Name: Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a sintetizar peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações aromáticas para melhorar a permeabilidade através de barreiras biológicas em aplicações de entrega de fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é apoiado pela Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) e pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (2682021ZTPY075).

1. Preparação do equipamento
OBS: Realizar todos os procedimentos em exaustor de operação com equipamentos de proteção individual adequados.
<ol><li>Montar o aparelho manual de síntese de peptídeos na capela de fumaça (Figura 1). Coloque as torneiras de três vias (ver Tabela de Materiais) no coletor de vácuo (ver Tabela de Materiais) e conecte-as ao nitrogênio (N2). Certifique-se de tampar as entradas não utilizadas.</li>
	<li>Fixe uma coluna de polipropileno de 10 ml (ver Tabela de Materiais) nas torneiras de três vias. Escorra a mistura de reacção ou solventes da coluna de polipropileno utilizando um bulbo de pipeta de borracha ou um vácuo através de uma armadilha de resíduos.</li>
</ol>2. Síntese do peptídeo R8 linear marcado com FITC (FITC-R8) e do peptídeo R8 grampeado marcado com FITC (FITC-sR8-4)
NOTA: Os peptídeos foram sintetizados de acordo com um protocolo padrão de síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS) baseado em Fmoc25. A resina 4-(2',4'-Dimetoxifeil-Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamido-norleucil-MBHA (resina de MBHA de amida de rinque, ver Tabela de Materiais) foi usada durante todo o estudo.
CUIDADO: N, N-dimetilformamida (DMF), N, N-diisopropiletilamina (DIPEA), morfolina e diclorometano (DCM) são todos incolores e são prejudiciais se inalados ou absorvidos através da pele. O éter é extremamente inflamável. O 1,2-etaniol (EDT) é uma substância particularmente odorífera. O ácido trifluoroacético (TFA) é altamente corrosivo, e sua acidez é de 10 a5 vezes a do ácido acético. Consequentemente, todos os reagentes e produtos químicos devem ser tratados com o uso de equipamentos de proteção em uma capela de fumaça.
<ol><li>Preparar a resina para síntese de peptídeos.<ol><li>Calcular a massa de resina necessária para a síntese:Massa de resina (mg) = escala (mmol) / capacidade de carga de resina (mmol/g) × 1.000 (mg/g) NOTA: Por exemplo, a massa da resina MBHA de amida de rinque (0,572 mmol/g) para 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1.000 mg/g = 350 mg.</li>
		<li>Adicionar 4-5 mL de DMF à quantidade necessária de resina e transferir para a coluna de polipropileno de 10 mL (passo 1.2) com borbulhamento suave de N2 por 30 min para inchar adequadamente a resina e, em seguida, drenar o DMF.</li>
		<li>Adicionar 4-5 mL de morfolina/DMF a 50% (v/v) à resina, borbulhar suavemente N2 por 30 min 2x para remover o grupo Fmoc N-terminal e, em seguida, drenar a mistura. Em seguida, lave bem a resina 3x adicionando 4-5 mL de DMF à coluna e borbulhando com N2 por pelo menos 1 min de cada vez. Continue a lavar a resina com DCM (3x) e DMF (3x) da mesma forma.</li>
	</ol></li>
	<li>Execute o acoplamento de aminoácidos protegido por Fmoc conforme descrito abaixo. NOTA: O acoplamento de arginina em uma síntese manual em escala de 0,2 mmol é descrito aqui como um exemplo.<ol><li>Dissolver Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 equiv., 648,8 mg) e 2-(7-azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HATU, 4,9 equiv., 372,6 mg) em 5 mL de DMF em um tubo de centrífuga.</li>
		<li>Adicionar DIPEA (10 equiv., 348,4 μL) para activar a reacção de acoplamento e, em seguida, transferir a mistura reactiva para a coluna de polipropileno de 10 ml com resina (preparada no passo 2.1.3). Em seguida, agite suavemente a mistura com N 2 borbulhando por1-2 h.</li>
		<li>Repetir a reacção de engate (passo 2.2.1 e passo 2.2.2) uma vez.</li>
		<li>Após a conclusão do acoplamento, drene a mistura de reação e lave a resina sequencialmente com DMF, DCM e DMF 3x cada por pelo menos 1 min cada vez.</li>
		<li>Realizar o acoplamento de cada aminoácido em etapas ordenadas: Adicionar 4-5 mL de morfolina/DMF a 50% (v/v) à resina, borbulhar suavemente com N 2 por 30 min 2x para remover o grupo N α-Fmoc, depois lavar a resina (como mostrado na etapa 2.2.4) e proceder ao acoplamento do próximo aminoácido (conforme mostrado nas etapas 2.2.1 e 2.2.2). Prossiga com vários ciclos desta etapa para alcançar a síntese do peptídeo desejado. NOTA: Este processo pode ser pausado aqui. Condensar a resina com metanol e secar a resina com um fluxo contínuo de N2. Tampe a coluna de polipropileno e, em seguida, armazene a resina a 4 °C por alguns dias (ou a -20 °C para armazenamento mais longo). Inchar a resina com 4-5 mL de DMF por 0,5-1 h antes de iniciar uma nova síntese. Se avançar diretamente para a próxima etapa, não há necessidade de condensar a resina.</li>
	</ol></li>
	<li>Rotular os peptídeos com isotiocianato de fluoresceína (FITC) conforme descrito abaixo.<ol><li>Acoplar a beta-alanina como espaçador para marcação FITC usando o mesmo processo usado para acoplamento de aminoácidos na etapa 2.2.</li>
		<li>Realizar a marcação FITC de peptídeos na resina adicionando uma mistura de FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.) e DMF à coluna de polipropileno e reagindo no escuro por 8 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Para a síntese do FITC-sR8-4, realizar a ciclização do peptídeo linear conforme descrito abaixo.<ol><li>Adicionar uma mistura de TFA/triisopropilsilano (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) à coluna de polipropileno durante 2 minutos para remover selectivamente o grupo protector Cys (Trt) e, em seguida, drenar a mistura. Repita o procedimento acima até que a solução amarelada se torne incolor para remover completamente o grupo protetor Trt.</li>
		<li>Em seguida, realizar lavagens sequenciais da resina com DMF e DCM pelo menos 3x. Em seguida, dissolver 4,4'-bis(bromometil)bifenil (2 equiv.) em DMF com DIPEA (4 equiv.), adicioná-lo à coluna e reagir por 4 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Clivar os peptídeos conforme descrito: Após a conclusão da síntese peptídica, lavar a resina com 4-5 mL de metanol duas vezes por 5 min cada e secá-la com um fluxo contínuo de N2. Trate a resina com um coquetel de clivagem eficaz TFA/TIS/H 2 O (95/2,5/2,5, v/v/v), ou TFA/TIS/EDT/H 2 O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) para peptídeos contendo cisteínas, usando aproximadamente 1 mL de coquetel de clivagem para cada 100 mg de resina. Trate a resina ligada ao peptídeo por 2-3 h para clivar o peptídeo e, em seguida, remover o TFA cuidadosamente com uma corrente de N2.</li>
	<li>Para obter os peptídeos brutos, adicione 4-5 mL de éter dietílico à preparação peptídica clivada para precipitar os peptídeos brutos e centrifugar a 10.000 × g por 4 min. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque o peptídeo ao ar por 3 minutos em uma exaustora eficaz.</li>
	<li>Análise dos peptídeos: Dissolver um peptídeo bruto em pequena escala (clivado de aproximadamente 10 mg de resina ligada a peptídeos) em 800 μL de acetonitrila (ACN)/H2O (1/1, v/v) e, em seguida, analisar usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) e cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Purificar os peptídeos usando RP-HPLC e LC-MS.<ol><li>Dissolver 50 mg de produto peptídico bruto em 4 ml de ACN/H2O (1/1, v/v) e injetar a solução num sistema RP-HPLC equipado com uma coluna C18 (4,6 mm x 150 mm, tamanho dos poros: 120 Å, tamanho da partícula: 4 μm; ver Tabela de Materiais). Eluir o peptídeo usando uma fase móvel contendo 0,1% TFA/H2O (v/v) e ACN, com um gradiente de 10% a 90% ACN ao longo de 30 min. Peptídeos convencionais foram detectados a 220 nm e peptídeos marcados com FITC a 494 nm.</li>
		<li>Coletar as frações correspondentes ao pico peptídico principal identificado por MS e, em seguida, liofilizar as frações peptídicas desejadas. Conservar o péptido purificado a -20 °C. NOTA: Os m/z encontrados do FITC-R8 purificado são os seguintes: [M + 3 H]3+: 576,63; [M + 4 H] 4+: 432,72; [M + 5 H] 5+: 346,39; [M + 6 H] 6+: 288,85. Os m/z encontrados do FITC-sR8-4 purificado são os seguintes: [M + 3 H]3+: 704,74; [M + 4 H] 4+: 528,77; [M + 5 H] 5+: 423,34; [M + 6 H] 6+: 352,91. Condições analíticas de EM: instrumento: ESI (viés de sonda: +4,5 kV; detector: 1,2 kV); fluxo de gás do nebulizador: 1,5 L/min; linha de desolvação curva (CDL): −20 V; Temperatura CDL: 250 °C; temperatura do bloco: 400 °C; vazão: 0,2 mL/min; fase móvel: 50% H2O/50% ACN.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantificação dos peptídeos marcados com FITC
<ol><li>Dissolva uma pequena quantidade de peptídeo purificado em DMSO como solução estoque (por exemplo, 40 μmol/mL).</li>
	<li>Medir a absorbância a 494 nm (A 494) de 2 μL da solução-mãe em498 μL de solução salina tamponada com fosfato 10 mM (1x PBS, pH 7,4) com uma placa de microtitulação (ver Tabela de Materiais) utilizando um leitor de microplacas multitecnologia (ver Tabela de Materiais). O fator de diluição é de 500 μL/ 2 μL = 250, e o comprimento do caminho da placa de microtitulação é de 0,5 mm.</li>
	<li>Calcular a concentração da solução-mãe utilizando a seguinte fórmula: Concentração (mM) = A494 × fator de diluição / 0,05 (cm) / 77.000 (cm−1· M−1) × 1.000 (mM·M−1)</li>
	<li>Ajustar a uma diluição adequada de modo a que o valor A494 medido se situe entre 0,1 e 1,0. NOTA: As medições devem ser repetidas várias vezes para garantir que a concentração medida é precisa. O coeficiente de extinção de 77.000 cm−1· M−1 surge do grupo FITC.</li>
</ol>4. Estabilidade de peptídeos no soro fetal bovino (SFB)
<ol><li>Incubar o peptídeo a uma concentração de 100 μM com 250 μL de 25% FBS/H2O (v/v) a 37 °C. Depois de incubar por 0 h, 1 h, 2 h e 4 h, tomar alíquotas de 10 μL e, em seguida, adicionar 150 μl de ácido tricloroacético a 12% dissolvido em H2O/ACN (1/3, v/v) para precipitar as proteínas séricas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 10.000 × g durante 5 minutos e analisar o sobrenadante utilizando HPLC (conforme descrito no passo 2.8) para determinar a extensão da degradação do péptide.</li>
	<li>Calcular a razão entre a área do pico em 1 h, 2 h e 4 h e aquela em 0 h para obter a fração de peptídeo não degradado no tempo correspondente. O resultado é a média de três amostras paralelas.</li>
</ol>5. Captação celular dos peptídeos
<ol><li>Imagem microscópica de fluorescência<ol><li>Coloque uma tampa redonda em uma placa de 12 poços. Em seguida, inocular 1 x 105 células uniformemente nas lamínulas e cultivar durante a noite com 2 mL de meio. Retire o meio e lave as células 3x com 1 mL de PBS. NOTA: Neste estudo, células HeLa e células 4T1 foram cultivadas em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM, ver Tabela de Materiais) suplementado com 10% de FBS em uma incubadora umidificada a 37 °C contendo 5% de CO2.</li>
		<li>Incubar as células com 1 mL de peptídeos marcados com FITC 3 μM em DMEM livre de FBS por 1 h a 37 °C. Em seguida, remova o meio contendo peptídeo e lave as células 3x com 1 mL de PBS.</li>
		<li>Manchar as células com 1 mL de Hoechst 33258 por 15 min. Observe a internalização de cada peptídeo usando um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais) com a mesma intensidade de fluorescência e tempo de exposição. NOTA: As seguintes configurações foram usadas para microscopia de fluorescência. Objetivo: Plano-Apócroma: 63 x/1,40 óleo DIC M27; Canal 1 para FITC: filtro de excitação: 450-490 nm, filtro de emissão: 500-550 nm, tempo de exposição: 230 ms; Canal 2 para Hoechst 33258: filtro de excitação: 335-383 nm, filtro de emissão: 420-470 nm, tempo de exposição: 27 ms.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise por citometria de fluxo<ol><li>Inocular 5 x 105 células HeLa uniformemente em placas de 12 poços e cultura em DMEM por 24 h a 37 °C. Em seguida, retire o meio e lave as células 3x com 1 mL de PBS.</li>
		<li>Incubar as células com 1 mL de peptídeos marcados com FITC 3 μM em DMEM livre de FBS por 1 h a 37 °C. Remover o meio contendo peptídeo, dissociar as células com tripsina 0,25% (p/v) e EDTA 0,53 mM em PBS por 5 min e, em seguida, coletar as células por centrifugação a 306 × g por 4 min. Lave o pellet de células com PBS.</li>
		<li>Incubar as células com 1 mL de azul de tripano a 0,05% (p/v) em PBS por 3 min para extinguir a fluorescência ligada à superfície e realizar análise quantitativa da fluorescência intracelular usando um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais). NOTA: Configurações de citometria de fluxo: excitação: 488 nm, emissão: 530 nm. O azul de tripano também pode extinguir a fluorescência de células mortas e ajudar a distinguir células vivas / mortas durante a análise da captação de peptídeos.</li>
		<li>Tratar e testar células 4T1 usando citometria de fluxo seguindo o mesmo protocolo descrito para células HeLa. Coletar 5 x 105 células por amostra e configurar três amostras paralelas por grupo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Exploração da penetração célula-célula dos peptídeos utilizando modelos transwell
<ol><li>Inocular 1 x 105 células HeLa em 2 mL de DMEM em uma câmara de 12 poços com uma inserção de placa de cultura de tecidos (ver Tabela de Materiais) e incubar por 24 h em uma incubadora umidificada a 37 °C contendo 5% de CO2. Em seguida, remover o meio e incubar as células nas câmaras com 1 mL de FITC-R8 10 μM ou FITC-sR8-4 (purificado por HPLC) em DMEM livre de FBS por 1 h.</li>
	<li>Retire o meio que contém os peptídeos e lave as células 3x com 1 mL de PBS. Adicionar 1 mL de DMEM fresco livre de FBS às câmaras e, em seguida, co-incubar as células HeLa na câmara com a placa de cultura de tecidos inserida com as células HeLa nas lamínulas redondas na parte inferior por 2 h.</li>
	<li>Fixar as células HeLa nas lamínulas redondas com glutaraldeído a 2,5% durante 15 min e, em seguida, corar as células com DAPI durante 15 min. Em seguida, observe as células HeLa nas lamínulas sob um microscópio de fluorescência. Tratar e testar células 4T1 usando o mesmo protocolo usado para células HeLa.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly%28mannitol-co-PEI%29+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li>
<li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li>
<li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+on+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li>
<li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li>
<li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+Classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+%28PNA%29+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li>
<li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li>
<li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery%3A+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li>
<li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+%CE%B2-catenin+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li>
<li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+%CE%B1-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li>
<li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li>
<li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+in+shape%3A+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+%CE%B1-helical+peptides%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li>
<li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li>
<li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+short+%CE%B1-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li>
<li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li>
<li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrocyclic+cell+penetrating+peptides%3A+A+study+of+structure-penetration+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+%CE%B1-helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li>
<li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+proteolytically+stable%2C+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li>
<li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cationic+amphiphilic+%CE%B1-helical+peptides+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li>
<li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+Tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A estabilização química de peptídeos pela incorporação de restrições conformacionais tem se mostrado uma estratégia eficaz para melhorar a estabilidade e a permeabilidade celular do peptídeo26. Neste protocolo, um procedimento passo-a-passo é descrito para a síntese de CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Comparada às ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas22,27, a incorporação de ligações cruzadas arom...

As últimas décadas testemunharam rápidos avanços no desenvolvimento de peptídeos penetrantes em células (CPPs) para liberação de fármacos. As PPCs têm sido amplamente utilizadas como transportadores moleculares para o tratamento de uma série de doenças potencialmente fatais, incluindo distúrbios neurológicos1,2, doenças cardíacas3, diabetes4, dermatoses5 e câncer 6,7. O câncer continua sendo um fardo de saúde global acompanhado por uma alta taxa de morbidade e mortalidade, apesar dos amplos esforços de pesquisa8. Um sério obstáculo ao tratamento do câncer é o acesso limitado da terapêutica a células tumorais mais profundas devido a barreiras fisiológicas, como matriz extracelular compacta (MEC), vasculatura tumoral anormal, múltiplas barreiras de membrana e alta pressão do fluido intersticial (IFP)9. Assim, o desenvolvimento de novas PPCs com capacidade superior de entregar cargas através de barreiras biológicas é considerado uma estratégia essencial para o tratamento do câncer10,11.
As PPCs podem ser classificadas em catiônicas, anfipáticas e hidrofóbicas em termos de suas propriedades físico-químicas12. Dentre estes, o peptídeo HIV-TAT carregado positivamente e a poliarginina sintética são de considerável importância na pesquisa biomédica e têm sido extensivamente estudados para facilitar a liberação intracelular de fármacos13. Tunnemann e col. relataram que um comprimento mínimo de oito argininas é essencial para a penetração celular eficiente dos peptídeos sintéticos de poliarginina, com base em um estudo de permeabilidade celular realizado usando peptídeos R3 aR12 14. No entanto, essas PPCs geralmente têm meias-vidas plasmáticas curtas devido à sua rápida hidrólise in vivo. Além disso, pouco se sabe sobre a otimização da estrutura química das PPCs para aumentar sua capacidade de transbarreira, uma vez que é um desafio penetrar em múltiplas membranas celulares15. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares capazes de penetrar barreiras biológicas é fortemente desejado para aumentar a eficiência da liberação de fármacos. Em 2020, Komin et al.16 descobriram um CPP chamado peptídeo CL, que contém um motivo de hélice (RLLRLLR) e uma cauda de poliarginina (R7) para cruzar a monocamada epitelial. Um conjunto de variantes peptídicas CL também foram sintetizadas alterando o padrão helicoidal. Esta exploração pode ser um guia significativo para o desenvolvimento de novos CPPs para a entrega de cargas através de barreiras biológicas. Além disso, Dietrich e col. otimizaram a permeabilidade celular do peptídeo StAX, inibindo a via de sinalização Wnt/β-catenina por aumentar a hidrofobicidade global dos peptídeos17.
A restrição conformacional de peptídeos lineares não estruturados por ciclização é uma maneira eficaz de aumentar sua estabilidade proteolítica e permeablidade18,19,20. O reforço estrutural aumenta a resistência às proteases dos peptídeos cíclicos, tornando-os mais estáveis in vivo em comparação com seus equivalentes lineares. Além disso, a ciclização de peptídeos pode potencialmente mascarar a espinha dorsal do peptídeo polar por promover a ligação intramolecular de hidrogênio, aumentando assim a permeabilidade da membrana dos peptídeos21. Nas últimas duas décadas, métodos quimiosseletivos de ciclização tornaram-se estratégias eficazes para a construção de peptídeos cíclicos com diferentes arquiteturas, como hidrocarbonetos, lactâmicos, triazóis, m-xileno, perfluoroaril e outras ligações cruzadas22,23. A barreira biológica imposta pelo sofisticado microambiente tumoral poderia reduzir a penetração de fármacos em tumoressólidos24. Verificamos anteriormente que as PPCs cíclicas apresentaram resistência superior à digestão enzimática em relação às suas contrapartes lineares20. Além disso, a hidrofobicidade global dos peptídeos é crítica para sua maior permeabilidade celular22. Com base nos estudos discutidos acima, a combinação de um padrão carregado positivamente, hidrofobicidade global elevada e maior estabilidade da proteólise pode ser hipotetizada para aumentar a permeabilidade das PPCs através de barreiras biológicas. Em um estudo recente, identificamos duas CPPs cíclicas com ligações cruzadas aromáticas nas posições i e i+7 que exibem melhor permeabilidade em células e tecidos tumorais em comparação com suas contrapartes lineares15. Aqui, um protocolo sintético conciso para a síntese de CPPs cíclicas marcadas fluorescentemente e os principais passos para investigar sua permeabilidade são apresentados.

<table><tbody><tr><td>1,2-etanodiidol</td><td>Aladdin</td><td>K1722093</td><td>fedor</td></tr><tr><td>2- (7-Azobenzotriazol) -N, N, N', N', N'-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HATU)</td> <td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-bis (bromometil) bifenil</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 células</td><td>ATCC</td><td></td><td>As células 4T1 foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FBS (Hyclone) em um 37 &deg; C incubadora umidificada contendo 5% de CO2.</td></tr><tr><td>Acetonitrila&nbsp;</td><td>Toxicidade</td><td>1484971</td> <td>de Adamas</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Energia</td><td>W330229</td><td>pele prejudicial</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>inflamável</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>pele prejudicial</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM)</td><td>Espectrômetro</td> de Massa de Ionização Gibco <td></td><td></td></tr><tr><td>Electrospray</td><td>Águas</td><td>G2-S Tof</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Etileno Diamina Tetracético (EDTA)</td><td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Citômetro de fluxo HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>Isômero de isotiocianato de fluoresceína ( FITC)</td><td>Microscópio</td><td>Fluorescente Energy E0801812500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&beta; Células HeLa Ala-OH</td><td>Adamas</td><td>51341C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>As células ATCC</td><td></td><td>HeLa foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS (Hyclone) em um 37 &deg; C incubadora umidificada contendo 5% de CO2.</td></tr><tr><td>Cromatografia Líquida de Alta Eficiência</td><td>Agilent Agilent</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência</td><td>Agilent</td><td>Poroshell EC-C18 120, 4,6 &vezes; 150 mm (tamanho do poro 120 &Aring;, tamanho de partícula 4 &mu; m)</td><td></td></tr> <tr><td>Liofilizador</td><td>SP Scientific</td><td>Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>toxicidade</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação</td><td>Thermo &mu; placa de queda</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas multitecnologia</td><td>Thermo</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N, N-Diisopropylethylamine</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>irritante</td></tr><tr><td>N, N-Dimetil formamida</td><td>Energia</td><td>B020051</td><td>prejudicial à pele</td></tr><tr><td>Poly-Prep coluna</td><td>Bio-Rad</td><td>Colunas</td> de <td>cromatografia em polipropileno</td>7321010</tr><tr><td>Resina Rink Amide MBHA (0,572 mmol/g)</td><td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>Torneiras de três vias</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Inserção de placa de cultura de tecidos</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td><td>corrosivo</td></tr><tr><td>Triisopropilsilano</td><td>HEOWNS</td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de vácuo</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

construção de peptídeos cíclicos penetrantes em células para maior penetração de barreiras biológicas

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

O câncer tem sido um grande desafio na saúde global. No entanto, o complexo microambiente tumoral geralmente limita o acesso da terapêutica a células tumorais mais profundas, levando à recorrência tumoral. Para vencer a penetração limitada de barreiras biológicas, peptídeos penetrantes de células (CPPs) foram descobertos com excelente capacidade de translocação de membrana e emergiram como transportadores moleculares úteis para entregar várias cargas nas células. No entanto, as PPCs lineares convencionais geralmente apresentam estabilidade proteolítica comprometida, o que limita sua permeabilidade através de barreiras biológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares que possam penetrar em barreiras biológicas e exibir maior estabilidade proteolítica é altamente desejado para promover a eficiência na liberação de fármacos em aplicações biomédicas. Nós sintetizamos previamente um painel de CPPs cíclicos curtos com ligações cruzadas aromáticas, que exibiram permeabilidade superior em células e tecidos cancerosos em comparação com seus homólogos lineares. Aqui, um protocolo conciso é descrito para a síntese do peptídeo R8 cíclico de poliarginina fluorescentemente marcado e sua contraparte linear, bem como os principais passos para investigar sua permeabilidade celular.

Neste protocolo, um procedimento sintético para restringir a poliarginina linear R8 em sua forma cíclica foi apresentado. A SPPS foi realizada manualmente, utilizando-se aparelho simples (Figura 1). O processo sintético detalhado da SPPS é mostrado na Figura 2. Resumidamente, a resina estava suficientemente inchada, seguida pela desproteção do grupo protetor N α-Fmoc. Em seguida, o aminoácido N α-Fmoc protegido foi ancorado na resina ...

Este protocolo descreve a síntese de peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações cruzadas aromáticas e a avaliação de sua permeabilidade através de barreiras biológicas.

Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Um sério obstáculo para o tratamento do câncer é o acesso limitado da terapêutica a células tumorais mais profundas devido a barreiras fisiológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares capazes de tratar barreiras biológicas é fortemente desejado para aumentar a eficiência da liberação de fármacos. O objetivo deste procedimento é sintetizar os peptídeos cíclicos penetrantes em células para maior penetração célula-a-célula.A vantagem deste método é que a ciclização peptídica pode ser facilmente conseguida através de reações de substituição por cisteínas e resina sem a necessidade de catalisadores metálicos. A incorporação de ligações cruzadas aromáticas melhora a hidrofobicidade global dos peptídeos em comparação com as ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas, aumentando assim sua permeabilidade. Para começar, monte o aparelho manual de síntese de peptídeos no exaustor.Coloque as torneiras de três vias no coletor de vácuo e conecte-as ao nitrogênio. Certifique-se de tampar as entradas não utilizadas. Fixe uma coluna de polipropileno de 10 mililitros nas torneiras de três vias e escorra a mistura de reacção ou solventes da coluna de polipropileno utilizando um bulbo de pipeta de borracha ou um vácuo através de uma armadilha de resíduos.Para preparar a resina para síntese peptídica, adicione 4 a 5 mililitros de DMF à quantidade necessária de resina e transfira-a para a coluna de polipropileno com borbulhamento suave de nitrogênio por 30 minutos para inchar a resina adequadamente. Escorra o CPO e adicione 4 a 5 mililitros de 50% de morfolina/DMF à resina. Borbulhar suavemente o azoto durante 30 minutos para remover o grupo Fmoc N-terminal e, em seguida, escorra a mistura.Lave bem a resina três vezes, adicionando 4 a 5 mililitros de DMF à coluna e borbulhando com nitrogênio por pelo menos 1 minuto de cada vez. Da mesma forma, lavar a resina com diclorometano três vezes e DMF três vezes. Em seguida, dissolva 648,8 miligramas de arginina protegida por Fmoc e PBF e 372,6 miligramas de HATU em 5 mililitros de DMF em um tubo de centrífuga.Adicionar 348,4 microlitros de DIPEA para ativar a reação de acoplamento e transferir a mistura de reação para a coluna de polipropileno com resina. Agite suavemente a mistura com borbulhamento de nitrogênio por 1 a 2 horas e, em seguida, repita a reação de acoplamento uma vez. Escorra a mistura de reação e lave a resina sequencialmente com DMF, diclorometano e novamente DMF três vezes cada por pelo menos 1 minuto cada vez.Remova o grupo protetor Fmoc e lave a resina seguindo o procedimento mostrado anteriormente antes de proceder ao acoplamento do próximo aminoácido. Em seguida, acople a beta-alanina como um espaçador para marcação de FITC usando o mesmo processo mostrado para acoplamento de aminoácidos e, em seguida, adicione uma mistura de FITC, DIPEA e DMF à coluna de polipropileno no escuro para realizar a marcação FITC de peptídeos na resina. A reação levaria quase 8 horas.Para realizar a ciclização do peptídeo linear, adicione uma mistura de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e diclorometano à coluna de polipropileno por 2 minutos para remover seletivamente o grupo tritilprotetor da cisteína. Escorra a mistura e repita o procedimento até que a solução amarelada se torne incolor para remover completamente o grupo protetor de tritil. Realizar lavagens sequenciais da resina com DMF e diclorometano pelo menos três vezes e dissolver 4,4'bis-bromometil-bifenil em DMF com DIPEA.Adicione a solução à coluna e reaja durante 4 horas. Lave a resina com 4 a 5 mililitros de metanol duas vezes por cinco minutos cada, e seque-a com um fluxo contínuo de nitrogênio. Para peptídeos contendo cisteínas, tratar a resina com um coquetel de clivagem eficaz de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e água ou ácido trifluoroacético, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol e água.Trate a resina ligada ao peptídeo por 2 a 3 horas para clivar o peptídeo e, em seguida, remova o ácido trifluoroacético cuidadosamente com uma corrente de nitrogênio. Para obter os peptídeos brutos, adicione 4 a 5 mililitros de éter dietílico à preparação peptídica clivada para precipitar os peptídeos brutos e centrifugar a 10.000 x g por 4 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque o peptídeo ao ar por 3 minutos em uma exaustora eficaz.Dissolva o peptídeo bruto em pequena escala em 800 microlitros de acetonitrila e, em seguida, analise-o usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e cromatografia líquida-espectrometria de massas. Inocular 100.000 células HeLa em 2 mililitros de DMEM em uma câmara de 12 poços com uma inserção de placa de cultura de tecido e incubar por 24 horas em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius contendo 5% de dióxido de carbono. Remover o meio e incubar as células nas câmaras com 1 mililitro de 10 micromolares FITC-R8 ou FITC-sR8-4 em DMEM livre de FBS por 1 hora.Depois disso, remova o meio que contém os peptídeos e lave as células três vezes com 1 mililitro de PBS. Adicione 1 mililitro de DMEM fresco livre de FBS às câmaras e, em seguida, co-incube as células HeLa na câmara com a inserção da placa de cultura de tecido, com as células HeLa nas lamínulas redondas na parte inferior por 2 horas. Fixar as células HeLa nas lamínulas redondas com glutaraldeído a 2,5% durante 15 minutos e, em seguida, corar as células com DAPI durante 15 minutos.Finalmente, observe as células HeLa nas lamínulas sob um microscópio de fluorescência. Um diagrama esquemático da síntese do peptídeo R8 linear marcado com FITC e do peptídeo R8 grampeado marcado com FITC é apresentado aqui. Os espectros de HPLC e MS do peptídeo linear R8 e do peptídeo R8 grampeado são mostrados nesta figura.O tempo de retenção do peptídeo grampeado foi substancialmente maior do que o do análogo linear, indicando uma maior hidrofobicidade global do peptídeo após a ciclização com a reticulação hidrofóbica. Esta imagem gráfica representa a estabilidade do peptídeo linear e do peptídeo grampeado na presença de 25% FBS. O R8 cíclico permanece 77,3% intacto após incubação com FBS por 4 horas, enquanto sua contraparte linear foi degradada em sua maioria, sugerindo maior estabilidade proteolítica do peptídeo R8 cíclico.Imagens de microscopia de fluorescência de células vivas de células HeLa e células 4T1 após 1 hora de incubação com 3 peptídeo R8 linear marcado com FITC e peptídeo R8 grampeado marcado com FITC são mostradas aqui. Pode-se observar que as células tratadas com R8 cíclico com reticulação aromática exibiram maior fluorescência intracelular do que aquelas tratadas com sua contraparte linear. Resultados semelhantes foram obtidos com a análise por citometria de fluxo.Para investigar melhor se o R8 cíclico confere maior penetração célula-a-célula, modelos transwell foram usados para simular a permeabilidade de barreira dos peptídeos de uma camada celular para outra. O R8 cíclico exibiu claramente maior penetração de transbarreira do que o peptídeo linear R8, como indicado por um aumento significativo na fluorescência intracelular. A desproteção completa do grupo tritilo cisteína e resina é importante para a etapa seguinte de ciclização.Além disso, a eficiência da ciclização também depende das sequências específicas e dos comprimentos dos peptídeos devido aos efeitos estéricos. Nesse caso, o uso de uma resina com menor capacidade de carga ou ciclização dos peptídeos sob concentrações diluídas em fase de solução seria útil. Esses peptídeos cíclicos mostraram uma permeabilidade célula-célula aumentada em comparação com suas contrapartes lineares.Acreditamos que eles são uma grande promessa para vencer barreiras biológicas e serão usados para uma base molecular para futuras aplicações no campo da liberação de fármacos.

construction-cyclic-cell-penetrating-peptides-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Transdução da proteína permite a entrega direta de proteínas biologicamente ativos nas células. Em contraste com os métodos convencionais, tais como a transfecção de DNA viral ou transdução este paradigma não-invasivo altamente eficiente permite a manipulação celular de uma forma titulável contornar toxicidade celular eo risco de transformação oncogênica por modificação genética permanente.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

Este protocolo de detalhes um método para a medida quantitativa da translocação de peptídeos em grandes vesículas lipídicas unilamelares. Este método também fornece informações sobre a taxa de translocação de membrana e pode ser usado para identificar peptídeos que de forma eficiente e espontânea cruz bicamadas lipídicas.

Medição Translocação Peptide em grandes vesículas Unilamelares

Este vídeo demonstra uma técnica que usa peptídeos de penetração de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína intracelular. Os peptídeos que penetram nas células facilitam a entrada do peptídeo conjugado em uma célula e se ligam especificamente às suas proteínas de interação. A biotina, após se ligar à avidina, permite a purificação do complexo de proteínas que interagem a partir de um lisado celular.

Sonda de peptídeo penetrante de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína

Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Um método simples e geral para a síntese de peptídeos cíclicos usando irradiação de microondas é descrito. Este procedimento permite a síntese de peptídeos cíclicos de backbone com uma coleção de diferentes conformações, mantendo as cadeias laterais e as porções farmacofóricas., e, portanto, permite rastrear a conformação bioativa.

Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

Este é um protocolo para estudar as interações da proteína-proteína intracelular baseadas no sistema biotina-avidina suspenso com a novidade de combinar sequências de célula-penetrante. A principal vantagem é que a sequência de destino é incubada com células vivas em vez de lisados celulares e, portanto, as interações ocorrerá dentro do contexto celular.

Peptídeos biotinylated célula-penetrante para estudar interações da proteína-proteína intracelular

Apresentamos aqui os protocolos para a criação de pequenas vesículas unilamelares à base de peptídeos capazes de crescimento. Para facilitar na produção do vesicobolhosas do peptide da membrana, estas vesículas são equipadas com um sistema da transcrição-Tradução e o plasmídeo da peptide-codificação.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

Este protocolo apresenta a síntese de peptídeos cíclicos via bisalquilação entre cisteína e metionina e a reação fácil tiol-yne desencadeada pelo centro de propargil sulfônio.

Construindo peptídeos cíclicos usando um centro de sulfônio on-tether

Este protocolo tem como objetivo avaliar peptídeos biofuncionais de automontagem quanto à adesão celular, morfologia organoide e expressão gênica por imunocoloração. Usaremos uma linha celular de câncer colorretal para fornecer uma maneira econômica de obter organoides para testes intensivos.

Fabricação e caracterização de organoides de câncer colorretal da linha celular SW1222 em matriz peptídica de automontagem ultracurta

Aprenda a sintetizar peptídeos cíclicos penetrantes em células com ligações aromáticas para melhorar a permeabilidade através de barreiras biológicas em aplicações de entrega de fármacos.

Construção de Peptídeos Cíclicos Penetrantes em Células para Maior Penetração de Barreiras Biológicas

Explorar mais vídeos