Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

Este protocolo ajudará os pesquisadores novos a trabalhar com aptâmeros para poder usá-los em seus projetos e também a entender os pequenos passos individuais que são necessários para completar o protocolo. Os aptâmeros são muito versáteis, e este protocolo demonstra como eles são fáceis e simples em um ensaio de imunofenotipagem. Os aptâmeres podem ser usados para aplicações diagnósticas e terapêuticas.

Este protocolo é o primeiro passo dado para confirmar a sua especificidade e sensibilidade. Embora este ensaio em particular demonstre a coloração de um receptor de superfície celular, os aptâmeros podem ser facilmente usados para citometria de fluxo multiparamétrica, fornecendo um alto nível de conhecimento fenotípico. Os aspectos importantes do trabalho com aptâmeros são garantir que eles sejam dobrados corretamente antes do uso, e também que o tampão e as condições de resistência iônica sejam as mesmas de quando foram selecionados.

Depois de recolher e descartar o meio no balão, adicionar três mililitros de PBS e espalhá-lo sobre as células. Depois de adicionar um mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA a cada frasco, incubar durante cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius e visualizar o descolamento das células ao microscópio. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo às células e pipete as células para cima e para baixo para fazer uma única suspensão celular.

Pipetar as células para um tubo adequado e centrifugar a 200 G durante cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuscite as células em um mililitro de meio fresco e conte as células usando a coloração azul de tripano, diluindo certo volume de suspensão celular com azul de tripano. Distribua aproximadamente 15 microlitros da mistura entre um hemocitômetro e um copo de cobertura para contar as células.

Colete o número necessário de células, certificando-se de ter cem mil células por amostra de teste. Em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por duas horas para permitir a estabilização da proteína de interesse na membrana celular após o descolamento enzimático. Após as duas horas de incubação, centrifugar as células a 500 G por cinco minutos.

Depois de descartar o sobrenadante, ressuscite as células em 500 microlitros de tampão de bloqueio. Incubar as células a quatro graus Celsius durante 30 minutos com mistura intermitente. Durante esta incubação de 30 minutos, realizar o dobramento do aptâmero preparando o dobro das concentrações de aptâmeros descritas no manuscrito.

Em seguida, misture e incube os aptâmeros com a máquina termocicladora de acordo com as condições de dobragem necessárias, garantindo a proteção dos aptâmeros da luz. Após os 30 minutos de incubação, centrifugar as células como demonstrado anteriormente e remover o sobrenadante. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem e centrifugar as células novamente.

Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda as células em um volume adequado do buffer de ligação. Em seguida, pipete 50 microlitros das células ressuspensas em cada poço de uma placa gelada de 96 poços pretos. Em seguida, pipete 50 microlitros dos aptâmeros em um volume de 50 microlitros de células, misture e incube na escuridão a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Após centrifugação e remoção do sobrenadante, ressuspeite cuidadosamente o pellet em tampão de lavagem e novamente centrifugar a 500 G por cinco minutos. Em seguida, ressuspeite em 100 microlitros de tampão de lavagem para análise citométrica de fluxo enquanto repete a etapa de lavagem duas vezes. Primeiro, ligue o citômetro de fluxo e, em seguida, o computador.

Em seguida, abra o software de análise de citometria de fluxo, faça login no programa e, na guia citômetro, execute a inicialização do fluido. Para criar um novo experimento, na guia experimento, clique em nova pasta e nomeie o experimento de barra de pasta adequadamente. Clique na nova pasta para destacá-la.

Em seguida, na guia experimento novamente, clique em novo experimento e nomeie o experimento adequadamente. Para adicionar a primeira amostra de barra, na guia experimento, clique em nova amostra e nomeie a amostra adequadamente. Para adicionar uma amostra de tubo, realce a amostra e, na guia experimento, clique em novo tubo.

Em seguida, adicione o número apropriado de tubos e o nome. Para preparar os gráficos necessários, em uma guia de planilha, abra uma nova planilha. Quando a nova janela da planilha aparecer, prepare um gráfico de mancha de pontos de dispersão lateral versus dispersão para frente para selecionar a população de interesse.

Prepare um gráfico de manchas de pontos da altura de dispersão para a frente versus a área de dispersão para a frente para selecionar a população de célula única. Em seguida, prepare um histograma do número de eventos contra o fluoróforo de interesse. Certifique-se de que o painel de aquisição para controlar a aquisição de amostras, inspetor e citômetro para ajustar os parâmetros de tensão, bem como a planilha com todos os gráficos, estejam abertos antes de iniciar a citometria de fluxo.

Primeiro, execute as células não tratadas. Certifique-se de que a seta que aponta para o tubo está verde. Se esta seta não estiver verde, clique na seta para torná-la verde.

Usando a pipeta, transfira cada amostra da placa preta de 96 poços para um tubo de citometria de fluxo. No painel de aquisição, escolha um número apropriado de eventos a serem registrados, altere a taxa de fluxo para baixa e clique em Adquirir Dados. Ajuste a tensão para os parâmetros FSC e SCC, garantindo que a população de células esteja centralizada dentro do gráfico de pontos e que nenhuma célula esteja tocando em nenhum dos eixos do gráfico para evitar a perda das células de interesse.

Defina o primeiro portão identificando e selecionando a população de interesse em um gráfico de densidade disperso para frente e para o lado, excluindo os detritos, que constituem a população com o menor sinal de dispersão para a frente. Defina a segunda porta excluindo as populações de células duplas, pois as células duplas afetam consideravelmente os resultados e as conclusões. Aumente a velocidade de aquisição para média ou alta para analisar as amostras mais rapidamente, mas não exceda mais de 200 a 300 eventos por segundo.

Em seguida, clique em dados de registro. Depois de ajustar a tensão e o controle e registrar os dados, retire a amostra e clique em Avançar tubo. Insira a próxima amostra e repita os dados de gravação para todas as amostras de controle e teste.

Uma vez que todos os dados são coletados, lave o citômetro de fluxo executando três tubos de 50% de água sanitária, FACSRinse e água ultrapura, cada um por cinco minutos a uma alta taxa de fluxo. Em seguida, no menu suspenso do citômetro, clique em Desligar fluídico. Exporte o resultado como arquivos fsc para uma unidade USB para transferir.

Analise-os usando o software de análise pressionando o novo botão para criar um novo documento e janela para lidar com a análise e arraste os arquivos de amostra para a nova janela. Clique duas vezes para abrir a amostra não manchada. Para delimitar a população de célula única, escolha a população P1 e clique duas vezes na população P1 para criar um gráfico FSCH versus FSCA.

Clique duas vezes nas células isoladas fechadas para criar um histograma de eventos contra o fluorocromo usado. Na janela original, selecione P1 e células individuais e arraste-as para todas as amostras para que todas as amostras agora contenham o mesmo gating. Em seguida, clique no botão do editor de layout para abrir a janela de layouts e arraste duas amostras uma sobre a outra para criar o histograma de sobreposição.

Em células MDA-MB-231 positivas para EpCAM, a sobreposição dos histogramas que representam as células tratadas com TEPP e TENN mostra que as células tratadas com TEPP são deslocadas para a direita, em comparação com as células tratadas com TENN, demonstrando que a ligação do aptâmero TEPP ocorre à proteína de interesse. No controle negativo, as células HEK 293T sobrepondo histogramas de TEPP e TENN não refletem qualquer mudança indicando que nas células expressas de EpCAM TEPP é o aptâmero EpCAM ligado ao seu receptor. E, além disso, nenhuma ligação foi observada em células EpCAM negativas, o que confirma a seletividade e especificidade do aptâmero desenvolvido.

Certifique-se de que os aptâmeros estejam protegidos da luz, os aptâmeros e as células estejam misturados na placa e as tensões corretas sejam definidas no citômetro de fluxo. Isso é altamente dependente de futuras aplicações para os aptâmeros. Por exemplo, estamos focados na entrega de medicamentos.

Então, o próximo passo para nós seria avaliar se os aptâmeros são internalizados usando microscopia fluorescente. Este protocolo demonstrou como é fácil para os aptâmeros substituir anticorpos monoclonais e policlonais em ensaios de imunofenotipagem.