Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

Nanopartículas de peptídeo-poloxamina é um dos potenciais sistemas de entrega de mRNA pulmonar. Nosso protocolo faz com que as nanopartículas peptídeo-poloxamina com maior produtividade e eficiência, o que facilita o desenvolvimento da vacina mRNA mucosa. Os materiais exigidos pela técnica são de baixo custo, e o protocolo pode ser concluído em pouco tempo.

As nanopartículas peptídeo-poloxamina têm a capacidade de mediar transfecção eficiente de mRNA. As nanopartículas de peptídeo-poloxamina apresentaram transfecção bem sucedida de mRNA em células epiteliais brônquias humanas, o que implica aplicações adicionais para vacinas COVID-19 mucosas, tratamento de cânceres de pulmão e terapia genética da fibrose cística. Espero que o indivíduo tenha algum conhecimento básico em um campo relacionado e com o protocolo e muitas das técnicas também, antes que ele ou ela comece a realizar os experimentos.

Depois de sintetizar o quadro de leitura aberta da Luciferase Metridia e cloná-lo no vetor pUC57, prepare um modelo de DNA linearizado usando BamHI e KpnI a 37 graus Celsius por uma hora. Prepare uma reação de volume de 20 microliters para síntese de mRNA usando um kit de transcrição T7 e pseudouridina como descrito no manuscrito. Misture bem os componentes e incubar a 37 graus Celsius por três horas.

Em seguida, remova a estrutura secundária de 50 microgramas de mRNA IVT não tampado aquecendo-a a 65 graus Celsius por 10 minutos. Use o sistema de tampa do Cap 1 para o capping de mRNA IVT e prepare o Cap 1 modificando a estrutura da tampa de 7 metilguanosina usando S-adenosylmethionine e 2'O-metiltransferases a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Meça a concentração de ivt mRNA tampado com um espectrofotômetro visível UV.

Usando um marcador de RNA, analise o tamanho molecular do mRNA IVT tampado em um gel de agarose de 1%formaldeído contendo 18% de formaldeído. Prepare 10 miligramas por solução de estoque mililitro de poloxamina 704 solubilizando o T704 em água sem nuclease. Prepare 2 miligramas por solução de estoque mililitro do peptídeo solubilizando o peptídeo em água sem nuclease.

Armazene a solução preparada a 4 graus Celsius. Descongele o IVT mRNA no gelo. Antes de abrir o tubo, centrifugar o tubo a 300 vezes G durante três segundos em temperatura ambiente e diluir a solução ivt mRNA com água sem nuclease.

Prepare a solução de mistura de peptídeos T704 e sintético, diluindo a solução T704 para oito microgramas por concentração de microliter, e solução de peptídeo sintético para 0,555 microgramas por concentração de microliter, com água livre de nuclease, respectivamente. Incubar a solução mista por 15 minutos em temperatura ambiente antes de usar mais. Desenhe a solução ivt mRNA em uma seringa de um mililitro, evitando aberturas de ar ou bolhas na ponta da seringa.

Carregue a seringa em um lado do cartucho ao lado do bloco rotativo. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com solução de mistura de peptídeos t704 e remova quaisquer bolhas ou lacunas de ar na ponta da seringa. Coloque a seringa na outra entrada da bomba e coloque a bomba com uma vazão total de 4 a 10 mililitros por minuto.

Coloque um tubo cínico sem RNase de dez mililitros para coletar a solução misturada IVT mRNA/PP-sNp no final do caminho de fluxo do dispositivo de mistura. Execute a bomba para iniciar a mistura, garantindo que os parâmetros estejam inseridos corretamente. Depois de executar a bomba por seis segundos, colete a amostra IVT mRNA/PP-sNp do tubo cônico.

Placa células epiteliais brônquicas humanas e uma linha de células dendríticas em placas de 96 poços 24 horas antes da transfecção. Cultivar as células em um meio de cultura suplementado com soro bovino fetal inativado 10% e estreptomicina de penicilina de 1%. Depois de remover o meio de crescimento, lave as células banhadas com 0,2 mililitros por pbs bem.

Adicione 170 microliters de meio de cultura livre de soro a cada poço contendo as culturas celulares banhadas. Em seguida, adicione 30 microliters de formulação IVT mRNA/PP-sNp contendo 0,4 microgramas de Metridia luciferase mRNA drop wise em cada poço. Incubar as células com a formulação IVT mRNA/PP-sNp em uma atmosfera umidificada enriquecida com dióxido de carbono a 37 graus Celsius por quatro horas.

Aspire o meio de transfecção e adicione 0,2 mililitros de cultura fresca complementada com soro bovino fetal inativado 10% e estreptomicina de penicilina de 1%. Incubar as células transfeinadas por 24 horas como demonstrado anteriormente e coletar os supernantes a serem detectados de cada poço. Prepare uma nova solução de ensaio adicionando PBS ao substrato de coelenterazina.

Misture bem a solução com vórtice por 10 segundos. Adicione 50 microliters do supernatante coletado a uma placa de 96 poços. Configure o leitor de microplacões com um tempo de leitura de 1.000 milissegundos e adicione 30 microliters de solução de coelenterazina a cada poço manualmente ou por injeção automatizada.

Imediatamente após adicionar a solução de coelenterazina ao supernatante, clique em Iniciar para medir o sinal de luminescência. O plasmídeo recombinante foi isolado e digerido para produzir o modelo de DNA linearizado. A transcrição in vitro produziu mRNA MetLuc upcaped e tampado.

As células transfeccionadas com Metridia luciferase mRNA/PP-sNp apresentaram expressão significativamente maior de luciferase em comparação com aquelas transfecidas com reagente de transfecção à base de lipídios comercialmente disponível, lútridas luciferase mRNA, PBS ou peptídeos sintéticos T7044, solução mista em células epiteliais brônquias humanas, 16 HBE e linha celular dendrítica DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp mostrou expressão de luciferase maior do que LP.sugerindo que o sistema de entrega PP-sNp é importante para proteger o MetLuc mRNA contra a degradação e para promover a eficiência de transfecção da exógena Metridia luciferase mRNA. Certifique-se de que a estrutura sintética do Met-mRNA não tampado seja removida com sucesso. Calcule e baixe o composto Met-mRNA T704 e peptídeo cuidadosamente para preparar e compactar as nanopartículas de poloxamina.

A microscopia eletrônica de transmissão pode ser realizada para observar a morfologia das nanopartículas peptídeo-poloxamina. Essa técnica ajuda os pesquisadores a desenvolver vacinas mucosas de mRNA e a permitir a triagem de alto rendimento de formulações de terapia genética para todas as células relacionadas.