Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas

Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.

Embora existam estudos sobre perda auditiva induzida por ruído, nenhum registrou o método de forma tão detalhada, tornando este um procedimento importante. Este método efetivamente causou perda auditiva induzida por ruído em camundongos, e observa as mudanças reais nos limiares auditivos pelo PEATE. Um modelo animal de perda auditiva induzida por ruído é útil para que os cientistas entendam completamente o mecanismo da perda auditiva induzida por ruído e, posteriormente, otimizem as estratégias de tratamento correspondentes.

Quem demonstrará o procedimento será Dian-Shiue Lee, uma aluna muito talentosa do meu laboratório. Para preparar a gaiola para os camundongos experimentais, use uma gaiola armadilha para ratos e corte quatro pedaços de placas de plástico ondulado em tamanhos apropriados, fazendo com que se encaixem na gaiola. Para evitar que os ratos sejam cortados pela grade de malha, coloque duas das peças na parte inferior e na parte de trás, respectivamente.

Coloque as outras duas peças perpendicularmente interligadas entre si, para dividir o espaço dentro da gaiola em quartos Abra o software aplicativo CLIO. Mova o cursor para o ícone do alto-falante e clique em TwoSin. Insira e altere o valor de Frequência 1 para 1.000 hertz, Frequência 2 para 6.000 hertz e clique em OK para começar a reproduzir o som.

Na guia Leq, altere dBV para dBSPL. Depois de definir a hora na interface do software, clique no botão triângulo verde para reproduzir o som. Coloque um microfone na frente do alto-falante a uma distância de 8,5 centímetros para calibrar o nível de ruído.

Ajuste o nível de ruído para 125 decibéis SPL-A e monitore continuamente por pelo menos três minutos para garantir que o nível de ruído esteja suficientemente estabilizado. Use um gerador, um analisador e um amplificador para criar e controlar o ruído. Coloque quatro camundongos C57 pretos 6J machos na gaiola, um para cada quarto, para exposição ao ruído.

Atribua aleatoriamente os ratos a cada quarto durante a exposição ao ruído. Coloque um microfone na parte superior da gaiola para monitorar o nível de ruído durante a exposição ao ruído. Coloque a gaiola na frente do alto-falante dentro de uma caixa à prova de som, garantindo que o alto-falante esteja posicionado a 8,5 centímetros de distância da gaiola.

Expor os ratos ao ruído nas frequências de um kilohertz e seis kilohertz continuamente durante seis horas por dia, durante cinco dias consecutivos. Medir os limiares auditivos dos camundongos no 6º e 13º dias por meio da medição do PEATE. Utilizar um sistema comercial de teste de PEATE, projetado especificamente para pequenos animais para medidas do PEATE, e manter o animal sob anestesia geral.

Coloque eletrodos de agulha subdérmica de 12 milímetros no vértice atrás do pavilhão auricular da orelha esquerda e de volta perto da cauda, para medir o limiar auditivo. Após posicionar a caixa acústica a um centímetro de distância da orelha esquerda do animal, apresente estímulos acústicos utilizando a caixa acústica. Escolha Onda senoidal para os estímulos e 10 k para a escala de janela.

Gire o botão de frequência para obter a frequência desejada dos estímulos acústicos. Ajuste a intensidade do estímulo girando o botão AMLP no gerador de funções. Obter a intensidade de estímulo desejada girando o botão AMLP para uma tensão adequada calculada a partir da calibração.

Coletar as medidas do PEATE sob uma série de intensidades de estímulo de 10 a 100 decibéis NPS, com um tamanho de passo de 10 decibéis. Marque o nível mínimo de intensidade do estímulo que poderia dar origem a uma onda V discernível como o limiar do PEATE. Sacrificar os camundongos após as medições do PEATE e colher as cócleas dos camundongos eutanasiados.

Imediatamente após a colheita dos tecidos, mergulhe-os em formol a 10% para fixação e deixe-os descansar por pelo menos oito horas a quatro graus Celsius. Use EDTA para descalcificação, conforme descrito no texto. Coloque as cócleas em uma placa de Petri cheia de PBS.

Para a coloração tecidual, corte o órgão espiral de Corti, ou OC, em três seções: giro basal, giro médio e giro apical. Sob um microscópio dissecante em um aumento de 8x a 35x, remova as estruturas ósseas que incluem a escala vestibular, a escala timpânica e o modíolo das cócleas descalcificadas e obtenha os tecidos moles, incluindo o CO. Um aumento significativo no limiar auditivo foi observado aos 12 kilohertz, 24 kilohertz e 32 kilohertz um dia após a exposição ao ruído. A recuperação parcial da audição ocorreu uma semana após a exposição ao ruído, mas os limiares auditivos ainda estavam elevados em mais de 30 decibéis em todas as frequências em relação aos grupos controle.

Neste estudo, a audição foi mais prejudicada nas frequências altas. Foi observada diferença significativa no limiar auditivo entre os grupos controle e experimental, tanto no 6º quanto no 13º dias, nos níveis de 12 kilohertz e 32 kilohertz. Uma perda de células ciliadas externas foi consistentemente observada nas imagens microscópicas adquiridas dos camundongos NIHL, em comparação com aquelas dos camundongos controle.

Enquanto as células ciliadas internas permaneceram intactas em todas as imagens, as células ciliadas externas nos giros basal e médio do CO foram severamente danificadas. Em contraste, as células ciliadas externas na espira apical estavam quase intactas. A etapa mais importante deste protocolo inclui exposição ao ruído, medida do ITB, retirada da cóclea.

Este procedimento pode ser aplicado para investigar o efeito da exposição ao ruído em diferentes frequências sobre a perda auditiva utilizando vários tipos de som.