Name: Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a contagem rápida de unidades formadoras de colônias em placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila. Este método automatizado oferece vantagem de cem vezes em tempo comparado a técnicas tradicionais.

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O Dr. Kerwyn Casey Huang, o Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper e membros do laboratório de Ludington deram informações valiosas sobre o desenvolvimento deste protocolo. O financiamento foi fornecido pela subvenção NSF IOS 2032985, pela subvenção do NIH DP5OD017851, por uma subvenção da Carnegie Institution of Canada e pelo Carnegie Institute for Science's Endowment.

1. Colonização de moscas
NOTA: Este método é adequado para análise quantitativa de moscas com um microbioma intestinal cultivável por plaqueamento de crescimento de UFCs. Um protocolo detalhado para a criação de moscas gnotobióticas foi publicado anteriormente12.
<ol><li>Estabelecer colonização estável por uma espécie bacteriana comensal.<ol><li>Preparar uma cultura bacteriana fresca, pellet por centrifugação a 400 x g durante 3 min à temperatura ambiente, e ressuspender o pellet celular em PBS para um OD600 de 1,0. Para este protocolo, Lactiplantibacillus plantarum (anteriormente conhecido como Lactobacillus plantarum) foi cultivado durante a noite para um OD600 de 2,0.</li>
		<li>Pipetar 100 μL para o alimento num frasco para injetáveis de mosca (ver Tabela de Materiais). Espalhe uniformemente e deixe o líquido absorver por 15-30 min.</li>
		<li>Transfira 20 moscas livres de germes para este frasco para injetáveis utilizando a técnica padrão de viragem de frasco para frasco para injetáveis34. Cada mosca comerá uma quantidade aproximadamente igual da dose bacteriana35. Alternativamente, ovos livres de germes podem ser adicionados.</li>
		<li>Transfira as moscas para alimentos frescos estéreis diariamente por 3 dias. Faça tudo isso em um armário de biossegurança e use a técnica estéril (Figura 1A-1).</li>
	</ol></li>
	<li>Antes de medir a carga de UFC, transfira as moscas para um frasco contendo água de ágar estéril por 4 h para limpar as bactérias transitórias do intestino. Os frascos de água de ágar fornecem uma fonte de umidade para a mosca, mas nenhuma nutrição para a mosca ou bactérias na superfície. Eles são preparados nos mesmos frascos de moscas estéreis que com alimentos padrão, mas contêm apenas água deionizada e ágar a 1,5%.</li>
</ol>2. Homogeneização de moscas individualmente em uma placa de PCR de 96 poços
<ol><li>Prepare as placas de batedor de contas com antecedência.<ol><li>Despeje contas de vidro de 0,5 μm (consulte Tabela de materiais) na bandeja de medição de contas (impressa em 3D com a ajuda do Arquivo de Codificação Suplementar 1 S1-bead-measurer.stl). Espalhe as contas na bandeja para que todos os poços estejam cheios e nivelados e, em seguida, escove o excesso de contas em um tubo cônico para recuperá-las.</li>
		<li>Coloque uma placa de PCR semi-rodapé (consulte Tabela de Materiais) de cabeça para baixo na bandeja de medição e alinhe-a com os poços, encaixando-a no recuo na bandeja de medição. Em seguida, vire-o rapidamente para transferir as contas.</li>
		<li>Remova o excesso de contas da superfície da placa de PCR e cubra-a com papel alumínio. Inspecione a placa de PCR para garantir que todos os poços contenham contas. Use uma colher de pesagem, se necessário, para adicionar contas a um único poço. Se a eletricidade estática estiver fazendo com que as contas grudem nas superfícies da placa, limpe ou pulverize a parte de trás da bandeja de medição e da placa de PCR com etanol a 70%.</li>
		<li>Cubra com papel alumínio. Muitas placas podem ser preparadas dessa maneira e, em seguida, autoclavadas e armazenadas para uso posterior. Quando estiver pronto para uso, adicione 100 μL de PBS a cada poço usando o pipetador de 96 canais (consulte Tabela de materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Esterilizar superficialmente as moscas colonizadas por micróbios (ver passo 1) com etanol a 70% antes da homogeneização.<ol><li>Anestesiar as moscas com 100% de CO2 por 5 s. Transfira moscas anestesiadas do frasco para injetáveis para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando um pequeno funil (Figura 1A-2). Neste estudo, 25 moscas foram tipicamente adicionadas por tubo.</li>
		<li>Imediatamente pulverize ~ 1 mL de etanol a 70% no tubo, feche o tubo e misture por inversão por 10 s. Em seguida, aspirar o etanol com uma pipeta P1000, tomando cuidado para não aspirar moscas. Repetir novamente com etanol e, em seguida, duas vezes com PBS estéril (Figura 1A-3).</li>
	</ol></li>
	<li>Após a lavagem final do PBS, feche o tubo e, com o lado da tampa para baixo, bata com força algumas vezes no banco para que as moscas entrem na tampa.</li>
	<li>Abra o tubo e dispense moscas nos poços usando pinça (Figura 1A-4). Coloque uma mosca em cada poço (Figura 1A-5). Mantenha a placa no gelo durante o carregamento para manter as moscas anestesiadas.</li>
	<li>Sele a placa usando a folha de vedação térmica de ligação térmica (consulte Tabela de materiais).<ol><li>Primeiro, remova quaisquer contas perdidas que estejam perto dos poços, pois elas podem causar vazamento na vedação da folha. Certifique-se de que o lado opaco da folha esteja orientado para baixo na placa e o lado brilhante para cima em direção ao selador térmico. Pressione a seladora térmica (consulte Tabela de materiais) firmemente para baixo por 5 s (Figura 1A-6). Polir com o aplicador manual (ver Tabela de Materiais) para fixar a folha. NOTA: A má vedação é uma causa de perda de amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Prenda a placa no agitador de placas. Homogeneizar por 5 min (Figura 1A-7). Gire a placa do talão por 30 s em um mini-girador de placa (consulte Tabela de Materiais) a 350 x g para remover o líquido da folha de vedação.</li>
	<li>Remova a folha enquanto segura a placa para não espirrar gotículas de homogeneizado de mosca para fora dos poços.</li>
</ol>3. Diluição em série do homogeneizado da mosca e mancha nas placas CFU
<ol><li>Coloque quatro placas retangulares de crescimento de ágar MRS (consulte Tabela de Materiais) no armário de biossegurança e remova suas tampas. Neste protocolo, o ágar MRS foi utilizado para o crescimento de L. plantarum. Deixe estas placas secar por pelo menos 10 min (20 min se forem recém-derramadas ou frias do armazenamento). NOTA: Se as placas estiverem molhadas, as gotículas da placa de 96 poços correrão juntas e arruinarão as contagens.</li>
	<li>Prepare três placas de diluição adicionando 100 μL de PBS a cada poço de uma placa estéril de 96 poços usando um pipettor de 96 canais. Carregue um rack de pontas P20 no pipetador de 96 canais.</li>
	<li>Efectuar uma diluição a 1:10 aspirando 11,1 μL de homogeneizado da placa de amostra preparada no ponto 2 (figura 1A-8). Certifique-se de desenhar do meio dos poços em vez do fundo dos poços, porque a mosca homogeneizada e as contas de vidro entopirão as pipetas. As contas afundam e as partículas da mosca flutuam, deixando a camada intermediária mais clara.</li>
	<li>Dispensar os 11,1 μL na primeira placa de diluição, que já contém 100 μL de PBS estéril por alvéolo. Mantenha a placa de diluição no agitador de placas por 10 s a 600 rpm. Misture novamente pipetando para cima e para baixo por cinco ciclos. Transferir 11,1 μL da primeira placa de diluição para a segunda placa de diluição e repetir as etapas de mistura para as duas placas de diluição seguintes.</li>
	<li>Efectuar a chapeamento em série de diluição, conforme descrito a seguir.<ol><li>Recupere as placas de crescimento do gabinete de biossegurança.</li>
		<li>Começando com a placa mais diluída, coloque 2 μL de cada poço nas placas de ágar usando o pipetador de 96 poços (Figura 1A-9).<ol><li>Abaixe a cabeça do pipetador lentamente sobre a placa, tomando cuidado para não esfaquear o ágar. Examine a placa cuidadosamente e certifique-se de que todas as manchas foram dispensadas; caso contrário, adicionar manualmente 2 μL à posição adequada. Verifique se as manchas líquidas mergulham rapidamente no ágar e não correm juntas.</li>
			<li>Se as manchas correrem juntas, seque um novo conjunto de placas de ágar fresco por um período mais longo e refaça a mancha. Se houver vários tipos de placas (por exemplo, meios diferentes ou com antibióticos), localize-os também. Dispensar qualquer solução restante de volta para a placa de diluição e proceder à concentração imediatamente mais elevada. NOTA: Ao detectar diluições, misture a diluição seguinte cinco vezes para garantir que o conteúdo das pontas da pipeta está limpo da diluição anterior. As placas de diluição podem ser armazenadas >8 h a 4 °C sem afetar a contagem de colônias35.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Repetir o processo de chapeamento descrito na etapa 3.5 para as restantes placas de diluição, progredindo da mais diluída para a mais concentrada até à placa com o homogeneizado original.</li>
	<li>Quando todo o líquido tiver sido absorvido pelo ágar, inverta as placas e coloque-as na incubadora (Figura 1A-10). Para Lactiplantibacillus e Acetobacter de Drosophila, a temperatura ideal é de 30 °C em meio MRS. Incubar até que as colônias tenham atingido o tamanho ideal: as colônias são grandes o suficiente para vê-las claramente, mas não tão grandes que se fundam ou interfiram no crescimento umas das outras (veja os resultados representativos para quantificação do tamanho ideal). NOTA: As condições ideais de crescimento são dependentes da deformação e devem ser determinadas empiricamente. Para Lactiplantibacillus de Drosophila, o tempo ideal de incubação é de 26 h a 30 h em ágar MRS. Para Acetobacter de Drosophila, o tempo ideal de incubação é de 30 h a 48 h em MRS, dependendo da cepa.</li>
	<li>Após a incubação, conservar as placas a 4 °C, se necessário, até estarem prontas para a contagem.</li>
</ol>4. Quantificação das UFC
<ol><li>Quantifique as UFCs fotografando as placas e, em seguida, contando as colônias usando software automatizado, conforme detalhado abaixo. Se as placas foram armazenadas a 4 °C, primeiro permita que elas atinjam a temperatura ambiente para que não haja condensação nas placas, o que produz brilho.</li>
	<li>Organize as placas em uma sequência lógica e mantenha-as nessa ordem durante a fotografia - isso facilita o nome dos arquivos. Oriente todas as placas de modo que A1 esteja no canto superior esquerdo para todas as placas. Recomenda-se rotular o canto A1 com um ID exclusivo para garantir que não haja confusão nas fotos. Empilhe cada série de diluição por ordem.</li>
	<li>Retire a tampa da placa e coloque a placa no palco com A1 orientado no canto correto. Os desenhos estão incluídos para a caixa de fotos da placa (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2), que é otimizada para fotografar essas placas da bandeja e inclui opções de iluminação e filtro para colônias fluorescentes de imagem.</li>
	<li>Imagine as placas. Use a câmera (consulte Tabela de materiais) com configurações manuais para obter um nível de exposição consistente entre as placas. Uma configuração de longa distância focal é recomendada para minimizar a distorção da perspectiva. Capture a foto usando um obturador remoto para minimizar o desfoque da trepidação da câmera.</li>
	<li>Transfira as imagens para um computador e renomeie-as, incluindo o nome do experimento, o tipo de mídia, o fator de diluição e quaisquer outros detalhes pertinentes. Alguns sistemas operacionais (consulte Tabela de materiais) têm um recurso útil de renomeação em lote no Finder clicando com o botão direito do mouse em uma seleção de arquivos.</li>
</ol>5. Contagem automatizada de colônias usando o pacote Count-On-It (Arquivo Suplementar 3)
<ol><li>Recorte as imagens usando o plug-in Croptacular fornecido (Arquivo de Codificação Suplementar 2) para o ImageJ. Este plugin ajuda a dividir a imagem em uma matriz ordenada de sub-regiões (por exemplo, 8 x 12 para uma placa de 96 poços). As sub-regiões serão contadas individualmente. NOTA: Um plugin separado para contar placas circulares chamado Circus é descrito no Arquivo de Codificação Suplementar 3 Circus_.ijm.<ol><li>Organize as imagens a serem processadas para quantificação em uma pasta. Escolha nomes de arquivos que distingam as placas, pois esses nomes de arquivos se tornam títulos de coluna para cada conjunto de contagens. Dentro desta pasta, faça subpastas chamadas "cropped" e "recibos".</li>
		<li>Inicie o Croptacular, e clique em OK para começar a cortar. NOTA:As configurações padrão são exibidas e geralmente são suficientes. Dependendo da resolução da imagem, da iluminação, do tamanho do ponto, etc., pode ser útil ajustar os parâmetros de base.</li>
		<li>Se a imagem já estiver reta, basta pressionar Espaço. Caso contrário, endireite a imagem desenhando uma linha ao longo de uma borda que deve se tornar horizontal. Redesenhe a linha quantas vezes forem necessárias se a imagem ainda não aparecer endireitada.</li>
		<li>Em seguida, desenhe uma caixa de limite da área para a qual a contagem deve ser feita. Ajuste o tamanho e a proporção até que todas as manchas estejam dentro de suas células. Arraste o cursor para fora da caixa de limite para atualizar a grade. Quando a grade estiver boa, pressione Espaço.</li>
		<li>Certifique-se de que a próxima imagem gire automaticamente para o mesmo ângulo que a primeira; o plugin assume que todas as fotos estão alinhadas da mesma forma. Se isso for preciso, pressione Espaço para continuar. Caso contrário, endireite a imagem como antes. A grade também lembra a mesma posição da imagem anterior; ajuste, se necessário, e pressione Espaço.</li>
	</ol></li>
	<li>Enumere as colônias nas placas usando o plug-in Count-On-It: Gridiron fornecido para ImageJ (Arquivo de Codificação Suplementar 4). Instruções detalhadas para instalar e usar o plugin estão incluídas no Arquivo Suplementar 3.<ol><li>Lançamento Count-On-It > Gridiron. Use as mesmas configurações de grade que com Croptacular. Os usuários podem agrupar em lote uma pasta inteira, analisar uma única imagem ou iniciar a partir da imagem atual.</li>
		<li>Defina o limite com base em um valor de intensidade de pixel superior e inferior. Torne o limiar o mais rigoroso possível enquanto ainda seleciona todas as colônias. Idealmente, haverá algum espaço entre as colônias selecionadas, mas o software é capaz de segmentar as bolhas até certo ponto. Clique em OK na caixa de diálogo "Ação necessária" quando o limite for satisfatório.</li>
		<li>Para inspecionar os resultados, amplie e observe mais de perto as contagens de colônias. Clicar em cancelar abortará o plugin. Clique em OK para continuar.</li>
		<li>Na primeira imagem, certifique-se de que a opção é dada para prosseguir ou retornar ao menu de configuração, por exemplo, para alterar o tamanho mínimo da colônia. Para prosseguir com o processo em lote, clique em OK. Em seguida, selecione uma pasta para manter a tabela de recibos e resultados. Use a pasta "recibos" ou crie uma nova pasta.</li>
		<li>Após a primeira imagem, as próximas imagens terão como padrão o mesmo limite das configurações anteriores. Clique em OK para usar essas configurações ou ajustar as configurações. Se as fotos forem consistentes e a configuração for precisa, clique em OK na caixa de diálogo "Ação necessária". Observação : uma vez que todas as imagens no lote são concluídas, a tabela de resultados salva automaticamente na mesma pasta que os recibos.</li>
		<li>Revise os recibos de contagem que são produzidos pelo software e corrija manualmente quaisquer erros de contagem. O plug-in ImageJ é estatisticamente preciso, mas ocorrem erros. Comprove os recibos para examinar valores atípicos e identificar erros de contagem. O software salva os dados da CFU como um arquivo de .csv na mesma pasta que os recibos.</li>
	</ol></li>
	<li>Analise os dados usando o software preferido pelo usuário.</li>
</ol>

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
<li>Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exclusive+metabolic+niche+enables+strain+engraftment+in+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.</a> Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).</li>
<li>Taur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+domination+and+the+risk+of+bacteremia+in+patients+undergoing+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+in+quantitative+human+gut+microbiome+profiles+and+implications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research.</a> Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).</li>
<li>D'hoe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+culturing%2C+modeling+and+transcriptomics+uncovers+complex+interactions+and+emergent+behavior+in+a+three-species+synthetic+gut+community%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community.</a> eLife. 7, 2892(2018).</li>
<li>Ludington, W. B., Ja, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the gut microbiome.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).</li>
<li>Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+of+diverse+Drosophila+species%3A+Ecological+context+of+a+host-microbe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system.</a> PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).</li>
<li>Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+establishes+a+species-specific+mutualistic+interaction+with+stable+gut-colonizing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).</li>
<li>Adair, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+among-species+variation+in+microbiome+composition+in+drosophilid+flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies.</a> The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).</li>
<li>Koyle, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster+under+axenic+and+gnotobiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).</li>
<li>Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiomes+as+modulators+of+Drosophila+melanogaster+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).</li>
<li>Grenier, T., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+commensal+microbes+shape+the+physiology+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster.</a> Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).</li>
<li>Broderick, N. A., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+microbes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster.</a> Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).</li>
<li>Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+microbiota+abundance+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples.</a> Microbiome. 6 (1), 110(2018).</li>
<li>Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+association+of+a+Drosophila-derived+microbiota+with+its+animal+partner+and+the+nutritional+environment+throughout+a+fly+population%27s+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+homeostasis+by+the+homeobox+gene+caudal+and+commensal-gut+mutualism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila.</a> Science. 319 (5864), 777-782 (2008).</li>
<li>Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+fast+method+for+determining+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple and fast method for determining colony forming units.</a> Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Newell, P. D., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+determine+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+nutrient+allocation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).</li>
<li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Fadrosh, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+dual-indexing+approach+for+multiplexed+16S+rRNA+gene+sequencing+on+the+Illumina+MiSeq+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform.</a> Microbiome. 2 (1), 6(2014).</li>
<li>Vega, N. M., Ludington, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+a+parts+list+to+assembly+instructions+and+an+operating+manual%3A+How+small+host+models+can+re-write+microbiome+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).</li>
<li>Sundarraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+interactions+dampen+pairwise+competition+in+the+zebrafish+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome.</a> mBio. 11 (5), 1-15 (2020).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).</li>
<li>Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+structure+follows+simple+assembly+rules+in+microbial+microcosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms.</a> Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).</li>
<li>Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+plate+method+for+bacterial+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spiral plate method for bacterial determination.</a> Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).</li>
<li>Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single+plate-serial+dilution+spotting+%28SP-SDS%29+with+sample+anchoring+as+an+assured+method+for+bacterial+and+yeast+cfu+enumeration+and+single+colony+isolation+from+diverse+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples.</a> Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).</li>
<li>Nuñez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost+and+open+source+multi-fluorescence+imaging+system+for+teaching+and+research+in+biology+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering.</a> PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).</li>
<li>Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+automatically+count+bacterial+colony+forming+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit.</a> Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila.+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila. A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).</li>
<li>Dodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+niche+regulates+stable+association+of+a+multispecies+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Obadia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+invasion+underlies+natural+gut+microbiome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability.</a> Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).</li>
<li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).</li>
<li>Jaime, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+WAFFL+system+for+treating+and+monitoring+individual+Drosophila+melanogaster+adults%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+internal+and+external+bacterial+load+during+Drosophila+aging+without+life-span+trade-off%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off.</a> Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As técnicas detalhadas aqui apresentadas permitem um aumento de > 100 vezes no número de amostras que podem ser avaliadas em um experimento de contagem de UFC. Esta técnica avança os métodos existentes para experimentos de microbioma em Drosophila 12,35,36 usando o formato de placa de 96 poços para testar moscas individuais. Além disso, aplica um método de spotping mais eficiente 19,31 e um fluxo de trabalho automatizado com uma plataforma de fotografia e contagem de colônias. A importância deste método para a Drosophila é padronizar os experimentos para o formato de placa de 96 poços, o que permite o manuseio simultâneo de um grande número de replicações biológicas com automação para alcançar a quantificação de alto rendimento das UFCs.
A plataforma de 96 poços mostra que o aumento da frequência de transferência e o "clareamento" de bactérias transitórias provocam uma redução significativa tanto na abundância média quanto na variação entre as amostras (Figura 1B,C), demonstrando o rigor desse protocolo aprimorado. Uma limitação das moscas de co-alojamento é a transferência horizontal de bactérias entre moscas. Uma solução proposta é manter as moscas individualmente em um formato de placa de 96 poços, como o Whole Animal Feeding Flat38.
Embora uma redução significativa na carga bacteriana não tenha sido observada quando as moscas foram lavadas em etanol, essas moscas só foram mantidas na presença de bactérias externas por 3 dias. O alojamento por períodos de tempo mais longos poderia permitir que uma maior carga bacteriana se acumulasse39. Portanto, a lavagem em etanol ainda é recomendada.
A transferência de moscas para a placa de 96 poços é a primeira etapa crítica para configurar o fluxo de trabalho (Figura 1A). Uma vez que as moscas são lavadas, elas são distribuídas nos poços, uma de cada vez. Um gráfico de placas é útil nesta fase para observar quais condições estão presentes em cada poço e adicionar quaisquer notas, como "a mosca foi perdida". A homogeneização é outro passo crítico com algumas ressalvas importantes. As bactérias sobrevivem ao processo de homogeneização quando na presença de uma mosca (Figura 1D,E) e, presumivelmente, esse princípio também é verdadeiro quando as bactérias estão dentro do intestino da mosca. No entanto, as bactérias também são mortas quando são homogeneizadas apenas em placas batedoras de contas, demonstrando que a homogeneização pode matar as células bacterianas em determinadas circunstâncias, uma limitação que pode ser importante se estiver homogeneizando intestinos dissecados, por exemplo. Notavelmente, a perda de UFCs ao homogeneizar depende do número de UFCs na amostra, e a perda é mínima quando ~105 UFCs por poço são usadas. Uma maior preservação das UFCs pode ser alcançada interrompendo a homogeneização no meio do caminho e resfriando a placa no gelo.
A homogeneização foi realizada por 5 min neste protocolo com base em experimentos de controle onde um número conhecido de UFCs foi misturado com uma mosca livre de germes, e isso funcionou empiricamente para bactérias moscas. Menos batidas fizeram com que partes maiores de moscas estivessem presentes, o que interfere na pipetagem, enquanto tempos de homogeneização significativamente mais longos, de ~ 10 minutos, tornaram as contagens de UFC mais variáveis. Observou-se que o menor volume e a forma angular dos poços de placa cônica reduzem a eficiência do batimento do talão em comparação com os tubos cilíndricos de 2 mL. Muitas variações nessa abordagem geral são possíveis, incluindo quais cepas bacterianas, quais contas batem no recipiente, quais contas e qual genótipo de mosca são usadas. Casos de usuários individuais precisam usar controles positivos para estabelecer sua abordagem.
O método de plaqueamento pontual foi empregado de forma específica: diluições 1:2 de L. plantarum WF em PBS foram manchadas em placas MRS e incubadas a 30 °C por 2 dias (tempos de incubação mais curtos podem ser implementados para gerar menores tamanhos de colônias). O método requer algum investimento inicial em equipamentos, principalmente o batedor de contas e o pipetador de 96 canais (Figura 2A), que é necessário tanto para a série de diluição quanto para o revestimento pontual. No entanto, opções mais baratas estão disponíveis, incluindo um replicador de placas de 96 poços com pinos ranhurados. A série de diluição é uma etapa crítica que afeta a precisão dos resultados da contagem de UFC. Em termos de modos de falha, é possível entupir as pontas da pipeta com peças de mosca ou contas de vidro e para as pontas da pipeta não selar corretamente no pipetador ou falhar por algum outro motivo. Todos esses problemas resultam em subcontagem dos poços afetados e devem ser monitorados. A mistura adequada em cada etapa da série de diluição também é crucial. Cada diluição deve ser misturada completamente colocando a placa em um agitador de placas ou pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes, o que também serve para enxaguar as pontas. Ao detectar da placa mais diluída para a menos diluída, as pontas podem ser reutilizadas para toda a série de diluição. Com diluições de 1:2, a contagem é precisa em uma faixa de 2-25 colônias, abrangendo uma ordem de magnitude (Figura 2C). Portanto, diluições 1:10 economizam tempo e materiais. Outra variável que pode ser aproveitada é o tempo de incubação, que pode ser ajustado para produzir colônias menores e, assim, aumentar a gama de pontos contáveis, impedindo a fusão de colônias adjacentes.
Uma foto de qualidade da placa é essencial, pois ela se torna a fonte bruta de dados a partir da qual as UFCs são analisadas e podem ser arquivadas indefinidamente. A FluoroBox foi projetada para produzir fotos das placas com intensidade de luz uniforme, o que minimiza o brilho na superfície do ágar. Além disso, o projeto é capaz de fotografar seletivamente colônias fluorescentes usando luzes LED de cor única e filtros de fotos coloridas (Figura 3A). A construção de uma configuração como a FluoroBox, com iluminação controlada e configurações de câmera, pode aumentar muito a reprodutibilidade das imagens CFU, o que é importante para a análise automatizada. As morfologias das colônias, a intensidade da fluorescência e os efeitos do tempo ou da densidade no crescimento da colônia são apenas algumas das propriedades que podem ser analisadas usando as fotografias. A caixa de fotos pode ser construída sem os filtros de cor e luzes de cor única se nenhuma bactéria fluorescente for usada, reduzindo o custo e a complexidade. Diferentes luzes de excitação e filtros de emissão podem ser substituídos pelos recomendados aqui se um fluoróforo diferente for usado por um laboratório. Uma câmera conectada a um tablet via Wi-Fi usando um aplicativo é útil tanto para o recurso de obturador automatizado para evitar tremores quanto para facilitar a transferência de dados. As imagens podem ser transferidas para o tablet e, em seguida, para um laptop usando o software de transferência de arquivos sem fio. As câmeras recomendadas com esses recursos são indicadas na Tabela de Materiais.
Count-On-It é um plug-in escrito no ImageJ. O software automatizado de contagem de UFC segmenta a imagem da placa em uma grade uniforme de 96 poços, conta as colônias em cada célula de grade e agrupa os resultados em uma planilha simples. Como sempre há variação na posição da grade pontual na placa e na foto, o usuário deve conformar manualmente a grade à foto usando o plug-in Croptacular. Isso também ajuda a excluir áreas próximas à borda da placa, que têm brilho. Definir o limite é fundamental para obter a contagem de UFC mais precisa da imagem. Se o limiar for definido muito alto, as colônias se fundirão; se o limiar for fixado demasiado baixo, as colónias serão excluídas. Uma vez que o limite é definido, a macro aplica desfoque gaussiano para suavizar as bordas e reduzir o aliasing, o filtro da bacia hidrográfica divide colônias sobrepostas e as bolhas são contadas usando partículas de análise. 
Às vezes, a densidade de colônias é muito alta em um determinado local. Count-On-It fornece uma maneira de lidar com isso. Para estimar o número de colônias em uma célula de grade com colônias parcialmente fundidas, primeiro a área média de uma bolha circular de toda a placa é tomada como Cavg. Em seguida, a área da bolha A 1 é dividida pela área média de uma bolha circular A1/Cavg. Esse número é arredondado para o inteiro mais próximo, e essa é a estimativa de quantas colônias estão em uma bolha. Essa função é uma das razões pelas quais o limite pode influenciar os resultados da contagem: a área média relativa da colônia versus uma área de blob mesclada será diferente dependendo de como o limite afetou as bolhas mescladas.
Os métodos apresentados apresentam várias limitações. Isso inclui a necessidade de equipamentos para dispensar meios líquidos com precisão a partir de placas de 96 poços. Este equipamento, seja um pipetador de 96 canais ou uma ferramenta de pino replicador ranhurado, pode custar milhares de dólares para obter. Alternativas mais baratas existem, mas são menos precisas. A contagem automatizada via Count-On-It também apresenta algumas limitações. Por exemplo, se dois tipos de colônias em uma população mista fossem delimitados com base apenas no tamanho, a contagem de blobos não seria capaz de atribuir colônias ao tipo correto. Nesse caso, manchas com bolhas precisariam ser eliminadas das contagens. Uma maior diferenciação das colônias com base na morfologia seria uma extensão valiosa do método que não está implementado atualmente. O uso de meios seletivos, incluindo nutrientes específicos da cepa e antibióticos, simplifica a necessidade de análise complexa de imagens.
A manutenção de experimentos com moscas da fruta em placas de 96 poços multiplica o número de amostras e condições que podem ser testadas em um único experimento e pode facilitar telas de alto rendimento em fenótipos de associação Drosophila-bactéria. Imaginamos que este método pode ser estendido usando meios seletivos para diferenciar muitas cepas bacterianas em misturas complexas. O método não se limita ao estudo do microbioma da mosca. A quantificação de UFCs é comum em muitas aplicações da microbiologia, desde a contagem de coliformes na água potável até a identificação de patógenos. O sistema de chapeamento CFU apresentado aqui permite telas de alto rendimento, bem como aquisição, processamento, armazenamento e entrega automatizados de resultados.

A relação entre a microbiota intestinal e seu hospedeiro animal está cada vez mais na vanguarda dos estudos biológicos1, que mostram que a composição da cepa do microbioma é importante para a fisiologia do hospedeiro 2,3,4. O ritmo de descoberta tem sido limitado por fatores de confusão, como alta variação natural interindividual e alta diversidade de bactérias colonizadoras 5,6,7. A mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster, emergiu como um modelo promissor devido ao seu microbioma naturalmente de baixa diversidade, facilidade de manuseio e genética robusta do hospedeiro 8,9,10,11. As moscas podem ser livres de germes e reassociadas a uma microbiota definida12, e tem sido demonstrado que a flora influencia características fisiológicas da mosca13,14. A flora inata consiste em um conjunto limitado de bactérias que são todas cultiváveis, e parentes próximos delas também são endógenos ao intestino dos mamíferos, incluindo lactobacilos, proteobactérias e enterococos15.
Estudar a influência do microbioma nas características do hospedeiro requer a quantificação do microbioma em termos de quais espécies estão presentes e suas abundâncias absolutas16. As formas predominantes de análise do microbioma da mosca são as contagens de unidade formadora de colônias (UFC)17, o sequenciamento do amplificador do gene rRNA 16S9 e a qPCR do gene 16S rRNA18. As contagens de UFC podem ser obtidas sem reagentes caros, e confirmam a viabilidade das células bacterianas19. As técnicas 16S, incluindo a qPCR, têm vantagens na medida em que as identidades taxonômicas dos micróbios podem ser determinadas sem levar em conta suas necessidades de crescimento ou morfologias das colônias20.
No caso em que os experimentos usam moscas com um microbioma definido de bactérias conhecidas (moscas gnotobióticas), as contagens de UFC têm vantagens particulares sobre o sequenciamento21. O sequenciamento é caro, exigindo extração de DNA, preparação de biblioteca baseada em PCR e sequenciamento de alto rendimento para obter abundâncias relativas22. Devido ao alto custo, os métodos de sequenciamento de alto rendimento normalmente precisam ser executados em massa para reduzir o preço por amostra23. Outros métodos, como qPCR, são necessários para obter abundâncias absolutas16. Em contraste, as contagens de UFC são rápidas e baratas e fornecem o número absoluto de células viáveis. Drosophila8 e outros pequenos modelos de microbioma24, incluindo o verme, Caenorhabditis elegans 25,26, e o peixe-zebra larval, Danio rerio, cultivado gnotobioticamente27, têm uma gama limitada de bactérias, que têm características de crescimento conhecidas 28. Nesses casos, particularmente com animais gnotobióticos, a contagem de UFC pode diferenciar todas as espécies de bactérias dentro das comunidades intestinais multiespécies21,27,29. Métodos de contagem de UFC de maior rendimento melhorariam ainda mais a relação custo-benefício e a velocidade de medir a composição do microbioma e poderiam ser aplicados a muitos outros experimentos de microbiologia.
A contagem de UFCs por revestimento por diluição em série de uma suspensão bacteriana em meios de crescimento à base de ágar é um método padrão em todo o campo da microbiologia. As colônias que crescem nas placas são então contadas manualmente. As diluições permitem que o pesquisador selecione uma densidade de colônias que seja contável (por exemplo, ~ 100 UFCs por placa), o que significa que as colônias não estão crescendo umas nas outras e podem ser contadas em um período razoável de tempo. A maioria dos microbiologistas usa essencialmente o mesmo método de contagem de UFC desenvolvido há 140 anos no laboratório de Robert Koch e, para muitas aplicações, esse método ainda é adequado. No entanto, surge um problema quando se procura quantificar um grande número de amostras. Uma única amostra pode exigir o chapeamento de 1 a 10 diluições seriais da amostra para obter UFCs contáveis, de modo que experimentos envolvendo mais de algumas dúzias de amostras se tornam desgastantes. Vários métodos foram desenvolvidos para aumentar a eficiência da enumeração de UFC. O revestimento espiral automatizado elimina a necessidade de diluições em série30, tornando necessária apenas uma placa para a contagem de UFC, mas aumentando o tempo para chapear a amostra. A mancha de diluição em série de placa única (SP-SDS) permite estimativas de UFC a partir de menos placas por amostra31. Esses métodos são uma melhoria em relação ao método tradicional de espalhamento, mas ainda exigem manuseio e revestimento de amostras bacterianas isoladamente e, portanto, não são ideais para alto rendimento. O manuseio de amostras em placas de 96 poços e o revestimento pontual dessas 96 amostras em placas de ágar retangulares melhoram muito o rendimento das amostras19.
Os microbiomas são tipicamente compostos de múltiplas cepas e espécies. Embora as espécies possam muitas vezes ser distinguidas pela morfologia da colônia ou meios de crescimento, a fluorescência pode ser empregada para distinguir ainda mais diferentes tipos de bactérias e suas características de crescimento32. Por exemplo, diferentes genótipos da mesma espécie podem ser marcados com diferentes proteínas fluorescentes codificadas geneticamente. Métodos de imagem de placas que incorporam fluorescência permitem que os pesquisadores aproveitem essas técnicas genéticas em ensaios baseados em UFC32. A incorporação de fluorescência em métodos de contagem de CFU de alto rendimento aumentaria ainda mais sua utilidade.
Contar CFUs manualmente torna-se complicado quando há um grande número de amostras. A contagem automatizada de UFCs pode ser realizada fotografando a placa e processando a imagem usando um software especializado33. Sieuwerts et al. combinaram a eficiência aprimorada de chapeamento de pontos com a contagem automatizada de colônias usando fotografia digital convencional e o software ImageJ19.
Um método de alto rendimento para rastrear os fenótipos de associações específicas de micróbios e hospedeiros ajudaria a estudar a montagem da comunidade do microbioma e o impacto na saúde e aptidão do hospedeiro. Para estudos do microbioma Drosophila, uma plataforma de microbiologia de alto rendimento incorporaria o manuseio de amostras de moscas no formato de placa de 96 poços, lise de mosca sem lise bacteriana, a eficiência do spot-plating, a capacidade de usar fluorescência e distinguir múltiplos fluoróforos, um ambiente de luz controlada para imagens reprodutíveis de placas de UFC e um software confiável de contagem automatizada de colônias. Este artigo descreve um método otimizado para o ensaio de UFCs em moscas gnotobióticas, que é simples, rápido e automatizado. Este protocolo descreve um novo fluxo de trabalho que combina o melhor dos métodos publicados anteriormente e otimizado para explorar o microbioma intestinal em Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Bead batendo e chapeamento de manchas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly frascos</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>rolhas de</td></tr><tr><td>frascos de mosca</td> autoclaváveis <td>Genesee</td><td>59-201</td><td>aplicador de mão autoclavável</td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>seladora térmica</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>Contas de Vidro para Moinho BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBacker, 0.5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 pipetador semi-automatizado</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>Opções mais baratas disponíveis, incluindo ferramenta de pino de 96 poços com fenda da VP Scientific</td></tr><tr><td>TempPlate semi-saia 96 - placa PCR de 96 poços, saia reta, natural</td><td>EUA scientific</td><td>1402-9220</td><td>Deve ser polipropileno para seladora térmica</td></tr><tr><td>Folha de Selagem Térmica</td><td>4titude 4titude</td><td>4ti-0591</td><td>Mantenha a Placa de Bandeja Estéril</td></tr><tr><td>, 128 x 85 mm, Poliestireno, Estéril</td><td>SPL Ciências da Vida</td><td>31001</td><td>Para fazer placas de ágar retangulares</td></tr><tr><td>Construção de Photobox</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac14; "-20 X &frac12; &rdquo; Parafusos (X2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>Para fixar o suporte da câmara. A marca não é importante. Qualquer parafuso de 1/4"-20 1/2" funciona.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac12; &rdquo; Porca do Conector&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC: 799862376780</td><td>porca de capa ou parafuso conector. Isso é para prender os elásticos no suporte da placa. A marca não é importante.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac34; &rdquo; parafusos (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>Para o suporte da placa. A marca não é importante.</td></tr><tr><td>1/8" x &frac12; &rdquo; lavadora</td><td>Amazon</td><td>UPC: 611982484599</td><td>Arruela para as porcas de capa na parte externa da caixa. A marca não é importante. Pinte com spray de preto antes de anexar para misturar com o acrílico.</td></tr><tr><td>18 Gauge Wire - Fio de Alimentação de Dois Condutores - 18 AWG Power Wire - 10ft</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG Porca de Fio Vermelho - WN-R2210 - Quantidade 4</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16in Conector Fêmea de Pressão - 22-18 AWG - Quantidade 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>Conector de Jumper de Fixação Sem Solda de 4" - Luzes de Tira LED de Cor Única de 8mm - <forte>Quantidade 3</forte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de Rabicho de Fixação Sem Solda de 4" - Luzes de Tira LED de Cor Única de 8mm - <forte>Quantidade 3</forte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de gaveta de 6"</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>Qualquer puxador de gaveta deve funcionar.</td></tr><tr><td>6" Corrediças da gaveta</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>Apare as rolhas de borracha de fechamento suave nos controles deslizantes da gaveta.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12; &rdquo; Porcas de Capa (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>Fixa parafusos deslizantes de gaveta na parte externa da caixa. A marca não é importante. O nylon não danifica o acrílico. Pinte com spray de preto antes de anexar para misturar com o acrílico.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12; &rdquo; Parafusos de nylon (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>Para prender corrediças de gaveta. A marca não é importante. Qualquer parafuso ou parafuso de máquina que atenda às especificações funciona. O nylon não danifica o acrílico e permite que você corte o parafuso nivelado com a porca. Pinte com spray de preto antes de anexar para misturar com o acrílico.</td></tr><tr><td>Cola Acrílica</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 Adesivo, Pint e Aplicador de Solda com Agulha</td></tr><tr><td>Abraçadeiras Pretas - Pacote com 10 - 4 Polegadas de Comprimento&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>Suporte em L da câmera</td><td>WLPREOE, Vikerer, sem marca</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>O suporte deve ser "invertido" da configuração pretendida para que a câmera fique "do lado de fora" do L. Alguns suportes vêm em duas peças e permitem essa configuração alternativa, outros não, você precisará de um que possa ser invertido. Também deve ter furos de 1/4" para fixação. WLPREOE, Vikerer, sem marca. Número de identificação serial da Amazon dado como exemplo.</td></tr><tr><td>Câmera da série Canon T para opção de tethering OU</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc..</td><td>1894C002</td><td>As câmeras da série Canon Ti são uma boa opção e podem ser conectadas a um computador. Use com a lente do kit padrão de 18-55 mm. As opções usadas são recomendadas da Canon T5 a T7 (modelo atual).</td></tr><tr><td>Fita LED de Cor Única de Comprimento Personalizado - Fita de Fita da Série Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Azul - 2 metros</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Fita de Fita LED de Cor Única de Comprimento Personalizado - Série Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Verde - 2 metros</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Luz de Tira LED de Cor Única de Comprimento Personalizado - Série Eco Fita de Luz - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Branco Natural 4000K - Branco; 2 metros&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>Furadeira STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>com &frac14; ", 1/8" brocas</td><td>Black & Decker</td><td>&lrm; BDCDD12PK</td><td>A marca não é importante.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinta Spray Preta Fosca,&nbsp; 2X Ultra-Matte</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>Pinte o interior de tudo de preto PLANO. A marca não é importante.</td></tr><tr><td>Paredes Acrílicas Cortadas a Laser</td><td>Grande Serra Azul</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>Use o PDF anexado, exclua todos os recortes na peça superior, exceto o furo desejado para a câmera&nbsp;</td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação de Comutação LED Mean Well - Série LPV 20-100W Fonte de Alimentação LED de Saída Única - 24V DC - 20 Watts&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100 para conexão wi-fi a um telefone, tablet ou computador</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.</td><td>DMC-ZS100K</td><td>As câmeras Panasonic podem ser conectadas sem fio a um computador para transferência de dados e opções de obturador remoto. As opções usadas são boas.</td></tr><tr><td>Placa de Liberação Rápida</td><td>Neewer Alumínio 50mm Placa de Liberação Rápida Grampo QR 3/8 polegadas com 1/4 de polegada</td><td>ASIN: B07417F21D</td><td>Adicione isso ao suporte para que a câmera possa ser facilmente removida para mudar os filtros de cor. Número de identificação serial da Amazon dado como exemplo.</td></tr><tr><td>Elásticos, Tamanhos sortidos</td><td>BAZIC Products</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>Elásticos vão no suporte da placa. A marca não é importante.</td></tr><tr><td>Bases de Montagem de Abraçadeira/Adesivo - Base de 3/4 de polegada - <forte>Quantidade 4</forte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de Balancim Redondo SPST - Sem LED - <forte>Quantidade 3</forte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>Filtro RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 (Vermelho) 72 mm&nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Tiffen 58 (Verde) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>Grátis. Basta citar: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip; Cardona, A. (2012). Fiji: uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas. Métodos da Natureza, 9(7), 676-682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Possui um recurso útil de renomeação em lote no Finder para renomear um grupo de fotos para facilitar a organização e análise no Count-on-it.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>64 bits</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>64 bits</td></tr></tbody></table>

contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de drosophila

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

Os intestinos dos animais são colonizados por micróbios comensais, que afetam o desenvolvimento, a saúde e o comportamento do hospedeiro. A quantificação precisa da colonização é essencial para estudar as complexas interações entre hospedeiro e micróbio, tanto para validar a composição microbiana quanto para estudar seus efeitos. Drosophila melanogaster, que tem uma baixa diversidade microbiana nativa e é econômica para trás com composição microbiana definida, emergiu como um organismo modelo para o estudo do microbioma intestinal. A análise do microbioma de um organismo individual requer a identificação de quais espécies microbianas estão presentes e a quantificação de sua abundância absoluta. Este artigo apresenta um método para a análise de um grande número de microbiomas individuais de moscas. As moscas são preparadas em placas de 96 poços, permitindo o manuseio de um grande número de amostras de uma só vez. A abundância microbiana é quantificada pelo revestimento de até 96 homogeneizados de moscas inteiras em uma única placa de ágar em uma matriz de pontos e, em seguida, contando as unidades formadoras de colônias (UFCs) que crescem em cada ponto. Este sistema de chapeamento é emparelhado com uma plataforma automatizada de quantificação de UFC, que incorpora fotografia das placas, diferenciação de colônias fluorescentes e contagem automatizada das colônias usando um plugin ImageJ. As vantagens são que (i) este método é sensível o suficiente para detectar diferenças entre os tratamentos, (ii) o método de chapeamento pontual é tão preciso quanto os métodos tradicionais de chapeamento e (iii) o processo de contagem automatizado é preciso e mais rápido do que a contagem manual. O fluxo de trabalho apresentado aqui permite a quantificação de CFUs de alto rendimento em um grande número de replicações e pode ser aplicado a outros sistemas de estudo de microbiologia, incluindo modelos in vitro e outros modelos de pequenos animais.

Este método quantifica a abundância microbiana usando um formato de placa de 96 poços para unidades formadoras de colônias de placas (UFCs) e é aplicado ao microbioma Drosophila em amostras inteiras de homogeneização de moscas. As CFUs são contadas com um software automatizado de análise de imagens fornecido aqui.

Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

A contagem de unidades formadoras de colônias, ou UFCs, é uma técnica padrão em microbiologia, mas é lenta e requer muitas placas de ágar. Nossa técnica oferece uma vantagem de cem vezes em relação aos métodos tradicionais de contagem de UFC em ambas as placas de ágar tempo. Aplicamos a metodologia para medir o microbioma intestinal de pequenos modelos animais, particularmente moscas da fruta.Este protocolo é uma maneira simples, rápida e automatizada de quantificar UFCs em moscas gnotobióticas. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho com instrumentação fabricada por DIY para fotografar as CFUs e software personalizado para automatizar a contagem. Este protocolo poderia ser usado em qualquer experimento de microbiologia onde métodos mais eficientes de chapeamento e contagem de UFC poderiam ser úteis.Manusear as moscas de forma eficiente e detectar as placas requer destreza manual, por isso isso deve ser praticado. O uso do software de contagem automatizada requer julgamento sobre o limiar, portanto, os recibos devem ser comparados com contagens manuais para identificar os melhores parâmetros para o seu experimento Demonstrando o procedimento estará Ren Dodge, um pesquisador do meu laboratório que desenvolveu a técnica. Para começar, despeje contas de vidro de 0,5 mícron na bandeja de medição de contas.Espalhe as contas na bandeja para que todos os poços estejam cheios e nivelados. Em seguida, escove o excesso de contas em um tubo cônico. Agora, coloque uma placa de PCR semi-rodapé de cabeça para baixo na bandeja de medição e alinhe-a com os poços, encaixando-a no recuo na bandeja de medição.Em seguida, vire-o rapidamente para transferir as contas. Remova o excesso de contas da superfície da placa de PCR. Certifique-se de que todos os poços contenham contas.Se necessário, use uma colher de pesagem para adicionar contas a um único poço. Em seguida, cubra a placa com papel alumínio e autoclave. Antes de usar a placa, adicione 100 microlitros de PBS a cada poço imediatamente antes de adicionar as moscas usando o pipetter de 96 canais.Para esterilizar à superfície as moscas anestesiadas, transfira moscas do frasco para injetáveis para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando um pequeno funil. Pulverize imediatamente um mililitro de etanol a 70% no tubo, feche o tubo e misture por inversão por 10 segundos. Em seguida, aspirar o etanol com uma pipeta P-1000, evitando aspirar moscas.Após a lavagem final do PBS, feche o tubo e bata-o com força no banco algumas vezes com a tampa virada para baixo para que as moscas entrem na tampa. Depois de abrir o tubo, dispense moscas nos poços usando fórceps e coloque uma mosca em cada poço. Mantenha as moscas anestesiadas, mantendo a placa no gelo durante o carregamento.Remova as contas perdidas perto dos poços, pois elas podem quebrar o selo da folha e causar vazamento. Certifique-se de que o lado opaco da folha de vedação esteja orientado para baixo na placa e o lado brilhante esteja voltado para cima em direção ao selador térmico. Pressione o selador térmico firmemente por cinco segundos e polir com o aplicador manual para fixar a folha.Homogeneize as moscas por cinco minutos. Certifique-se de que as moscas estão completamente homogeneizadas e a solução fica colorida. Para remover o líquido da folha de vedação, gire a placa de contas por 30 segundos em um mini girador de placa a 350 G.Remova a folha enquanto segura a placa para evitar espirrar gotículas de homogeneizado de mosca.Coloque três placas retangulares de crescimento de ágar MRS com as tampas abertas no armário de biossegurança para secar por pelo menos 10 minutos. Prepare duas placas de diluição adicionando 100 microlitros de PBS a cada poço de uma placa estéril de 96 poços usando um pipetter de 96 canais. Carregue um rack de pontas P-20 no pipetter de 96 canais.Efectuar uma diluição 1:10 aspirando 11,1 microlitros de homogeneizado da placa de amostragem. Agora, dispense-o na primeira placa de diluição contendo 100 microlitros de PBS estéril por poço. Manter a placa de diluição no agitador de placas durante 10 segundos a 600 RPM.Misture novamente pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Transferir 11,1 microlitros da primeira placa de diluição para a segunda placa de diluição e repetir as etapas de mistura para quaisquer diluições adicionais. Para detectar placas, carregue dois microlitros de cada poço no pipetter de 96 canais.Abaixe a cabeça do pipetter lentamente sobre a placa, evitando esfaquear o ágar, e certifique-se de que todas as manchas foram dispensadas. Em seguida, verifique se as manchas líquidas mergulham rapidamente no ágar e não correm juntas. Repetir o processo de chapeamento para as restantes placas de diluição, conforme descrito no manuscrito.Uma vez que o líquido tenha sido completamente absorvido pelo ágar, inverta as placas e incube-as até que as colônias tenham atingido o tamanho ideal. Organize as placas logicamente e mantenha-as em uma ordem específica durante a fotografia. Oriente-os para que a A1 fique no canto superior esquerdo para todas as placas.Depois de retirar a tampa da placa, coloque a placa no palco com A1 orientado no canto correto. Imagine as placas. Transfira as imagens para um computador e renomeie-as, incluindo o nome do experimento, o tipo de mídia, o fator de diluição e outros detalhes pertinentes.Organize as imagens a serem processadas para quantificação em uma pasta. Os nomes de arquivo que distinguem as placas se tornam títulos de coluna para cada conjunto de contagens na planilha de saída. Crie subpastas chamadas Recortado e Recibos na pasta.Essas pastas receberão os arquivos de saída. Agora inicie o plugin Croptacular do ImageJ e clique em OK para começar a cortar. Uma caixa de diálogo para escolher a pasta de origem será exibida.Clique em OK. Selecione a pasta de origem e clique em Abrir. Em seguida, clique em OK na caixa de diálogo para escolher o diretório de destino. Selecione a pasta de destino e pressione Abrir.Se a imagem já estiver reta, basta pressionar Espaço. Caso contrário, endireite a imagem desenhando uma linha ao longo de uma borda que deve se tornar horizontal. Redesenhe a linha quantas vezes forem necessárias se a imagem não aparecer reta.Em seguida, desenhe uma caixa de limite para a área de contagem e ajuste seu tamanho e proporção até que todos os pontos estejam dentro de suas células. Arraste o cursor para fora da caixa de limite para atualizar a grade. Quando a grade estiver boa, pressione Espaço.Como o plug-in pressupõe que todas as fotos estejam alinhadas de forma idêntica, certifique-se de que a próxima imagem gire automaticamente para o mesmo ângulo que a primeira. Se isso for preciso, pressione Espaço para continuar. Caso contrário, endireite a imagem como antes.A grade também lembra a mesma posição da imagem anterior. Ajuste se necessário e pressione Espaço. Inicie o Count-On-It e selecione Gridiron.Defina a intensidade da colônia limite com base em um valor de intensidade de pixel superior e um inferior. Torne o limiar o mais rigoroso possível, enquanto ainda seleciona todas as colônias. Clique em OK na caixa de diálogo Ação Necessária quando o limite for satisfatório e clique em OK para continuar.Na primeira imagem, é dada a opção de prosseguir ou retornar ao menu de configuração. Para prosseguir com o processo em lote, clique em OK. Em seguida, selecione uma pasta para manter a tabela de recibos e resultados. Use a pasta Recibos criada anteriormente.Após a primeira imagem, as imagens a seguir terão como padrão o mesmo limite das configurações anteriores. Clique em OK para usar essas configurações ou ajustar as configurações. Revise os recibos de contagem que são produzidos pelo software e corrija manualmente quaisquer erros de contagem.O plugin ImageJ é estatisticamente preciso, mas ocorrem erros. Comprove os recibos para examinar valores atípicos e identificar erros de contagem. O software salva os dados da CFU como um arquivo CSV na mesma pasta que os recibos.Para moscas colonizadas com Lactobacillus plantarum, houve uma diminuição significativa de bactérias para moscas que foram transferidas diariamente para alimentos estéreis, transferidas diariamente, mantidas em alimentos estéreis quatro horas antes da análise ou transferidas diariamente e mantidas em ágar estéril quatro horas antes da análise em comparação com moscas que nunca foram transferidas para alimentos estéreis após a inoculação. Resultados semelhantes foram observados em moscas alimentadas com Acetobacter indonesiensis, onde moscas transferidas, pós-transferidas e limpas mostraram uma redução significativa nas UFCs, mas a lavagem não teve um efeito mensurável, sugerindo que a redução nas UFCs foi devido à depuração de bactérias do intestino e não da cutícula. A contagem de UFC em pontos com 2 a 25 colônias por ponto não apresentou diferença em relação ao método tradicional.As manchas com média de 35 colônias apresentaram UFCs inferiores às placas de espalhamento controle. Essa redução pode ser devido à sobreposição de colônias em pontos densos. Nas fotos de placas, a intensidade da colônia foi 300% maior do que o fundo.As colônias de Lactobacillus plantarum mCherry-positivas apresentaram intensidade vermelha 1.000% maior do que as colônias mCherry-negativas. As colônias positivas para GFP de Acetobacter indonesiensis apresentaram intensidade verde 200% maior do que as colônias negativas para GFP. O plugin Count-On-It para ImageJ automatiza a contagem de CFU a partir das fotos da placa.As colônias são detectadas com precisão, com contagens comparáveis à contagem manual. Os recibos de contagem podem ser usados para identificar erros de contagem. A alteração dos limiares de tamanho e dos comprimentos de onda de fluorescência permite que diferentes morfologias de colônias sejam contadas separadamente.É essencial certificar-se de que a placa está bem selada antes do grânulo. Também é importante projetar controles positivos para calibrar suas medições. Também usamos essa técnica para estudar populações in vitro de bactérias em placas de 96 poços, o que nos permite estudar comunidades mistas de bactérias.Esta técnica permite abordagens de triagem de alto rendimento para medir a colonização intestinal, bem como a variação biológica na colonização.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor...

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

A microbiota de Drosophila afeta o desenvolvimento, a imunidade e a fisiologia do animal. Este vídeo descreve um método para quantificar bactérias de moscas, determinando as unidades formadoras de colônias de preparações de corpo inteiro. O protocolo apresentado demonstra a técnica com moscas, criadas em condições gnotobióticas usando quatro espécies bacterianas.

Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs): Quantificando Bactérias de Corpos de Moscas

Fonte: Dodge, R., et al. Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)Este vídeo demonstra a quantificação de unidades formadoras de colônias (UFCs) de bactérias associadas ao intestino em moscas Drosophila usando uma abordagem de diluição e plaqueamento em série. Amostras homogeneizadas de moscas contendo bactérias intestinais são diluídas em série, plaqueadas em ágar e incubadas para permitir o...

Quantificação de unidades formadoras de colônias de bactérias associadas ao intestino em moscas Drosophila

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para medir a carga bacteriana de E. coli após a injeção de E. coli no tórax de Drosophila melanogaster.

Medindo a carga bacteriana de E. coli em Drosophila melanogaster após infecção por E. coli

Drosophila melanogaster é um excelente organismo modelo para estudar o sistema imunológico inato e as consequências fisiológicas de infecções e doenças. Este protocolo descreve como fornecer infecções bacterianas robustas e quantitativamente repetíveis a D. melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

O ensaio alimentador de microplacos oferece um método econômico de alta produtividade para quantificar o consumo de alimentos líquidos em Drosophila. Um dispositivo impresso em 3D conecta uma microplaca de 96 poços na qual as moscas estão alojadas em uma microplaca de 1536 poços da qual as moscas consomem uma solução de alimentação com um corante rastreador. O declínio do volume da solução é medido espectrofotometricamente.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Caenorhabditis elegans é um modelo poderoso para examinar os determinantes moleculares que conduzem as interações hospedeiro-microbioma. Apresentamos um pipeline de alto rendimento traçando o perfil dos níveis de colonização do microbioma intestinal em um único animal, juntamente com os principais aspectos da fisiologia de C. elegans.

Aplicação da Vermimetria de Fluxo na Quantificação e Análise do Microbioma Intestinal de Caenorhabditis elegans

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

As linhagens celulares são úteis em estudos sobre organismos intracelulares que não podem ser cultivados fora de suas células hospedeiras. Embora as linhagens infectadas com Wolbachia tenham permitido muitas descobertas, a heterogeneidade dentro dessas linhagens pode levar a resultados experimentais variáveis. Apresentamos um protocolo para geração de clones unicelulares e culturas contínuas a partir de células JW18 infectadas com Wolbachia.

Geração de Culturas Monoclonais a partir de Wolbachia-infectada com Drosophila melanogaster JW18

Aprenda a contagem rápida de unidades formadoras de colônias em placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila. Este método automatizado oferece vantagem de cem vezes em tempo comparado a técnicas tradicionais.

Contagem rápida de unidades formadoras de colônias em formato de placa de 96 poços aplicada ao microbioma de Drosophila

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