Name: Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de ligação de aptâmeros anticancerígenos por citometria de fluxo para avaliar seletividade e especificidade em células tumorais. Este método auxilia pesquisadores em imunofenotipagem.

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Os autores reconhecem o financiamento do SEED do Instituto de Saúde Mental e Física e Tradução Clínica (IMPACT), o programa "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" da Universidade de Deakin e a "Bolsa de Estudo do Programa de Treinamento em Pesquisa do Governo Australiano".

<ol><li>Cancer. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20is%20a%20leading%20cause.and%20rectum%20and%20prostate%20cancers</a> (2022).</li>
<li>Liu, J. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+monoclonal+antibody+development+-+Progress%2C+remaining+challenges+and+future+innovations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">The history of monoclonal antibody development - Progress, remaining challenges and future innovations.</a> Annals of Medicine and Surgery. 3 (4), 113-116 (2014).</li>
<li>Nakhjavani, M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+PD-1%2FPD-L1+axis+modulation+for+the+treatment+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Future of PD-1/PD-L1 axis modulation for the treatment of triple-negative breast cancer.</a> Pharmacological Research. 175, 106019(2022).</li>
<li>Bukari, B., Samarasinghe, R. M., Noibanchong, J., Shigdar, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+delivery+of+therapeutics+into+the+brain%3A+the+potential+of+aptamers+for+targeted+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Non-invasive delivery of therapeutics into the brain: the potential of aptamers for targeted delivery.</a> Biomedicines. 8 (5), 120(2020).</li>
<li>Wu, X., Chen, J., Wu, M., Zhao, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+active+targeting+ligands+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Aptamers: active targeting ligands for cancer diagnosis and therapy.</a> Theranostics. 5 (4), 322(2015).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aptamer+functionalized+nanocomposite+used+for+prostate+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">The aptamer functionalized nanocomposite used for prostate cancer diagnosis and therapy.</a> Journal of Nanomaterials. 2022, (2022).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+aptamer-based+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in aptamer-based biomarker discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 571(2021).</li>
<li>Ashrafuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+as+both+drugs+and+drug-carriers%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Aptamers as both drugs and drug-carriers.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Nakhjavani, M., Samarasinghe, R. M., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-negative+breast+cancer+brain+metastasis%3A+an+update+on+druggable+targets%2C+current+clinical+trials%2C+and+future+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Triple-negative breast cancer brain metastasis: an update on druggable targets, current clinical trials, and future treatment options.</a> Drug Discovery Today. , (2022).</li>
<li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bifunctional+aptamer+targeting+the+transferrin+receptor+and+epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+for+the+treatment+of+brain+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of a bifunctional aptamer targeting the transferrin receptor and epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) for the treatment of brain cancer metastases.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (4), 777-784 (2017).</li>
<li>Macdonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+aptamer-doxorubicin+conjugate+crosses+the+blood-brain+barrier+and+selectively+delivers+its+payload+to+EpCAM-positive+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bifunctional aptamer-doxorubicin conjugate crosses the blood-brain barrier and selectively delivers its payload to EpCAM-positive tumor cells.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 30 (2), 117-128 (2020).</li>
<li>Shigdar, S., Agnello, L., Fedele, M., Camorani, S., Cerchia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+cancer+cells+by+cell-SELEX%3A+use+of+aptamers+for+discovery+of+actionable+biomarkers+and+therapeutic+applications+thereof%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Profiling cancer cells by cell-SELEX: use of aptamers for discovery of actionable biomarkers and therapeutic applications thereof.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 28(2021).</li>
<li>Rahimizadeh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-specific+aptamers%3A+recent+advances+and+insight+into+the+selection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Development of cell-specific aptamers: recent advances and insight into the selection procedures.</a> Molecules. 22 (12), 2070(2017).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-SELEX+technology+and+its+application+in+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of cell-SELEX technology and its application in cancer diagnosis and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (12), 2079(2016).</li>
<li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+sensitive+chemical+antibodies+for+diagnosis%3A+detection+of+low+levels+of+EpCAM+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of sensitive chemical antibodies for diagnosis: detection of low levels of EpCAM in breast cancer.</a> PLoS One. 8 (2), 57613(2013).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+EpCAM+%28CD326%29+in+prostate+cancer+metastasis+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of the EpCAM (CD326) in prostate cancer metastasis and progression.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 31 (3), 779-791 (2012).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+is+associated+with+prostate+cancer+metastasis+and+chemo%2Fradioresistance+via+the+PI3K%2FAkt%2FmTOR+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is associated with prostate cancer metastasis and chemo/radioresistance via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (12), 2736-2748 (2013).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcKeague%2C+M+%22Tissue+Culture%22">Tissue Culture</a>. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press. 395-397 (1973).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+aptamer+publication+standards+%28MAPS+guidelines%29+for+de+novo+aptamer+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Aptamers%22%5BJournal%5D)">The minimum aptamer publication standards (MAPS guidelines) for de novo aptamer selection.</a> Aptamers. 6, 10-18 (2022).</li>
<li>Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+assay+to+identify+compounds+that+disrupt+binding+of+fluorescently-labeled+CXC+Chemokine+ligand+12+to+CXC+Chemokine+receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based assay to identify compounds that disrupt binding of fluorescently-labeled CXC Chemokine ligand 12 to CXC Chemokine receptor 4.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57271(2018).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+cell+viability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Frontiers%22%5BJournal%5D)">Guidelines for cell viability assays.</a> Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).</li>
<li>Ruscito, A., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+binding+aptamers%3A+Selection+strategies%2C+characterization%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule binding aptamers: Selection strategies, characterization, and applications.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 14(2016).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analytical+comparison+of+strategies+used+for+small+molecule+aptamer+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation.</a> Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).</li>
<li>Henri, J., Bayat, N., Macdonald, J., Shigdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+using+nucleic+acid+aptamers+in+cell+based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Aptamers%22%5BJournal%5D)">A guide to using nucleic acid aptamers in cell based assays.</a> Aptamers. 23, (2019).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+and+regularity+of+quenching+the+effect+of+bases+on+fluorophores%3A+the+base-quenched+probe+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The mechanism and regularity of quenching the effect of bases on fluorophores: the base-quenched probe method.</a> Analyst. 143 (14), 3292-3301 (2018).</li>
<li>McKeague, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vitro+aptamer+selection+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vitro aptamer selection parameters.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5), 150-161 (2015).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+negative+surface+charges+of+cancer+cells+by+multifunctional+nanoprobes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Targeting negative surface charges of cancer cells by multifunctional nanoprobes.</a> Theranostics. 6 (11), 1887(2016).</li>
<li>Shigdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+targeting+cancer+stem+cell+marker+CD133%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers targeting cancer stem cell marker CD133.</a> Cancer Letters. 330 (1), 84-95 (2013).</li>
<li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li>
<li>Yu, X. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+characterization+of+a+novel+DNA+aptamer%2C+Apt-07S+specific+to+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Selection and characterization of a novel DNA aptamer, Apt-07S specific to hepatocellular carcinoma cells.</a> Drug Design, Development and Therapy. 14, 1535(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O principal desafio com o desenvolvimento de novos aptâmeros é a falta de diretrizes padrão que se aplicam a diferentes etapas desse processo. McKeague et al. demonstraram recentemente alguns dos desafios associados, que levam a apresentações pouco claras de dados em publicações e falha em replicar a pesquisa. Propuseram diretrizes fundamentais necessárias para a consideração na caracterização dos aptâmeros19. Um ensaio de ligação de aptâmeros é uma etapa crítica na triagem e/ou caracterização de ...

O câncer ainda é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo1. Apesar da melhoria significativa no tratamento do câncer nas últimas décadas, o desenvolvimento de medicamentos anticâncer ainda é um tópico altamente debatido. Isso ocorre porque a quimioterapia, como a base do tratamento do câncer, é acompanhada por efeitos colaterais graves que limitam a adesão do paciente ao tratamento. Além disso, a resistência ao tratamento do câncer induzida pela quimioterapia restringiu sua aplicação como a única escolha de intervenção médica. A aplicação de anticorpos monoclonais (mAbs) introduziu uma resposta aprimorada aos tratamentos contra o câncer2. A lógica do uso de mAbs foi melhorar a eficácia dos quimioterápicos e minimizar suas reações adversas. No entanto, a administração de mAbs também se tornou um desafio. Isso não ocorreu apenas por causa das reações imunológicas induzidas por mAb, mas também devido aos custos de produção caros e dependentes de animais e às difíceis condições de armazenamento3. A introdução dos aptâmerosna década de 19904 levantou novas esperanças no tratamento do câncer, já que a aplicação de aptâmeros poderia enfrentar os desafios associados ao mAbs.
Aptamers são sequências curtas de ácidos nucleicos que são produzidas especificamente para um determinado alvo. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é um método comum na produção de aptâmeros. No SELEX, a proteína de interesse é incubada com uma biblioteca de sequências aleatórias de nucleotídeos e, através de uma série de ciclos iterativos, o aptâmero específico para essa proteína é purificado. Os aptâmeros têm seletividade e especificidade de alvo semelhantes aos mAbs e, portanto, o desenvolvimento de medicamentos neste campo mostra aplicações futuras promissoras. Aptamers específicos para biomarcadores de câncer poderiam ser aplicados como medicamentos únicos e ferramentas de diagnóstico de câncer 5,6,7. Devido à sua estrutura nanométrica, esses aptâmeros também poderiam atuar como portadores de fármacos para fornecer agentes citotóxicos especificamente ao tumor8. Isso aumentaria a eficácia da administração direcionada de medicamentos e diminuiria as reações adversas fora do alvo associadas à quimioterapia. Além disso, esses nanomedicamentos têm uma alta penetração tecidual, o que os torna um candidato desejável para a entrega e tratamento de medicamentos de tumores profundos. Os aptâmeros também podem ser projetados para atingir os transportadores expressos na barreira hematoencefálica (BBB) para melhorar a entrega de drogas a tumores cerebrais9. Um bom exemplo de tal aptâmero são os aptâmeros bifuncionais, visando o receptor de transferrina (TfR)10 para melhorar a entrega de drogas em todo o BBB e entregando uma carga útil de drogas citotóxicas às células tumorais11.
Apesar de todas as vantagens dos aptâmeros, o desenvolvimento de medicamentos neste campo ainda não produziu um medicamento anticâncer comercializado e bem-sucedido. Uma razão para isso pode ser a falta de métodos padrão e reprodutíveis que poderiam ser seguidos globalmente por pesquisadores da área. Neste trabalho, um protocolo passo-a-passo de um aptâmero se ligando a uma proteína nativa expressa na superfície celular é demonstrado. Este protocolo é uma etapa pré-requisito na avaliação pré-clínica de aptâmeros anticancerígenos. O ensaio é realizado para mostrar a seletividade e especificidade do aptâmero purificado coletado do SELEX ou uma sequência de aptâmeros publicada para confirmação da seletividade e especificidade. Este ensaio baseado em citometria de fluxo é um ensaio rápido, confiável e sensível que mostra com precisão a seletividade e a especificidade do aptâmero, onde o aptâmero está sendo testado contra proteínas na superfície celular12,13,14. Este método é demonstrado usando a ligação de um aptâmero específico para EpCAM mostrado neste trabalho15. A EpCAM, como glicoproteína transmembrana, desempenha papéis na sinalização, progressão, migração e metástase de células tumorais16,17. Para mostrar a seletividade e especificidade deste aptâmero, foram utilizadas células cancerígenas positivas e negativas para EpCAM. O aptâmero específico de EpCAM previamente desenvolvido, TEPP (5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), e um aptâmero controle negativo, TENN (5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), foram utilizados como aptâmeros ligantes e não ligantes de EpCAM, respectivamente10. A extremidade 3' do TEPP e do TENN foi marcada com um fluoróforo TYE665.
O TEPP é um aptâmero bifuncional que tem como alvo o EpCAM de uma extremidade e o TfR do outro. Isso tornou o TEPP um candidato adequado para a administração de medicamentos para tumores cerebrais EpCAM +. Usando sua extremidade específica da TfR, a TEPP atravessa a barreira hematoencefálica e, usando a extremidade específica da EpCAM, encontra o tumor e entrega sua carga (por exemplo, drogas citotóxicas) ao tumor. O TENN tem um comprimento e uma estrutura 2D semelhantes ao TEPP, mas não tem afinidade com o EpCAM ou TfR e, portanto, é um aptâmero de controle negativo adequado. Usando TEPP e TENN, testar a ligação de um aptâmero à proteína-alvo usando citometria de fluxo é mostrado neste artigo. Este protocolo aplica-se ao desenvolvimento de aptâmeros específicos de células. Também é aplicável a outras análises complementares e de confirmação das sequências de aptâmeros disponíveis na literatura. O protocolo também pode ser usado por aqueles novos no campo do aptâmero que estão procurando usar um aptâmero publicado anteriormente para seus fins de pesquisa e desenvolvimento (P & D). Neste trabalho, são estudadas duas sequências de aptâmeros disponíveis na literatura.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com tampa acoplada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6649</td><td></td></tr><tr><td>15 mL CellStar tampa de rosca azul, tubo inferior cônico</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas de 5 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Fluxo Citômetro Becton Dickinson</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva V9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA), pó liofilizado</td><td>Sigma-AldrichTM</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro de linha brilhante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose Media Powder</td> Life <td>Technologies</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21300025</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo, LLC 10.8.1</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ACS-4500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td> American <td>Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, PS, 96 poços, fundo F (poço de chaminé), Preto</td><td>Greiner Bio One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termociclador</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS) comprimidos</td><td>Life Technologies</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura livre de pirogênio e RNase</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 Frasco de cultura de células</td><td>Cellstar</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TENN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td></tr><tr><td>TEPP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&prime;</td></tr><tr><td>Transferência de RNA (tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8508-5X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um aptamer anticancerígeno

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Um dos principais desafios no desenvolvimento de um aptâmero anticâncer é determinar eficientemente a seletividade e a especificidade do aptâmero desenvolvido para a proteína alvo. Devido às suas várias vantagens sobre os anticorpos monoclonais, o desenvolvimento do aptâmero ganhou enorme popularidade entre os pesquisadores do câncer. A evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial (SELEX) é o método mais comum de desenvolvimento de aptâmeros específicos para proteínas de interesse. Após o SELEX, um ensaio de ligação rápido e eficiente acelera o processo de identificação, confirmando a seletividade e especificidade do aptâmero. 
Este artigo explica um ensaio de ligação baseado em citometria de fluxo passo-a-passo de um aptâmero específico para molécula de adesão celular epitelial (EpCAM). A glicoproteína transmembrana EpCAM é superexpressa na maioria dos carcinomas e desempenha papéis no início, progressão e metástase do câncer. Portanto, é um candidato valioso para a entrega de medicamentos direcionados aos tumores. Para avaliar a seletividade e a especificidade do aptâmero para a EpCAM ligada à membrana, são necessárias células positivas e negativas para EpCAM. Além disso, é necessário um aptâmero EpCAM não vinculativo com um comprimento e estrutura 2-dimensional (2D) semelhantes ao aptâmero de ligação ao EpCAM. O ensaio de ligação inclui diferentes buffers (buffer de bloqueio, buffer de lavagem, buffer de incubação e buffer FACS) e etapas de incubação. 
O aptâmero é incubado com as linhas celulares. Após as etapas de incubação e lavagem, as células serão avaliadas por meio de um ensaio de citometria de fluxo sensível. A análise dos resultados mostra a ligação do aptâmero específico do EpCAM às células positivas para EpCAM e não às células negativas para EpCAM. Em células positivas para EpCAM, isso é descrito como um deslocamento de banda na ligação do aptâmero EpCAM à direita em comparação com o controle do aptâmero não ligante. Em células EpCAM-negativas, as bandas correspondentes de aptâmeros de ligação e não ligação a EpCAM se sobrepõem. Isso demonstra a seletividade e a especificidade do aptamer EpCAM. Enquanto este protocolo é focado no aptâmero EpCAM, o protocolo é aplicável a outros aptâmeros publicados.

Um aspecto importante da descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos é garantir a seletividade e a especificidade do candidato a medicamento. Isso significa que o candidato a medicamento deve ser capaz de discriminar entre diferentes células e afetar apenas a população celular de interesse (seletividade). A seletividade é estudada usando linhagens celulares que diferem em termos de expressão da proteína de interesse. Neste estudo, as linhagens celulares MDA-MB-231 e HEK 293T foram escolhidas como células EpCAM pos...

Um passo necessário no desenvolvimento do aptâmero anticâncer é testar sua ligação ao alvo. Demonstramos um ensaio baseado em citometria de fluxo para estudar essa ligação, enfatizando a importância de incluir um aptâmero de controle negativo e células cancerígenas que são positivas ou negativas para essa proteína em particular.

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Este protocolo ajudará os pesquisadores novos a trabalhar com aptâmeros para poder usá-los em seus projetos e também a entender os pequenos passos individuais que são necessários para completar o protocolo. Os aptâmeros são muito versáteis, e este protocolo demonstra como eles são fáceis e simples em um ensaio de imunofenotipagem. Os aptâmeres podem ser usados para aplicações diagnósticas e terapêuticas.Este protocolo é o primeiro passo dado para confirmar a sua especificidade e sensibilidade. Embora este ensaio em particular demonstre a coloração de um receptor de superfície celular, os aptâmeros podem ser facilmente usados para citometria de fluxo multiparamétrica, fornecendo um alto nível de conhecimento fenotípico. Os aspectos importantes do trabalho com aptâmeros são garantir que eles sejam dobrados corretamente antes do uso, e também que o tampão e as condições de resistência iônica sejam as mesmas de quando foram selecionados.Depois de recolher e descartar o meio no balão, adicionar três mililitros de PBS e espalhá-lo sobre as células. Depois de adicionar um mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA a cada frasco, incubar durante cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius e visualizar o descolamento das células ao microscópio. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo às células e pipete as células para cima e para baixo para fazer uma única suspensão celular.Pipetar as células para um tubo adequado e centrifugar a 200 G durante cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuscite as células em um mililitro de meio fresco e conte as células usando a coloração azul de tripano, diluindo certo volume de suspensão celular com azul de tripano. Distribua aproximadamente 15 microlitros da mistura entre um hemocitômetro e um copo de cobertura para contar as células.Colete o número necessário de células, certificando-se de ter cem mil células por amostra de teste. Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por duas horas para permitir a estabilização da proteína de interesse na membrana celular após o descolamento enzimático. Após as duas horas de incubação, centrifugar as células a 500 G por cinco minutos.Depois de descartar o sobrenadante, ressuscite as células em 500 microlitros de tampão de bloqueio. Incubar as células a quatro graus Celsius durante 30 minutos com mistura intermitente. Durante esta incubação de 30 minutos, realizar o dobramento do aptâmero preparando o dobro das concentrações de aptâmeros descritas no manuscrito.Em seguida, misture e incube os aptâmeros com a máquina termocicladora de acordo com as condições de dobragem necessárias, garantindo a proteção dos aptâmeros da luz. Após os 30 minutos de incubação, centrifugar as células como demonstrado anteriormente e remover o sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem e centrifugar as células novamente.Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda as células em um volume adequado do buffer de ligação. Em seguida, pipete 50 microlitros das células ressuspensas em cada poço de uma placa gelada de 96 poços pretos. Em seguida, pipete 50 microlitros dos aptâmeros em um volume de 50 microlitros de células, misture e incube na escuridão a quatro graus Celsius por 30 minutos.Após centrifugação e remoção do sobrenadante, ressuspeite cuidadosamente o pellet em tampão de lavagem e novamente centrifugar a 500 G por cinco minutos. Em seguida, ressuspeite em 100 microlitros de tampão de lavagem para análise citométrica de fluxo enquanto repete a etapa de lavagem duas vezes. Primeiro, ligue o citômetro de fluxo e, em seguida, o computador.Em seguida, abra o software de análise de citometria de fluxo, faça login no programa e, na guia citômetro, execute a inicialização do fluido. Para criar um novo experimento, na guia experimento, clique em nova pasta e nomeie o experimento de barra de pasta adequadamente. Clique na nova pasta para destacá-la.Em seguida, na guia experimento novamente, clique em novo experimento e nomeie o experimento adequadamente. Para adicionar a primeira amostra de barra, na guia experimento, clique em nova amostra e nomeie a amostra adequadamente. Para adicionar uma amostra de tubo, realce a amostra e, na guia experimento, clique em novo tubo.Em seguida, adicione o número apropriado de tubos e o nome. Para preparar os gráficos necessários, em uma guia de planilha, abra uma nova planilha. Quando a nova janela da planilha aparecer, prepare um gráfico de mancha de pontos de dispersão lateral versus dispersão para frente para selecionar a população de interesse.Prepare um gráfico de manchas de pontos da altura de dispersão para a frente versus a área de dispersão para a frente para selecionar a população de célula única. Em seguida, prepare um histograma do número de eventos contra o fluoróforo de interesse. Certifique-se de que o painel de aquisição para controlar a aquisição de amostras, inspetor e citômetro para ajustar os parâmetros de tensão, bem como a planilha com todos os gráficos, estejam abertos antes de iniciar a citometria de fluxo.Primeiro, execute as células não tratadas. Certifique-se de que a seta que aponta para o tubo está verde. Se esta seta não estiver verde, clique na seta para torná-la verde.Usando a pipeta, transfira cada amostra da placa preta de 96 poços para um tubo de citometria de fluxo. No painel de aquisição, escolha um número apropriado de eventos a serem registrados, altere a taxa de fluxo para baixa e clique em Adquirir Dados. Ajuste a tensão para os parâmetros FSC e SCC, garantindo que a população de células esteja centralizada dentro do gráfico de pontos e que nenhuma célula esteja tocando em nenhum dos eixos do gráfico para evitar a perda das células de interesse.Defina o primeiro portão identificando e selecionando a população de interesse em um gráfico de densidade disperso para frente e para o lado, excluindo os detritos, que constituem a população com o menor sinal de dispersão para a frente. Defina a segunda porta excluindo as populações de células duplas, pois as células duplas afetam consideravelmente os resultados e as conclusões. Aumente a velocidade de aquisição para média ou alta para analisar as amostras mais rapidamente, mas não exceda mais de 200 a 300 eventos por segundo.Em seguida, clique em dados de registro. Depois de ajustar a tensão e o controle e registrar os dados, retire a amostra e clique em Avançar tubo. Insira a próxima amostra e repita os dados de gravação para todas as amostras de controle e teste.Uma vez que todos os dados são coletados, lave o citômetro de fluxo executando três tubos de 50% de água sanitária, FACSRinse e água ultrapura, cada um por cinco minutos a uma alta taxa de fluxo. Em seguida, no menu suspenso do citômetro, clique em Desligar fluídico. Exporte o resultado como arquivos fsc para uma unidade USB para transferir.Analise-os usando o software de análise pressionando o novo botão para criar um novo documento e janela para lidar com a análise e arraste os arquivos de amostra para a nova janela. Clique duas vezes para abrir a amostra não manchada. Para delimitar a população de célula única, escolha a população P1 e clique duas vezes na população P1 para criar um gráfico FSCH versus FSCA.Clique duas vezes nas células isoladas fechadas para criar um histograma de eventos contra o fluorocromo usado. Na janela original, selecione P1 e células individuais e arraste-as para todas as amostras para que todas as amostras agora contenham o mesmo gating. Em seguida, clique no botão do editor de layout para abrir a janela de layouts e arraste duas amostras uma sobre a outra para criar o histograma de sobreposição.Em células MDA-MB-231 positivas para EpCAM, a sobreposição dos histogramas que representam as células tratadas com TEPP e TENN mostra que as células tratadas com TEPP são deslocadas para a direita, em comparação com as células tratadas com TENN, demonstrando que a ligação do aptâmero TEPP ocorre à proteína de interesse. No controle negativo, as células HEK 293T sobrepondo histogramas de TEPP e TENN não refletem qualquer mudança indicando que nas células expressas de EpCAM TEPP é o aptâmero EpCAM ligado ao seu receptor. E, além disso, nenhuma ligação foi observada em células EpCAM negativas, o que confirma a seletividade e especificidade do aptâmero desenvolvido.Certifique-se de que os aptâmeros estejam protegidos da luz, os aptâmeros e as células estejam misturados na placa e as tensões corretas sejam definidas no citômetro de fluxo. Isso é altamente dependente de futuras aplicações para os aptâmeros. Por exemplo, estamos focados na entrega de medicamentos.Então, o próximo passo para nós seria avaliar se os aptâmeros são internalizados usando microscopia fluorescente. Este protocolo demonstrou como é fácil para os aptâmeros substituir anticorpos monoclonais e policlonais em ensaios de imunofenotipagem.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Protocolos SELEX compreendem várias rodadas de seleção, cada um dos que exigem a regeneração de ligantes vinculado, que por sua vez requerem seqüências de primers que flanqueiam as regiões fixo biblioteca aleatória. Essas seqüências de primers fixo pode interferir com o processo de seleção (falsos positivos e negativos). Aqui apresentamos um primer sem protocolo.

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de ligação competitiva baseado em citometria de fluxo para detectar as interações entre o CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) e seu ligante natural marcado com fluorescência CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), na presença de uma pequena molécula direcionada a CXCR4. A incubação de células que expressam CXCR4 com concentrações mais baixas de moléculas pequenas permite a ligação CXCR4-CXCL12 até certo ponto, que diminui progressivamente com um aumento gradual nas...

Ensaio de ligação competitiva para identificar compostos que interrompem as interações receptor-ligante

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.

Avaliando Especificidade de Anticancer Drugs<em&gt; In Vitro</em

Um fluxo de ensaio de ligação celular baseados em citometria é descrito que é usado principalmente como uma ferramenta de triagem para identificar compostos que inibem a ligação de um ligante de chemokine CXC fluorescente etiquetada 12 (CXCL12) para o receptor do chemokine CXC 4 (CXCR4).

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para identificar compostos que interrompem a ligação do ligante de Chemokine fluorescente-etiquetadas CXC 12 a CXC Chemokine Receptor 4

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Este protocolo descreve um método de triagem de alto rendimento baseado em citometria de fluxo para identificar drogas de moléculas pequenas que inibem a ativação de integrinas β2 em neutrófilos humanos.

Uma Técnica de Alto Rendimento Baseada em Citometria de Fluxo para Triagem de Drogas Inibidoras de Integrinas

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de citotoxicidade mediada por células (ADCC) dependente de anticorpos usando um kit de bioensaio ADCC. Este método oferece uma ferramenta valiosa para elucidar o mecanismo ADCC e avaliar o potencial terapêutico dos anticorpos na imunoterapia contra o câncer.

Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

Este protocolo descreve um ensaio de bloqueio para inibidores de PD-1/PD-L1 usando tecnologia de ressonância plasmônica de superfície. Ele emprega uma estratégia de imobilização em duas etapas e um sistema tampão personalizado para medir com precisão as unidades de resposta, facilitando a avaliação das taxas de bloqueio de compostos ou produtos biológicos. Além disso, suporta a identificação de alto rendimento de inibidores de PD-1/PD-L1.

Identificação de inibidores de PD-1/PD-L1 com tecnologia de ressonância plasmônica de superfície

Aprenda a realizar ensaios de ligação de aptâmeros anticancerígenos por citometria de fluxo para avaliar seletividade e especificidade em células tumorais. Este método auxilia pesquisadores em imunofenotipagem.

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

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