabilidade e função contrátil em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado por subvenções do Ministério Federal Alemão para Assuntos Econômicos e Ação Climática (ZIM) e do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (KMUinnovativ). Agradecemos à FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EUA) por gentilmente fornecer cardiomiócitos e à Ncardia B.V. (Leiden, Holanda) por gentilmente fornecer cardiomiócitos, usados neste estudo.

NOTA: O fluxo de trabalho para a contratilidade e a medição da impedância/EFP é apresentado na Figura 2 Suplementar.
1. Revestimento da placa
<ol><li>Abra a embalagem selada a vácuo e retire a placa de 96 poços. Os procedimentos de manuseio para placas de 96 poços de ambos os módulos são os mesmos. Deixe a placa de contração coberta pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade.</li>
	<li>Revestir as placas flexíveis de 96 poços para semear cardiomiócitos.<ol><li>Prepare uma solução diluída de revestimento de gel EHS transferindo 2,75 mL de solução pronta para uso de gel EHS em um tubo de centrífuga estéril. Em seguida, adicione 8,25 mL de DPBS com Ca 2+ e Mg2+. Misture a solução com cuidado. NOTA: Opcionalmente, a fibronectina também pode ser usada para revestir os poços: preparar 13 mL de solução de revestimento de fibronectina em um tubo de centrífuga estéril diluindo 650 μL de solução-estoque de fibronectina (1 μg/mL) em 13 mL de DPBS com Ca 2+ e Mg2+, resultando em uma solução de trabalho de 50 μg/mL. Misture a solução com cuidado.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira a solução de revestimento para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório.</li>
	<li>Adicione 100 μL da solução de revestimento por poço com o robô de automação de laboratório usando o programa "ADD100μL". Colocar a tampa de volta na placa de 96 poços e incubar durante 3 h a 37 °C. NOTA: O programa para o robô de automação de laboratório precisa ser predefinido manualmente de antemão.</li>
</ol>2. Semeadura de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC em placas flexíveis de 96 poços (Dia 0)
<ol><li>Descongele as células de acordo com as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>Conte as células com uma câmara de contagem manual e ajuste as células no meio de chapeamento recomendado de acordo com as instruções do fabricante da célula (por exemplo, 1 x 105 células/poço), resultando em 11 x 106 células/11 mL para semear uma placa inteira de 96 poços.</li>
	<li>Remova a solução de gel EHS dos poços com o robô de automação de laboratório usando o programa "REMOVE100μL". Remova o reservatório reagente que contém a solução de revestimento dispensada do robô.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular (11 mL no total) para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório e semeie as células com 100 μL/poço usando o programa "CELLS_ADD100 μL".</li>
	<li>Imediatamente após a semeadura celular, transfira a placa flexível de 96 poços para a incubadora (37 °C, 5% de CO2, com umidade controlada) e deixe as células assentarem durante a noite.</li>
</ol>3. Troca média de placas flexíveis de 96 poços (Dia 1)
<ol><li>Aquecer pelo menos 22 mL de meio de manutenção de cardiomiócitos por placa a 37 °C em um tubo de centrífuga de 50 mL, 18-24 h após a semeadura das placas.</li>
	<li>Transfira o meio fresco (pelo menos 22 mL) para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação de laboratório. Coloque um reservatório de reagente vazio no robô e execute a remoção do meio com o programa "REMOVE100μL". Posteriormente, trocar o reservatório reagente contendo o meio residual pelo reservatório reagente contendo o meio fresco e dispensar 200 μL do meio fresco por poço com o programa "ADD100μL". Execute esta etapa duas vezes para atingir 200 μL/poço.</li>
	<li>Imediatamente após a troca média, transfira a placa de volta para a incubadora.</li>
	<li>Realize uma troca média (200 μL/poço) a cada dois dias até a adição do composto.</li>
</ol>4. Troca média final antes da adição do composto (Dia 5-7)
<ol><li>Realize uma mudança final de meio 4-6 h antes da adição do composto.</li>
	<li>Aqueça pelo menos 22 mL de tampão de ensaio para uma placa flexível de 96 poços. O tampão de ensaio consiste em meio de manutenção ou seus derivados (por exemplo, meio sérico baixo/nenhum, meio livre de vermelho fenol ou outros tampões isotônicos).</li>
	<li>Transfira o meio fresco para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação do laboratório. Coloque um reservatório de reagente vazio no robô e execute a remoção do meio. Posteriormente, trocar o reservatório do reagente que contém o meio residual pelo reservatório do reagente que contém o meio fresco e dispensar 200 μL/poço do meio fresco.</li>
	<li>Imediatamente após a troca média, transfira a placa flexível de volta para a incubadora.</li>
</ol>5. Adição de compostos e gravação de dados (Dia 5-7)
NOTA: Um exemplo de plano de medição para o experimento é dado na Figura Suplementar 3.
<ol><li>Prepare a solução de trabalho por composto na concentração de 4x no exaustor de fluxo laminar usando uma placa de poço regular estéril de 96 profundidades. A solução composta é baseada no tampão de ensaio usado na etapa 4. Transferir a placa do poço de 96 profundidades que contém a solução composta por pelo menos 1 h para a incubadora para ajustá-la à mesma condição que a placa flexível. NOTA: A concentração de 1x de cada droga utilizada para cada experimento é fornecida nas figuras e legendas.</li>
	<li>Transfira a placa para o respectivo dispositivo de medição 1 h antes de realizar uma medição de linha de base.</li>
	<li>Abra o Protocolo de Edição no software de controle (parte do sistema de análise de células híbridas) e selecione a respectiva contratilidade ou impedância do modo de medição/EFP.</li>
	<li>Defina a duração da varredura (comprimento de uma medição; por exemplo, 30 s) e o intervalo de repetição (tempo entre as medições; por exemplo, 5 min) e salve o número do protocolo.</li>
	<li>Selecione Iniciar protocolo > Continuar e preencha os campos solicitados.</li>
	<li>Por fim, selecione Iniciar medição. Realize um mínimo de três medições de linha de base (varreduras) em intervalos de 5 minutos pouco antes da adição do composto. NOTA: Dados de exemplo de uma medição de linha de base de contratilidade usando o módulo de contratilidade antes da adição de compostos são representados na Figura 4 Suplementar</li>
	<li>Remova 50 μL do tampão de ensaio de cada poço sem remover a placa flexível de 96 poços do dispositivo de medição.</li>
	<li>Adicionar 50 μL da solução composta concentrada 4x em cada poço da placa, de acordo com o plano de medição.</li>
	<li>Selecione Adicionar marcador de região e defina o layout da placa composta e o volume da solução composta após a adição do composto.</li>
	<li>Finalmente, selecione Prosseguir com a medição padrão ou Prosseguir com a série de medição de acordo com o plano experimental.</li>
</ol>6. Análise dos dados
<ol><li>Com o software de gravação, meça varreduras, cujo comprimento e intervalo de repetição são definidos pelo usuário.</li>
	<li>Com o software de análise, capture a forma do sinal lendo parâmetros como amplitude, taxa de batida, largura de pulso e assim por diante, automaticamente. NOTA: Um sinal médio, incluindo o desvio padrão, a chamada batida média, é calculado automaticamente com base nos dados de uma varredura. O usuário pode definir os parâmetros de contratilidade/IMP/EFP que o software calcula e exibe.</li>
	<li>Com software de análise calcular a curva dose-resposta e IC50/EC50 para cada composto. NOTA: Os dados brutos e os resultados da análise gerados com o software de análise podem ser facilmente exportados em uma variedade de formatos. Finalmente, os relatórios de dados são gerados automaticamente para resumir e arquivar os resultados experimentais. Uma descrição abrangente do que e como um sinal EFP é medido é discutida em 17.</li>
</ol>

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</ol>

B.L., M.Go. e P.L. são empregados na innoVitro GmbH, fabricante das placas flexíveis. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. e S.S. são empregados na Nanion Technologies GmbH, fabricante do dispositivo híbrido.

O sistema híbrido impedância/EFP/contratilidade é uma metodologia abrangente para avaliação farmacológica e toxicológica de alta segurança de rendimento de passivos cardíacos para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. Ele fornece uma abordagem moderna para testes de segurança pré-clínicos sem o uso de modelos animais, mas com maiores capacidades de rendimento que reduzem significativamente o tempo e os custos. Este sistema tem o potencial de ser usado como uma abordagem complementar para o Langendorff Heart e o...

Um dos principais objetivos do desenvolvimento de medicamentos modernos é a melhoria da taxa de sucesso do banco ao leito de novas terapêuticas no pipeline de descoberta de medicamentos. O teste farmacológico de segurança desses novos medicamentos geralmente revela reações adversas a medicamentos no sistema cardiovascular que representam quase um quarto da taxa de atrito de medicamentos nos estágios pré-clínicos1. O desenvolvimento e a integração de novas metodologias de abordagem (NAMs) desempenham um papel fundamental na modernização da avaliação pré-clínica, em particular dos órgãos da bateria central, como o coração. Como essas metodologias são abordagens livres de animais, o uso de modelos celulares de base humana, como cardiomiócitos (MCs) de origem de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), tornou-se o cavalo de batalha na última década para a avaliação moderna de questões farmacológicas e toxicológicas de segurança2. Os sistemas de ensaio amplamente utilizados para tais investigações são as abordagens experimentais baseadas em microeletrodos (MEA) e corantes sensíveis à tensão3.
No entanto, a alegada imaturidade fenotípica e funcional desse tipo de célula coloca obstáculos no caminho de um modelo celular ideal de base humana, com o potencial de reduzir as lacunas translacionais entre estudos não clínicos e clínicos4.
Uma tremenda pesquisa foi conduzida ao longo dos anos para entender a razão do fenótipo imaturo implícito e encontrar maneiras de impulsionar o processo de maturação dos iPSC-CMs humanos in vitro.
A falta de sinais de maturação cardíaca, como tempos prolongados de cultura celular, ausência de outros tipos de células nas proximidades ou falta de estimulação hormonal, mostrou afetar o processo de maturação5. Além disso, o ambiente não fisiológico das placas regulares de cultura celular foi identificado como uma causa significativa que impede a maturação dos CMiPS humanos, devido à falta de rigidez fisiológica do substrato do coração humano nativo 5,6.
Diferentes sistemas de ensaio com foco em condições fisiológicas nativas foram desenvolvidos para lidar com essa questão, incluindo sistemas de cultura de células 3D em que as células são alinhadas tridimensionalmente para se assemelharem à arquitetura cardíaca nativa em vez de culturas celulares bidimensionais típicas7. Embora a maturação melhorada seja obtida com ensaios 3D, a necessidade de uma força de trabalho qualificada e o baixo rendimento desses sistemas dificultam um uso abundante deste no processo de desenvolvimento de medicamentos, uma vez que o tempo e o custo desempenham um papel fundamental na avaliação de novas terapêuticas em nível financeiro8.
Leituras importantes para avaliação farmacológica e toxicológica de segurança de novas terapêuticas são alterações nas características funcionais e estruturais dos CMiPS humanos, uma vez que as reações adversas medicamentosas induzidas por compostos do sistema cardiovascular geralmente afetam uma ou ambas as propriedades 1,9. Exemplos bem conhecidos de reações adversas tão amplas são medicamentos anticancerígenos da família das antraciclinas. Aqui, efeitos funcionais e estruturais adversos perigosos sobre o sistema cardiovascular são amplamente relatados durante e após o tratamento do câncer em pacientes, bem como com ensaios in vitro baseados em células10,11.
No presente estudo, descrevemos uma metodologia abrangente para a avaliação dos efeitos colaterais de compostos funcionais e estruturais em CM-hiPSC. A metodologia inclui a análise da força contrátil dos cardiomiócitos e da impedância/análise do Potencial de Campo Extracelular (PPE). A força contrátil é medida sob condições fisiológicas mecânicas, com as células cultivadas em substratos de silicone macios (33 kPa), refletindo o ambiente mecânico do tecido cardíaco humano nativo.
O sistema é equipado com placas de 96 poços para análise de alto rendimento de CMiPS humanos para estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos de segurança cardíaca e, portanto, oferece uma vantagem às abordagens 3D atualmente usadas, como coração de Langendorff ou fatias cardíacas12,13.
Em detalhes, o sistema híbrido é composto por dois módulos, seja para a avaliação da contratilidade cardíaca em condições fisiológicas ou para a análise da toxicidade estrutural celular em tempo real 6,14. Ambos os módulos trabalham com placas especializadas de alto rendimento de 96 poços para aquisição de dados rápida e econômica.
Sem a necessidade de uma construção 3D, o módulo de contratilidade emprega placas especiais que contêm membranas de silicone flexíveis como substrato para as células, em vez do vidro rígido ou plástico que as placas de cultura celular regulares geralmente consistem. As membranas refletem as propriedades biomecânicas típicas do coração humano e, portanto, imitam as condições in vivo de uma maneira de alto rendimento. Embora as CMiPSC humanas muitas vezes não apresentem o comportamento dos cardiomiócitos adultos em relação à inotropia positiva induzida por compostos em outros ensaios baseados em células14, uma reação mais semelhante à adulta pode ser avaliada quando as células são cultivadas nas placas do módulo de contratilidade. Em estudos anteriores, foi demonstrado que as CMi iPSC apresentam efeitos inotrópicos positivos no tratamento com compostos como isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil 6,15. Aqui, múltiplos parâmetros de contratilidade podem ser avaliados, como parâmetros primários como a amplitude da força de contração (mN/mm2), duração do batimento e taxa de batimento, bem como parâmetros secundários do ciclo de contração, como área sob a curva, inclinações de contração e relaxamento, variações da taxa de batimento e arritmias (Figura Suplementar 1)16 . As alterações induzidas por drogas em todos os parâmetros são avaliadas de forma não invasiva por detecção capacitiva de distância. Os dados brutos são analisados posteriormente por softwares especializados.
O módulo de toxicidade estrutural adiciona seus parâmetros únicos de impedância e EFP como leitura da toxicidade celular estrutural e da análise das propriedades eletrofisiológicas17,18. A tecnologia de espectroscopia de impedância elétrica revela alterações induzidas por compostos na densidade celular ou na integridade celular e monocamada monitoradas em tempo real, como demonstrado com CMiPSC humanos tratados com compostos cardiotóxicos conhecidos13. Com leituras de impedância em diferentes frequências (1-100 kHz) é possível dissecar ainda mais uma resposta fisiológica e, assim, revelar mudanças na topografia da membrana, nas junções célula-célula ou célula-matriz é alcançável. O registro adicional de PFE de CMiPS humanos possibilita ainda a análise dos efeitos eletrofisiológicos provocados pelo tratamento composto, como foi demonstrado à luz do estudo CiPA17,19.
No presente estudo, foram empregados CMiPSC humanos, tratados com epirrubicina e doxorrubicina, ambos bem descritos como antraciclinas cardiotóxicas, e erlotinibe, um inibidor da tirosina quinase (TKI) com um risco bastante baixo de toxicidade cardiovascular. A avaliação crônica com epirrubicina, doxorrubicina e erlotinibe foi realizada por 5 dias. O resultado mostra pequenas alterações na contratilidade e impedância de bases quando as células foram tratadas com erlotinib, mas uma diminuição tóxica dependente do tempo e da dose na amplitude de contração e impedância de base quando tratadas com epirrubicina e doxorrubicina, respectivamente. As medidas agudas foram realizadas com o bloqueador dos canais de cálcio nifedipina e mostraram uma diminuição na amplitude de contração, duração do potencial de campo e impedância de base, demonstrando efeitos colaterais cardiotóxicos deste composto nos níveis funcionais e estruturais.

<table><tbody><tr><td>Cardiomiócitos humanos comerciais derivados de iPSC&nbsp;</td><td>Centrífuga Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>(tubos de 50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15878722</td><td></td></tr><tr><td>pipeta ajustável de 12 canais (100-1250 &mu; L)</td> <td>Integra Biosciences</td><td>4634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS com Ca2+ e Mg2+GE</td> <td>Healthcare HyClone</td><td>SH304264.01</td><td></td></tr><tr><td>96 placa de poço profundo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A43075</td><td></td></tr><tr><td>gel EHS</td><td></td><td></td><td>Gel de matriz extracelular</td></tr><tr><td>FLEXcyte 96/CardioExcyte dispositivo híbrido</td><td>Nanion Technologies&nbsp;</td><td>19 1004 1005</td><td>Sistema de análise de células híbridas&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Sensor FLX-96 FLEXcyte Nanion</td><td>Technologies</td><td>20 1010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Solução estoque de fibronectina (Opcional ao Geltrex)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>Cardiomiócitos derivados de iPSC humano Meio de plaqueamento e manutenção</td><td>FCDI</td><td>R1059</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51023121</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de Fluxo Laminar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51032678</td><td></td></tr><tr><td>NSP-96 CardioExcyte 96 Placas de Sensor 2.0 mm transparentes</td><td>Nanion Technologies</td><td>20 1011</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta (1250&micro; L)</td> Reservatório de reagente <td>de 94420813</td><td></td> <td>Integra Biosciences</td></tr><tr><td></td><td>Integra Biosciences</td><td>8096-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica (por exemplo, 25 mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16440901</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta ajustável de canal único (por exemplo, 100-1000 &mu; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aspiração a vácuo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567479</td><td></td></tr><tr><td>Opcional: VIAFLO ASSIST</td><td>Integra Biosciences</td><td>4500</td><td>Automação de laboratório Robô</td></tr><tr><td>Banho-maria (37 &deg; C)</td> <td>Thermo Fisher 15365877</td><td></td><td></td> Científica</tr></tbody></table>

sistema de análise de células híbridas para avaliação de alterações estruturais e contráteis de cardiomiócitos derivados de ipsc humanos para avaliação pré-clínica de risco cardíaco

Hybrid Cell Analysis System to Assess Structural and Contractile Changes of Human iPSC-Derived Cardiomyocytes for Preclinical Cardiac Risk Evaluation

A avaliação da contratilidade cardíaca é de imensa importância para o desenvolvimento de novas terapêuticas e sua transição segura para os estágios clínicos. Embora os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) prometam servir como um modelo relevante para o ser humano em fases pré-clínicas de descoberta de medicamentos e farmacologia de segurança, sua maturidade ainda é controversa na comunidade científica e em constante desenvolvimento. Apresentamos uma tecnologia híbrida de contratilidade e impedância/potencial de campo extracelular (EFP), adicionando recursos significativos de promaturação a uma plataforma de 96 poços padrão da indústria.
O sistema de impedância/EFP monitora a funcionalidade celular em tempo real. Além da taxa de batimento das células contráteis, as leituras de espectroscopia de impedância elétrica detectam alterações morfológicas induzidas por compostos, como densidade celular e integridade da monocamada celular. No outro componente do sistema de análise de células híbridas, as células são cultivadas em membranas bio-compatíveis que imitam o ambiente mecânico do tecido cardíaco real. Este ambiente fisiológico suporta a maturação de hiPSC-CMs in vitro, levando a respostas contráteis semelhantes a mais adultos, incluindo efeitos inotrópicos positivos após o tratamento com isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil. Parâmetros como a amplitude da força de contração (mN/mm2) e a duração do batimento também revelam efeitos a jusante de compostos com influência nas propriedades eletrofisiológicas e no manuseio do cálcio.
O sistema híbrido fornece a ferramenta ideal para a análise holística de células, permitindo a avaliação pré-clínica do risco cardíaco além das perspectivas atuais de ensaios baseados em células relevantes para humanos.

Os efeitos do inibidor de quinase erlotinib sobre a contratilidade dos CM-hiPSC são mostrados na Figura 1. As células foram tratadas com concentrações variando de 10 nM a 10 μM por 5 dias e os parâmetros de batimento foram registrados diariamente. O erlotinibe, um EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e inibidor da tirosina quinase com um risco comparativamente baixo de cardiotoxicidade, teve uma dose menor e um efeito dependente do tempo nos CM-hiPSC apenas em concentrações na ...

A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.

Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco

Cardiac contractility assessment is of immense importance for the development of new therapeutics and their safe transition into clinical stages. While ...

O método pode ajudar a responder a questões pré-clínicas relacionadas à segurança cardíaca e toxicidade usando dados reais baseados em humanos para uma transição segura de novos candidatos a medicamentos para estágios clínicos. Em vez de utilizar um conjunto de diferentes técnicas in vitro e in vivo, a principal vantagem deste sistema híbrido é a avaliação simultânea de cardiomiócitos derivados de iPC humano, parâmetros eletrofisiológicos e de viabilidade, e a análise das propriedades contráteis em condições fisiológicas. Este método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, pois abrange alterações eletrofisiológicas, estruturais e contráteis de cardiomiócitos e um sistema de maior rendimento que permite o teste de 69 poços simultaneamente.Para iniciar o revestimento da placa, deixe o fundo da placa de contração coberto pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade. Para semear cardiomiócitos, prepare uma solução diluída de revestimento em gel EHS transferindo 2,75 mililitros de gel EHS pronto para uso e 8,25 mililitros de DPBS com cálcio e magnésio em um tubo centrífugo estéril. Em seguida, misture a solução.Remova o protetor de membrana da placa de contração. Transfira a solução de revestimento preparada para um reservatório de reagente estéril no robô de automação de laboratório. Use o programa, adicione 100 microlitros com o robô de automação de laboratório e adicione 100 microlitros da solução de revestimento por poço.Em seguida, coloque a tampa de volta na placa de 96 poços e incube por três horas a 37 graus Celsius. Após o descongelamento e a contagem das células, ajuste as células no meio de revestimento recomendado de acordo com as instruções do fabricante da célula, resultando em 11 vezes 10 a sextas células por 11 mililitros para semear uma placa inteira de 96 poços. Use o programa remover 100 microlitros para remover a solução de gel EHS dos poços com o robô de automação de laboratório.Em seguida, transfira os 11 mililitros de suspensão celular para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório e semeie as células com 100 microlitros de suspensão por poço. Usando o programa, as células adicionam 100 microlitros. Imediatamente após a semeadura da célula, transfira a placa flexível de 96 poços para a incubadora com umidade controlada a 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%, e deixe as células se estabelecerem durante a noite.Aqueça 22 mililitros de meio de manutenção de cardiomiócitos a serem adicionados a cada placa a 37 graus Celsius em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. 18 a 24 horas após a semeadura das placas, transfira o meio fresco para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação de laboratório. Em seguida, execute a remoção média com o programa, remova 100 microlitros.Em seguida, coloque o reservatório de reagente contendo o meio fresco no robô de automação de laboratório e dispense 200 microlitros do meio fresco por poço com o programa, adicione 100 microlitros. Execute esta etapa duas vezes para atingir 200 microlitros por poço. Imediatamente após a troca média, transfira a placa para a incubadora.Realize uma troca média a cada dois dias até a adição do composto. Quatro a seis horas antes da adição do composto, execute uma mudança final de meio, transferindo 22 mililitros de tampão de ensaio fresco e quente para um reservatório de reagente estéril e deixando-o ao lado do robô de automação de laboratório. Imediatamente após a troca média, transfira a placa flexível de volta para a incubadora.Uma hora antes da medição da linha de base, transfira a placa para o respectivo dispositivo de medição. No software de controle, abra Editar Protocolo e selecione o respectivo Modo de Medição, Local de Flexão ou Impedância EFP. Defina a duração ou o comprimento da varredura de uma medição para 30 segundos e um intervalo de repetição para 10 minutos antes de salvar o número do protocolo.Em seguida, selecione Iniciar Protocolo e continue a preencher os campos solicitados. Quando os parâmetros estiverem definidos, selecione Iniciar medição. Realize um mínimo de três medições basais em intervalos de cinco minutos pouco antes da adição do composto.Remova 50 microlitros do tampão de ensaio de cada poço sem remover a placa flexível de 96 poços do dispositivo de medição, seguido pela adição de 50 microlitros da solução composta quatro vezes concentrada em cada poço da placa de acordo com o plano de medição. Após a adição do composto, selecione adicionar marcador de reagente para definir o layout da placa composta e o volume da solução composta. Em seguida, selecione Prosseguir com a Medição Padrão ou prosseguir com a Série de Medição de acordo com o plano experimental.A Análise Representativa mostra os efeitos do inibidor da quinase Erlotinib na contratilidade dos cardiomiócitos humanos derivados da iPSC. Na concentração mais baixa, o erlotinib induziu uma diminuição estatisticamente insignificante da amplitude, enquanto as concentrações micromolares de erlotinib apresentaram efeitos cardiotóxicos dependentes do tempo e da dose. O início do efeito foi observado a partir de 96 horas com um erlotinibe micromolar, enquanto o tratamento com 10 erlotinib micromolares resultou numa diminuição significativa 24 horas após a adição do composto.Após a aplicação de 10 epirrubicina micromolar, as células pararam de bater dentro de 24 horas. Com a aplicação de uma epirrubicina micromolar, uma diminuição drástica da amplitude após 24 horas foi seguida pela cessação completa do batimento até 48 horas. Aos 100 nanomolares, observou-se uma diminuição dependente do tempo na amplitude do batimento.Na menor concentração de 10 nanomolares, a amplitude flutuou de forma constante, confirmando que o efeito da epirrubicina foi apenas dose-dependente. O tratamento com doxorrubicina e nifedipina por 24 horas reduz a viabilidade celular de forma dependente da concentração e do tempo. Após a aplicação de concentrações crescentes de nifedipina, os registros de potencial de campo nas células revelam um encurtamento dependente da concentração da duração do campo normalizado.A avaliação da nifedipina quanto à contratilidade cardíaca também mostrou uma diminuição significativa da amplitude dependente da concentração na medida aguda com concentrações nanomolares e 13 nanomolares. É importante lembrar que as células são geralmente sensíveis a parâmetros ambientais, como mudanças de temperatura e pH, bem como simulação mecânica, que é especialmente suportada nas placas de contração.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Aqui, mostramos a geração de tecido do coração humano manipulado a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) derivada de cardiomiócitos. Apresenta-se um método para analisar a força de contração e alteração exemplar de padrão de contracção pelo hERG inibidor do canal de E-4031. Este método apresenta elevado nível de robustez e de aptidão para o rastreio de drogas cardíaca.

Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Espontaneamente, contratantes citoplasma dos cardiomyocytes derivado pluripotentes induzidas pelo homem as células estaminais são modelos úteis de fisiologia cardíaca humana e farmacologia. Aqui nós apresentamos um sistema de rastreio com throughput alto para quantificar os efeitos de compostos exógenos sobre batendo frequência, usando uma tintura fluorescente Ca-sensível e um leitor de placa multi bem imagem com temperatura controlada.

Contrações do citoplasma de casos humanos-iPSC-derivado medida com um corante fluorescente de Ca-sensíveis em placas de 384 poços de temperatura controlada

Aqui descrevemos e validamos um método para gerar consistentemente cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos robustos e caracterizar sua função. Essas técnicas podem ajudar no desenvolvimento de insights mecanicistas sobre as vias de sinalização, fornecer uma plataforma para o rastreamento de medicamentos em larga escala e doenças cardíacas de modelo confiável.

Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

Este protocolo descreve o procedimento de secção e cultivo de fatias cardíacas humanas para testes de drogas pré-clínicos e detalha o uso de mapeamento óptico para o registro de tensão transmembrana e sinais de cálcio intracelular simultaneamente a partir dessas fatias.

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Apresentamos um modelo de doença isquêmica do coração utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, juntamente com um método de avaliação quantitativa dos danos teciduais causados pela isquemia. Este modelo pode fornecer uma plataforma útil para triagem de medicamentos e mais pesquisas sobre doenças isquêmicas do coração.

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A formação de uma rede de sarcomere adequada é importante para o amadurecimento dos cardiomiócitos derivados do iPSC. Apresentamos uma abordagem baseada em super resolução que permite a avaliação quantitativa da maturação estrutural dos cardiomiócitos derivados de células-tronco, para melhorar as condições culturais que promovem o desenvolvimento cardíaco.

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Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

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Aqui, demonstramos um método de avaliação da contratilidade de dispositivos médicos cardíacos não invasivos usando monocamadas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D (hiPSC-CM), banhadas em um substrato flexível, juntamente com microscopia baseada em vídeo. Esta ferramenta será útil para a avaliação in vitro das propriedades contráteis de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.

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Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

Aprenda a avaliar segurança cardíaca pré-clínica usando cardiomiócitos derivados de iPSC humanos em sistema híbrido de 96 poços. Este método permite monitoramento simultâneo de parâmetros eletrofisiológicos, viabilidade e função contrátil em tempo real.

Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco (Vídeo) | JoVE Journal

Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco

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