Name: In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a avaliar respostas imunes celulares induzidas pelo adjuvante nanoemulsão ofiopogonina D usando células L929. Este protocolo demonstra ausência de toxicidade e alta entrega celular para pesquisa em vacinas.

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Este estudo foi apoiado pela subvenção nº 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China, bolsas nº 31670938, 32070924, 82041045 e 32000651 do Programa Nacional da Fundação de Ciências Naturais da China, bolsas nº 2014jcyjA0107 e nº 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, concessão nº CYS21519 do Projeto de Pesquisa e Inovação de Pós-Graduação de Chongqing, concessão nº 2020XBK24 dos projetos especiais da Universidade Médica do Exército e concessão nº 202090031021 do Programa Nacional de Inovação e Empreendedorismo para estudantes universitários.

Todos os experimentos celulares foram realizados em um laboratório de engenharia celular equipado com salas de cirurgia básicas, salas de tampão, salas de cultura estéreis e salas de identificação e análise. O ambiente e as condições de trabalho estavam livres de contaminação microbiana e outros fatores prejudiciais. Os experimentos com animais foram conduzidos com base nas Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina.
1. Autoclave e preparação de materiais
<ol><li>Preparar os reagentes e consumíveis, tais como solução salina tamponada com fosfato (PBS), tesoura, pinça e malha abrasiva, por esterilização térmica húmida por autoclave a 121 °C durante 20 min.</li>
	<li>Para os reagentes e equipamentos necessários, consulte a Tabela de Materiais. Para a fórmula da nanoemulsão em branco (BNE), verifique a Tabela 1.</li>
</ol>2. Ensaio de citotoxicidade L929
<ol><li>Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C. Recolher um tubo de células L929 congeladas a partir de azoto líquido e descongelar rapidamente num banho de água a 37 °C.</li>
	<li>Pipetar as células para um tubo centrífugo estéril de 15 mL rapidamente após o descongelamento, adicionar 2 mL de DMEM e misturar bem.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 129 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Em seguida, adicione 2mL de DMEM para ressuspender as células e centrifugar as amostras novamente a 129 x g por 5 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, adicione 6 mL de meio DMEM completo (contendo 10% de FBS) para ressuspensão, e transfira para um frasco de cultura T25 em incubadora de 37 °C com 5% de CO2 para cultura por 48 h.</li>
	<li>Rejeitar o meio de cultura no balão de cultura e lavar as células duas vezes com 2 ml de PBS. Em seguida, adicione 1 mL de tripsina a 0,25% para digerir as células por 1-2 min a 37 °C.</li>
	<li>Quando o arredondamento das células for observado, adicione 4 mL de meio DMEM completo para terminar a digestão imediatamente e misture bem. Em seguida, aspirar as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL e centrífuga a 129 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de meio DMEM completo. Use uma suspensão celular de 20 μL para contagem de células usando placas de contagem de células e dilua as células restantes para 1 x 105 células/mL com meio DMEM completo.</li>
	<li>Adicionar 100 μL de água ultrapura à periferia de uma placa de 96 poços e adicionar 100 μL de diluente celular apenas aos poços internos. Colocar a placa na incubadora para cultura aderente durante 4 h a 37 °C.</li>
	<li>Após a adesão das células, adicione OP-D e NOD separadamente em meio completo DMEM a um volume final de 200 μL/poço (as concentrações finais de cada fármaco são 480 μg/mL, 240 μg/mL, 120 μg/mL, 60 μg/mL e 30 μg/mL). Para cada concentração, use três poços como replicantes. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora e faça cultura por mais 24 horas.</li>
	<li>Diluir CCK-8 a 10% com meio DMEM completo e adicionar diluições de 100 μL/poço contendo as soluções adjuvante e celular à placa de 96 poços. Coloque a placa de volta na incubadora e incube por mais 2-3 h.</li>
	<li>Misture frequentemente enquanto chapeia a solução celular para evitar a não homogeneidade devido à precipitação celular. Agite suavemente a placa várias vezes antes e depois de adicionar o CCK-8 para misturar bem o meio e a solução de CCK-8.</li>
	<li>Meça a absorbância a 450 nm usando um leitor de microplacas. Configure um poço de zeragem com apenas médio e CCK-8 para um valor de absorbância de linha de base. Calcule valores precisos de absorbância subtraindo o valor de absorvância zerado do valor de absorvência obtido ao plotar.</li>
	<li>Confirme se não há bolhas presentes em nenhum poço antes de testar com o leitor de microplacas, pois as bolhas interferirão no ensaio.</li>
</ol>3. Estimulação dos eplenócitos
<ol><li>Imunizar camundongos BALB/c com idade entre 6-8 semanas com 30 μg de antígeno proteico mais 30 μg de adjuvante através de uma injeção intramuscular (200 μL) no dia 0, dia 7 e dia 14 de acordo com os seguintes grupos experimentais: (1) grupo PBS, (2) grupo antígeno (Ag), (3) antígeno + grupo OP-D (Ag/OP-D), (4) antígeno + BNE (Ag/BNE), (5) grupo antígeno + NOD (Ag/NOD) e (6) antígeno + AlPO4 (Ag/Al).</li>
	<li>Sala de preparação: No dia 24 após a imunização primária, retire os ratos da sala de animais e eutanasie-os por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%. Coloque os ratos em um prato de vidro e mergulhe em álcool a 75% por 5 min.</li>
	<li>Coloque os tubos de centrífuga em um rack de tubos de centrífuga, numere as placas de Petri descartáveis e adicione 5 mL de PBS a cada placa de Petri com uma pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Faça uma incisão de 6-8 cm com uma tesoura no meio do lado ventral esquerdo do rato, rasgue a pele, exponha a parede abdominal e localize a longa faixa vermelha do baço.</li>
	<li>Levante o peritônio no lado inferior do baço com pinças, corte-o aberto e vire-o para cima para expor o baço. Levante o baço com pinças, separe o tecido conjuntivo sob o baço com uma tesoura oftálmica e remova o baço.</li>
	<li>Coloque o baço em uma placa de Petri contendo 5 mL de PBS e moça com peneira (200 malhas, 70 μm) e barra de moagem. Após a moagem, transfira o líquido para um tubo de centrífuga de 15 mL com um conta-gotas de cotovelo de acordo com a numeração.</li>
	<li>Centrifugar o líquido a 453 x g durante 5 minutos. Descarte o sobrenadante, adicione 3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos a cada tubo, ressuspenda as células e lise à temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>Adicione 10-12 mL de PBS a cada tubo, misture o tubo de cabeça para baixo e centrifugar a 453 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante, adicione 10 mL de PBS a cada tubo de centrífuga e ressuspenda as células.</li>
	<li>Pegue 20 μL de cada amostra em um poço da placa de contagem de células e registre o número de células vivas usando um contador de células automatizado.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 453 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. Ressuspender as células, diluir para 2,5 x 106 células/mL com meio RF-10 (informações de formulação na Tabela 2) e adicionar a uma placa de 96 poços a 100 μL/poço.</li>
	<li>Diluir o antígeno com meio RF-10 a 10 μg/mL, adicionar 100 μL a cada poço e incubar por 3 dias a 37 °C em 5% de CO2.</li>
	<li>Aspirar a suspensão celular obtida de cada grupo de células em tubos de centrífuga de 1,5 mL, centrífuga a 453 x g por 20 min e aspirar o sobrenadante em um tubo de centrífuga limpo.</li>
	<li>Realize a detecção de conteúdo IFN-γ e IL-17A estritamente de acordo com as instruções do kit ELISA. Os métodos e procedimentos são os seguintes.</li>
	<li>Preparar 1x solução de trabalho tampão de lavagem (fornecida com o kit), solução de concentração de gradiente padrão (solução padrão de citocinas diluídas a 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62,5 pg/mL, 31,3 pg/mL e 15,6 pg/mL no tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit), solução de trabalho de anticorpos biotinilados (solução de anticorpo biotinilado diluído a 1:100 usando o tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit para formar a solução de trabalho), e solução de trabalho treptavidina-HRP, conforme necessário.</li>
	<li>Adicionar 100 μL/poço de solução padrão de citocina diluída no poço padrão, 100 μL/poço de amostra no poço de amostra (o tampão de diluição R [1x] fornecido com o kit é usado para a diluição da amostra) e 100 μL/poço de tampão de diluição R (1x) no poço de controle em branco.</li>
	<li>Adicionar solução de trabalho de anticorpos biotinilados a 50 μL/bem. Misture bem, cubra com uma membrana de vedação e incube a 37 °C por 90 min.</li>
	<li>Retire o líquido dos poços e adicione 1x solução de trabalho tampão de lavagem a 300 μL/poço. Descarte o líquido dos poços após 1 min. Repita este processo 4x permitindo que o líquido seque em papel de filtro de cada vez.</li>
	<li>Adicionar 100 μL/poço de solução de trabalho treptavidina-HRP. Cobrir e incubar as amostras a 37 °C durante 30 minutos. Centrifugar as amostras a 453 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante. NOTA: A solução de lavagem que permanece no poço de reação durante o processo de lavagem deve ser cuidadosamente acariciada até que nenhuma marca d'água possa ser vista no papel de filtro.</li>
	<li>Adicionar TMB a 100 μL/poço, incubar as placas a 37 °C por 5-30 min no escuro e julgar a reação de terminação de acordo com a profundidade de cor no poço (azul escuro). Normalmente, 10-20 min para o desenvolvimento de cores pode alcançar bons resultados.</li>
	<li>Terminar a reação rapidamente adicionando a solução de parada a 100 μL/poço. Detectar o valor de absorbância a 450 nm no prazo de 10 minutos após a terminação. NOTA: Equilibre o reagente à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da utilização.</li>
</ol>4. Ensaio ELISpot
<ol><li>Realizar a imunização dos camundongos e a coleta de esplenócitos exatamente como descrito nas etapas 3.1-3.10 acima. Execute os ensaios para IFN-γ e IL-17A em estrita conformidade com as instruções do kit. Os métodos e procedimentos são os seguintes.</li>
	<li>Retire a placa da embalagem selada, lave 4x com PBS estéril (200 μL/poço) e adicione 1640 meios de cultura completos (200 μL/poço) para equilibrá-la à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Retirar o meio e diluir a suspensão de esplêncitos com meio RF-10 a 2 x 105 células/mL, adicionando 50 μL de células e antígeno por poço (concentração final: 10 μg/mL).</li>
	<li>Colocar a placa numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2 durante 48 h. Não mova a placa durante esse período e tome medidas para evitar a evaporação (por exemplo, envolva a placa com papel alumínio).</li>
	<li>Diluir o anticorpo de detecção (BVD6-24G2-biotina) para 1 μg/mL (1:1.000) em solução salina tamponada com fosfato (0,5 mL:100 mL) contendo 0,5% de soro fetal bovino (PBS-0,5% FBS). Adicionar 100 μL/poço à placa e incubá-la à temperatura ambiente durante 2 h após filtração através de uma membrana de 0,22 μm.</li>
	<li>Decantar o líquido nos poços, adicionar 1x tampão de lavagem a 200 μL/poço e lavar 5x. Deixe por 30-60 s de cada vez e, pela última vez, deixe secar no papel borrado.</li>
	<li>Diluir a peroxidase de treptavidina-rábano (1:1.000) em PBS-0,5% FBS e adicionar 100 μL/poço. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar a placa como indicado no passo 4.6.</li>
	<li>Adicionar 100 μL/poço de solução de substrato TMB pronta a utilizar e desenvolver até que apareça um ponto límpido. Pare o desenvolvimento da cor lavando extensivamente em água deionizada (enxaguar 5x-6x repetidamente). Se necessário, remova o bueiro (o plástico macio sob a placa) e enxágue o lado inferior da membrana.</li>
	<li>Examine e conte as manchas em um leitor ELISpot ou microscópio de dissecação após a placa ter secado.</li>
</ol>5. Absorção por CDs
<ol><li>Eutanasiar camundongos normais BALB/c por uma injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico a 1%. Mergulhe os ratos em álcool a 75% por 5 min.</li>
	<li>Corte uma incisão de 6-8 cm abaixo do abdômen do rato com uma tesoura e prenda as duas extremidades da abertura para separá-la em direções diferentes e expor as pernas do rato. Separe o fêmur do rato do corpo do rato e a tíbia da articulação e mantenha os ossos intactos em ambas as extremidades.</li>
	<li>Remova o tecido residual e a cartilagem das articulações articulares em ambas as extremidades do fêmur com tesoura e pinça. Mergulhe os fêmures em álcool a 75% por 5 minutos e, em seguida, mergulhe em solução estéril de PBS para lavar o álcool da superfície.</li>
	<li>Corte as extremidades dos fêmures com uma tesoura e lave a medula óssea em uma placa de Petri estéril com solução estéril de PBS seguida de aspiração com seringa de 1 mL. Repita a lavagem 3x-5x.</li>
	<li>Filtrar por uma peneira celular (200 malhas, 70 μm) e recolher os BMDCs num tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar as amostras a 290 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante, adicione 4 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos, ressuspeite e lise à temperatura ambiente por 5 min.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de solução estéril de PBS para neutralizar o lisado, centrifugar a 290 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de DMEM contendo solução de penicilina-estreptomicina a 1% e FBS a 10% e contagem. Em seguida, adicione GM-CSF (20 ng/mL) mais IL-4 (10 ng/mL) ao meio, ajuste a concentração celular para 5 x 105/mL e inocular as células em coberturas.</li>
	<li>Adicionar a suspensão celular a uma placa de 6 poços a 2 mL/poço e colocar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h. Mude o meio completamente após 2 dias e mude metade do meio após 4 dias.</li>
	<li>Selecionar cinco poços com células em bom estado (células grandes e radiolúcidas com saliências dendríticas na superfície celular) utilizando um microscópio invertido com ampliação de 100x para o experimento no sétimo dia de cultura. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de soluções de GFP, OP-D + GFP e NOD + GFP diluídas com meio DMEM completo (concentração final de GFP: 20 μg/mL; concentração final adjuvante: 10 μg/mL) a cada poço e incube as placas a 37 °C por 30 min no escuro.</li>
	<li>Lave as placas 3x com PBS, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% a cada poço e incube à temperatura ambiente por 15 min. Remova o paraformaldeído após a fixação, incube as células com faloidina e DAPI até uma concentração final de 10 μg/mL por 10 min para coloração e, em seguida, lave 3x com PBS.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS a cada poço e observe a absorção de antígenos usando CLSM, conforme descrito abaixo.<ol><li>Abra o software CLSM, clique em Sistema ZEN e aguarde a conclusão da inicialização do hardware.</li>
		<li>Clique nos atalhos GFP e DAPI na guia localizar para encontrar a área que pode ser observada. Desligue a luz fluorescente e a luz transmitida.</li>
		<li>Clique em Configuração inteligente no menu de aquisição para abrir a biblioteca de corantes e adicione três corantes fluorescentes: EGFP, faloidina e DAPI. Clique em Melhor Sinal > OK. Clique no canal EGFP na guia canais e clique em Ao vivo para selecionar o campo de visão correto na interface direita.</li>
		<li>Selecione 1 UA para o orifício, gire o parafuso de foco fino para ajustar a distância focal e selecione o plano focal apropriado. Clique em Range Indicator e ajuste a combinação de potência do laser e ganho mestre para que apenas pontos vermelhos esporádicos apareçam na imagem.</li>
		<li>Ajuste os canais de faloidina e DAPI com os mesmos parâmetros sem alterar a potência do laser.</li>
		<li>Selecione Stop Live e clique em Modo de aquisição para alterar os parâmetros de disparo: Tamanho do quadro: 1024 pixels x 1024 pixels; Velocidade de digitalização: 7; Média: 2x. Clique em Encaixar e selecione Dividir para ver todas as imagens tiradas. Salve as imagens.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Ativação de macrófagos
<ol><li>Mergulhe os ratos C57BL/6 em álcool a 75% após a eutanásia e coloque-os virados para cima em uma placa de Petri de vidro em ordem numerada.</li>
	<li>Passe os ratos através da janela de transferência para a sala de operação estéril e coloque na mesa de operação por 5 minutos.</li>
	<li>Usando uma seringa, aspirar 10 mL de solução salina, inclinar os ratos para baixo a aproximadamente 45° e injetar no meio da cavidade abdominal. Retirar cerca de 5 ml de suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 ml por cada 10 ml e repetir a injeção 3x.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 129 x g durante 5 minutos para obter macrófagos primários peritoneais de rato. Ressuspeite as células, ajuste a concentração celular para 2 x 106 células/mL com meio completo RPMI 1640 (contendo 10% de FBS) e inocular a suspensão celular em uma placa de 24 poços para garantir um número consistente de células por poço (1 mL/poço).</li>
	<li>Cultura a 37 °C em CO 2 a 5% durante a noite (aproximadamente 16-20 h), seguida de incubação com PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD e Ag/Al (concentração final de Ag: 5 μg/mL; concentração final adjuvante: 10 μg/mL; volume total:2 mL) por 24 h. Detectar os níveis de IL-1β, IL-6 e TNF-α no sobrenadante de cultura com kits ELISA usando os métodos e procedimentos descritos nas etapas 3.12-3.19.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não há interesses financeiros ou pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

As vacinas de subunidade fornecem excelente segurança, mas baixa imunogenicidade. A principal estratégia para aumentar a imunogenicidade é adsorver fisicamente ou acoplar antígenos com adjuvantes e incorporá-los aos sistemas de liberação de fármacos para promover a captação e apresentação por CDs. As saponinas vegetais naturais, como a saponina quillaia e seus derivados, são altamente tóxicas e não são adequadas para o desenvolvimento de vacinas humanas17. Portanto, o estudo dos efeitos tóxicos da...

As vacinas são um meio importante de prevenir e tratar doenças infecciosas e não transmissíveis. A adição adequada de adjuvantes e veículos de entrega às formulações de vacinas é benéfica para aumentar a imunogenicidade dos antígenos e gerar respostas imunes duradouras1. Além do alúmen adjuvante clássico (sal de alumínio), existem seis tipos de adjuvantes para vacinas que são atualmente comercializados: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 e Matrix-M5. Geralmente, quando o corpo humano encontra um ataque viral, a primeira e a segunda linhas de defesa (pele, mucosa e macrófagos) assumem a liderança na limpeza do vírus e, finalmente, a terceira linha de defesa, envolvendo os órgãos imunológicos e as células imunes, é ativada. O alumínio e os sais de alumínio têm sido os adjuvantes mais utilizados para vacinas humanas desde o início da década de 1920, provocando uma resposta imune inata eficaz6. No entanto, tem sido proposto que a ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs) por adjuvantes clássicos, que estimula as células imunes a gerar conjuntos específicos de citocinas e quimiocinas, é o mecanismo pelo qual os adjuvantes funcionam e pode ser uma das razões pelas quais os adjuvantes exercem apenas efeitos transitórios sobre respostas imunes específicas7. A presença de adjuvantes licenciados limitados para uso humano é um fator restritivo para o desenvolvimento de vacinas que provocam respostas imunes eficazes8.
Atualmente, um número crescente de estudos adjuvantes está demonstrando a capacidade de induzir uma forte resposta imune celular em camundongos. Demonstrou-se que o QS-21 induz uma resposta imune equilibrada do T-helper 1 (Th1) e do T-helper 2 (Th2), produz níveis mais altos de títulos de anticorpos e prolonga a proteção como adjuvante, mas sua forte toxicidade e propriedades hemolíticas limitam seu desenvolvimento como adjuvante clínico autônomo 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranosídeo) é uma das saponinas esteroides isoladas da raiz da planta medicinal chinesa Ophiopogon japonicas4. Além disso, é o principal componente farmacologicamente ativo (Shen Mai San) encontrado em Radix Ophiopogonis e é conhecido por ter certas propriedades farmacológicas11. Além disso, é um membro da família Liliaceae e é amplamente utilizado por seus efeitos inibitórios e protetores na inflamação celular e lesão miocárdica. Por exemplo, o OP-D melhora as lesões semelhantes à dermatite atópica induzidas por DNCB e as células inflamatórias HaCaT do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) em camundongos BALB/c12. É importante ressaltar que o OP-D promove a proteção antioxidante do sistema cardiovascular e protege o coração contra a lesão autofágica induzida pela doxorrubicina, reduzindo a geração de espécies reativas de oxigênio e interrompendo os danos na membrana mitocondrial. Experimentos mostraram que tomar OP-D com monodesmosídeo ajuda a aumentar a saúde imunológica, aumentar a contagem de glóbulos brancos e a síntese de DNA e fazer com que os anticorpos durem maistempo 13. Verificou-se anteriormente que o OP-D tem um efeito adjuvante14.
As nanoemulsões são nanoformulações de óleo em água compostas por uma combinação de surfactantes, óleo, cosurfactantes e água12,15. Esses desenhos de nanovacinas permitem que antígenos e adjuvantes sejam encapsulados juntos para melhorar a estimulação imunológica, proteger os antígenos e promover a maturação das células dendríticas (DC)16. Para o desenvolvimento desses novos adjuvantes obtidos a partir da triagem, é importante encontrar métodos apropriados para avaliar suas habilidades de resposta celular.
O objetivo deste protocolo é avaliar sistematicamente se os adjuvantes podem aumentar a fagocitose e a expressão de células imunes em cultura de células in vitro e elaborar os principais métodos experimentais. O experimento é dividido em quatro subseções: (1) a toxicidade das células OP-D e NOD para L929 é determinada pelo ensaio kit-8 de contagem de células (CCK-8); (2) os níveis de citocinas de IFN-γ endócrino e IL-17A e os números celulares correspondentes em camundongos imunizados são detectados por estimulação de esplenócitos e ensaios de ELISpot; (3) a capacidade de apresentação do antígeno das CDs após estimulação adjuvante é observada por microscopia confocal; e (4) são detectados os três tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 e TNF-α, nos sobrenadantes obtidos de macrófagos peritoneais (PMs) em camundongos normais cocultivados com adjuvantes.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA (1x)</td> <td>GIBCO, EUA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>placas filtrantes de 96 poços</td><td>Millipore. Billerica, MA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AlPO4</td><td>General Chemical Company, EUA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Automated Cell Counter</td><td>Countstar, China</td><td>IC1000</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos BALB/c e camundongos C57BL/6</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td> triglicerídeo caprílico/cáprico nulo <td></td></tr><tr><td>(GTCC)</td><td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pequim, China</td><td>nulo</td><td></td></tr><tr><td>Kits CCK-8</td><td>Dojindo, Japão</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Contagem de Células</td><td>Costar, Corning, EUA</td><td>CO010101</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sieve</td><td>biosharp, China</td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf, Alemanha&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic(1x) medium</td><td>GIBCO, USA</td><td>C11885500BT</td><td></td></tr><tr><td>DSZ5000X Microscópio invertido</td><td>Nikon, Japão</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>EL-35 (Cremophor-35)</td><td>Mumbai, Índia</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>ELISpot classic</td><td>AID, Alemanha</td><td>ELR06</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal</td><td>Bovino GIBCO, EUA</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de Microplacas de Função Completa</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>VL0000D2</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>P42212</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos Macrófagos</td><td>GM-CSF, R& D Systems, EUA</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>HF 90/240 Incubator</td><td>Heal Force, Suíça</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech, EUA</td><td>042149</td><td></td></tr><tr><td>linha celular L929</td><td>FENGHUISHENGWU, China</td><td>&nbsp; NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Confocal de Varredura a Laser</td><td>Zeiss, Alemanha</td><td>LSM 980</td><td></td></tr><tr><td>MONTANE 85 PPI</td><td>SEPPIC, França</td><td>L12910</td><td></td></tr><tr><td>MONTANOX 80 PPI</td><td>SEPPIC, França</td><td>36372K</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gama; Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1210002</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gamma; kit ELISPOT pré-revestido</td><td>Dakewe, China</td><td>DKW22-2000-096</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA Mouse IL-17A</td><td>Dakewe, China</td><td>1211702</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit</td><td>ebiosciences, EUA</td><td>3521-4HPW-2</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1&beta; Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1210122</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1210602</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF-&alpha; Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1217202</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (100x)</td> <td>Invitrogen, EUA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Ophiopogonin-D</td><td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td><td>945619-74-9</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Solarbio, China</td><td>CA1620</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Solução salina tamponada</td><td>ZSGB-BIO, China</td><td>ZLI-9062</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Solarbio, China</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone médio (Life Technology), EUA</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td> <td>Invitrogen, EUA</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Squalene</td><td>Sigma, EUA</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoetanol</td><td>Invitrogen, EUA</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro avaliação da atividade celular da vacina de nanoemulsão adjuvante ofiopogonina d

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Como ingrediente principal das vacinas, os adjuvantes podem induzir ou melhorar diretamente as respostas imunes poderosas, generalizadas, inatas e adaptativas associadas aos antígenos. Ophiopogonin D (OP-D), um componente purificado extraído da planta Ophiopogon japonicus, foi encontrado para ser útil como um adjuvante da vacina. Os problemas de baixa solubilidade e toxicidade do OP-D podem ser efetivamente superados usando um método de emulsificação de baixa energia para preparar a ofiopogonina D (NOD) em nanoemulsão. Neste artigo, uma série de protocolos in vitro para avaliação da atividade celular são examinados. Os efeitos citotóxicos da L929 foram determinados usando um ensaio kit-8 de contagem celular. Em seguida, os níveis de citocinas secretadas e o número de células imunes correspondentes após a estimulação e cultura de esplenócitos de camundongos imunizados foram detectados pelos métodos ELISA e ELISpot. Além disso, a capacidade de captação de antígenos em células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs), que foram isoladas de camundongos C57BL/6 e amadurecidas após incubação com GM-CSF mais IL-4, foi observada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). É importante ressaltar que a ativação de macrófagos foi confirmada pela medição dos níveis de citocinas IL-1β, IL-6 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) por kits ELISA após a cocultura de macrófagos peritoneais (PMs) de camundongos em branco com o adjuvante por 24 h. Espera-se que este protocolo forneça a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais.

A avaliação da atividade celular dos adjuvantes OP-D e NOD foi concluída in vitro de acordo com o protocolo. Os fibroblastos L929 são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro do NOD (Figura 1). A quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode ajudar os pesquisadores a entender melhor a resposta imune (Figura 2). O monitoramento de CTLs com ELISpot é o padrão-ouro para avaliar a imunidade de células T antíg...

O protocolo apresenta métodos detalhados para avaliar se o adjuvante da nanoemulsão ofiopogonina D promove respostas imunes celulares eficazes.

In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Este protocolo pode fornecer a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes e as etapas detalhadas para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais. Não só pode fornecer aos pesquisadores métodos específicos de avaliação celular para adjuvantes, mas também pode quebrar métodos de extração, como a doença BM. Esses protocolos não apenas demonstram ausência de toxicidade e alta entrega celular, mas também fornecem procedimentos detalhados para o campo de avaliação adjuvante.Para começar, ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Então, depois de coletar um tubo de células L929 congeladas de nitrogênio líquido, descongele rapidamente no banho de água. Depois de pipetar as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, adicione dois mililitros de DMEM e misture bem.Centrifugar as amostras a 129 x g durante cinco minutos. E depois de descartar o sobrenadante, adicione dois mililitros de DMEM para ressuspender as células. Centrifugar as amostras novamente.E depois de descartar o sobrenadante, adicionar seis mililitros de meio DMEM completo para resuspensão, e transferido para um frasco de cultura quadrado de T25 centímetros em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para cultura por 48 horas. No dia 24 após a imunização primária, retire os ratos da sala de animais, coloque-os em um prato de vidro e mergulhe em álcool a 75% por cinco minutos. Coloque os tubos de centrífuga em um rack de tubo de centrífuga, numerado as placas de Petri descartáveis e adicione cinco mililitros de PBS a cada placa de Petri com uma pipeta de 10 mililitros.Faça uma incisão de seis a oito centímetros com uma tesoura no meio do lado ventral esquerdo do rato. Rasgue a pele para expor a parede abdominal e localize a longa faixa vermelha do baço. Em seguida, levante o peritônio no lado inferior do baço com fórceps.Corte-o aberto e vire-o para cima para expor o baço. Levante o baço com fórceps. Separe o tecido conjuntivo sob o baço com uma tesoura oftálmica e remova o baço.Coloque o baço em uma placa de Petri contendo cinco mililitros de PBS e moa com uma peneira e um êmbolo de seringa. Após a moagem, transfira o líquido para um tubo de centrífuga de 15 mililitros com uma pipeta de acordo com a numeração. Em seguida, centrifugar o líquido a 453 x g por cinco minutos.E depois de descartar o sobrenadante, adicione três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos a cada tubo. Ressuspenda as células e lise à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, adicione 10 a 12 mililitros de PBS a cada tubo.E depois de misturar e centrifugar a 453 x g por cinco minutos, descarte o sobrenadante e adicione 10 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga e ressuspenda as células. Pegue 20 microlitros de cada amostra em um poço da placa de contagem de células e registre o número de células vivas usando um contador de células automatizado. Em seguida, centrifugar as amostras a 453 x g por cinco minutos.E depois de descartar o sobrenadante, diluir para 2,5 x 10 até a sexta célula por mililitro com meio RF10 e adicionar a uma placa de 96 poços a 100 microlitros por poço. Corte uma incisão de seis a oito centímetros abaixo do abdômen do rato com uma tesoura e prenda as duas extremidades da abertura para separá-la em direções diferentes e expor as pernas do rato. Separe o fêmur do rato do corpo do rato e a tíbia da articulação.E mantenha os ossos intactos em ambas as extremidades. Em seguida, remova o tecido residual e a cartilagem das articulações articulares em ambas as extremidades do fêmur com tesoura e pinça. Mergulhe os fêmures em álcool a 75% por cinco minutos e, em seguida, mergulhe em uma solução estéril de PBS para lavar o álcool da superfície.Em seguida, corte as extremidades dos fêmures com uma tesoura e enxágue a medula óssea em uma placa de Petri estéril com solução estéril de PBS, seguida de aspiração com uma seringa de um mililitro. Repita a lavagem de três a cinco vezes. Em seguida, filtre por uma peneira celular e colete as células dendríticas derivadas da medula óssea em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Após centrifugação das amostras a 290 x g durante cinco minutos, eliminar o sobrenadante e adicionar quatro mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos, ressuspender e lisar à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de solução estéril de PBS para neutralizar o lisado e, após centrifugar a 290 x g por cinco minutos, descarte o sobrenadante. Ressuspender as células em um mililitro de DMEM contendo solução de 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bovino e contagem.Em seguida, adicione o fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos mais interleucina-4 ao meio. Ajustar a concentração celular para 5 x 10 para o quinto por mililitro e inocular as células em folhas de cobertura. Depois de adicionar a suspensão celular a uma placa de seis poços a dois mililitros por poço, coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas.Mude o meio completamente após dois dias e mude metade do meio após quatro dias. Mergulhe os ratos em álcool a 75% após a eutanásia e coloque-os virados para cima em uma placa de Petri de vidro em ordem numerada. Passe os ratos através da janela de transferência para a sala de operação estéril e coloque-os na mesa de operação por cinco minutos.Usando a seringa, aspirar 10 mililitros de solução salina. Incline os ratos para baixo a aproximadamente 45 graus e injete no meio da cavidade abdominal. Desenhe cerca de cinco mililitros de suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros para cada 10 mililitros e repita a injeção três vezes.Centrifugar a suspensão celular a 129 x g durante cinco minutos para obter macrófagos primários peritoneais de rato. Os fibroblastos L929 são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro do NOD. A quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode ajudar os pesquisadores a entender melhor a resposta imune.O monitoramento de linfócitos T citotóxicos com imunospot enzimático é o padrão-ouro para avaliar a imunidade de células T específicas de antígenos em ensaios clínicos e para triagem de candidatas a vacinas. O aumento da absorção de um antígeno por células dendríticas pode provocar respostas imunes adaptativas aprimoradas. Os macrófagos desempenham um papel importante na apresentação de antígenos às células T, bem como na indução de outras células apresentadoras de antígenos a expressar moléculas coestimulatórias, iniciando assim respostas imunes adaptativas.O isolamento das células sob a proporção de droga para ação celular é de extrema importância.

in-vitro-cellular-activity-evaluation-nanoemulsion-vaccine-adjuvant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resposta imune de anticorpos a uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em camundongos pré-imunizados. A imunização aumenta a resposta de anticorpos, conforme confirmado pela determinação dos títulos de anticorpos IgG.

Medindo os níveis de imunoglobulina G contra uma vacina de teste em um soro de camundongo

Este vídeo demonstra a produção de vacinas tumorais em nanoemulsão. Os depósitos estáveis de reservatórios de petróleo que transportam peptídeos sintéticos e adjuvantes são produzidos por nanoemulsão de baixa energia, oferecendo uma promessa significativa para a imunoterapia tumoral.

Preparação de uma vacina adjuvante de nanoemulsão

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.

Síntese e Caracterização de nanopartículas poli-carregadas de mRNA (Beta Aminoesters) para fins de vacinação

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Para projetar racionalmente adjuvantes eficientes, desenvolvemos emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-láticas-co-glicólicas (PNPE). O PNPE possuía maciez única e uma interface hidrofóbica para contato celular potente e oferecia carga de antígenos de alto conteúdo, melhorando a afinidade celular do sistema de entrega às células apresentadoras de antígenos e induzindo a internalização eficiente de antígenos.

Afinidade celular da emulsão estabilizada por partículas para aumentar a internalização de antígenos

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.

Ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do OVA

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos...

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

Aprenda a avaliar respostas imunes celulares induzidas pelo adjuvante nanoemulsão ofiopogonina D usando células L929. Este protocolo demonstra ausência de toxicidade e alta entrega celular para pesquisa em vacinas.

In vitro Avaliação da Atividade Celular da Vacina de Nanoemulsão Adjuvante Ofiopogonina D

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