Construindo peptídeos cíclicos usando um centro de sulfônio on-tether

Neste protocolo, foi construído o sal de sulfônio que poderia atuar como uma nova mão que reagiu com a proteína cisteína na proximidade especial. A vantagem desta técnica foi que esta reação foi rápida e eficiente, e Met-catalisador livre e desenvolveu um método simples e eficiente para estabilizar peptídeos. Para começar, preparar a solução de desproteção N-terminal 9-fluorinil-metiloxicarbonilo de 20% de piperidina ou 50% de morfolina e DMF em um copo ou frasco de 500 mililitros.

Em seguida, adicione 10 mililitros da solução de desproteção à coluna e borbulhou nitrogênio na solução por 30 minutos ou duas vezes por cinco minutos. Escorra a solução por uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente por cinco vezes com diclorometano e N, N-dimetilformamida. Para detectar a resina como uma solução de cor amarela escura, adicione um mililitro de N, N-dimetilformamida a uma pequena quantidade de resina e adicione 200 microlitros de ninidrina a 5% a um tubo de vidro.

Aqueça-o a 130 graus Celsius por três minutos para avaliar as mudanças na cor da resina. Para o acoplamento de peptídeos, preparar uma solução de mistura conforme descrito no manuscrito em um tubo de polipropileno e dissolvê-la em três mililitros de N, N-dimetilformamida. Em seguida, adicione 173 microlitros de N, N-diisopropiletilamina ou 154 microlitros de N, N'diisopropilcarbodiimida à solução para inativar o aminoácido.

Em seguida, adicione a mistura à coluna com resina e borbulhe-a com nitrogênio por duas horas. Após o acoplamento, adicione um mililitro de N, N-dimetilformamida a uma pequena quantidade de resina e adicione 200 microlitros de ninidrina a 5% a um tubo de vidro. Aqueça-o a 130 graus Celsius por três minutos, enquanto a resina mudou para incolor, o que confirma a ausência de um grupo amino livre antes da etapa de desproteção.

Depois de drenar a solução, lavar a resina como demonstrado anteriormente e adicionar 10 mililitros da solução de desproteção à coluna. Em seguida, borbulhe com nitrogênio por 30 minutos ou duas vezes por cinco minutos. E novamente, adicione uma solução nova.

Adicionar 10 mililitros de metanol anidro à coluna com resina para desidratação e secar com azoto para a próxima utilização. Pesar 100 miligramas da resina numa coluna e lavar a resina com diclorometano e N, N-dimetilformamida antes da etapa de engate. Preparar uma solução para a remoção do grupo de protecção tritil-L-cisteína adicionando ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e mistura de diclorometano num copo ou balão de 100 mililitros para remover o grupo protector.

Adicionar cinco a 10 mililitros da solução preparada à coluna para remover o grupo de protecção durante 10 minutos. Repita seis vezes com nitrogênio borbulhando até que a cor amarela desapareça completamente. Depois de drenar a solução por uma bomba de vácuo, lave a resina como demonstrado anteriormente.

Em seguida, preparar uma solução para reagir com cisteína desprotegida adicionando ligador dihalogenado e N, N-diisopropiletilamina num copo ou balão de 50 mililitros com N, N-dimetilformamida. Adicionar cinco a 10 mililitros da solução de reacção à coluna para reagir com cisteína protegida durante, pelo menos, três horas com o azoto a borbulhar. Novamente, drene a solução por uma bomba de vácuo e lave a resina sequencialmente, como demonstrado anteriormente.

Para preparar a solução de ciclização peptídica, adicione a mistura de ácido trifluoroacético em um copo ou frasco de 20 mililitros no exaustor para ciclização peptídica. Em seguida, adicione cinco a 10 mililitros da solução de mistura ao tubo de polipropileno e colha a resina sob o coquetel de ácido trifluoroacético por três horas. Depois de desidratar e lavar a resina antes que a etapa de acoplamento seja demonstrada anteriormente, prepare uma solução aquosa de ácido fórmico a 1% e um brometo de propargila milimolar e adicione à solução de peptídeo de metionina.

Em seguida, agite a reação de acoplamento de metionina e brometo de propargila à temperatura ambiente por 12 horas. Após a reação, dissolver o produto em um tubo de polipropileno e acetonitrila e filtrá-lo através de uma membrana filtrante de 0,22 micrômetros. Em seguida, purifice a solução por HPLC de fase reversa imediatamente e congele-a em pó para a próxima utilização.

Os peptídeos cíclicos sintetizados utilizando bis-alquilação entre cisteína e metionina foram caracterizados pelo espectro HPLC e LCMS, o que mostra que os epímeros apresentaram tempos de retenção distintos e pesos moleculares idênticos. Os traços de HPLC dos epímeros e seu produto conjugado demonstraram a conversão dependente do tempo entre o peptídeo cíclico e seu produto. O peso molecular dos peptídeos cíclicos sintetizados usando uma reação do tipo tiol-yne foi determinado por LCMS e o peptídeo foi isolado e purificado por HPLC.

Os peptídeos foram ainda caracterizados por RMN de prótons e espectros quânticos quânticos únicos heteronucleares, revelando a mudança química. Espectros de RMN de prótons da conversão dependente do tempo entre peptídeo cíclico e ditiotreitol e óxido de deutério foram obtidos para explorar a estabilidade do peptídeo devido à abertura do anel de sulfônio. Os resultados mostraram que nenhum produto de adição ou abertura de anel foi formado após 24 horas.

Este procedimento estabeleceu uma estratégia eficaz para sintetizar peptídeos cíclicos. A reação diz que a seletividade também aumentou ao formar uma confirmação que estabiliza o peptídeo de ciclização, indicando que os peptídeos cíclicos eram catalisadores promissores de drogas.