Isolamento Fecal Murino e Transplante de Microbiota

Aqui descrevemos um protocolo para orientar outras pessoas na investigação dos mecanismos de disbiose na doença, desde a coleta de amostras fecais até o uso do método Swiss roll para estudar alterações no intestino. Para começar, borrife o peito e as laterais do camundongo eutanasiado com etanol a 70% e abra cuidadosamente a pele e a cavidade peritoneal para expor o trato gastrointestinal. Isole o ceco e use tesoura cirúrgica estéril para cortá-lo ao meio.

Expor brevemente o ceco, e cortar 0,5 centímetros proximalmente do íleo e 0,5 centímetros distalmente em sua junção com o cólon. Transfira o ceco isolado para uma placa de Petri estéril. Use uma espátula estéril para transferir o conteúdo cecal para tubos estéreis e armazene as alíquotas em um freezer de 80 graus Celsius.

Ressuspender pellets fecais frescos ou previamente congelados em solução salina estéril na proporção de 1 a 20 e vórtice até homogeneizar. Passe o homogeneizado através de um filtro de nylon de poros de 30 micrômetros para remover partículas grandes. Centrifugar a 79G por cinco minutos e coletar o sobrenadante a ser utilizado para transplante.

Gavagem oral de 100 microlitros de chorume por camundongo receptor livre de germes por três dias consecutivos, seguida de gavagem a cada três dias por duas semanas. Coloque suavemente o rato em contenções no suporte do rato pré-aquecido e deixe a cauda do lado de fora. Cuidadosamente adesiva a parte superior sem beliscá-la para não estressar o mouse.

Deixe o mouse descansar no suporte e coloque-o na plataforma da máquina de manguito de cauda por três a cinco minutos, coberto por uma folha para se aclimatar. Coletar pelo menos três rodadas de medidas de pressão sistólica usando pletismografia do manguito de cauda e fazer a média das medidas de todos os rounds para uma pressão sistólica média para cada animal. Coletar assepticamente o conteúdo cecal do camundongo eutanasiado.

Para colher os intestinos e outros tecidos, localize o tecido no camundongo e excime-os com tesouras para examinar o papel da microbiota intestinal na saúde cardiometabólica. No primeiro dia, disseque o intestino do rato do lado anal para o lado do estômago. E coloque a totalidade do trato gastrointestinal isolado em uma placa de Petri contendo PBS.

Puxe suavemente a extremidade proximal da extremidade do estômago e remova a gordura circundante e o tecido conjuntivo com a mão. Isole o intestino delgado e faça um zigue-zague tipo Z a cada comprimento. Em seguida, cortar para obter o duodeno, jejuno e íleo.

Isole o cólon cortando a seção do intestino abaixo do ceco. Corte o duodeno, jejuno, íleo e cólon. Use uma seringa e uma agulha com uma ponta de bola para lavar cuidadosamente e lavar o intestino dentro com PBS sem rasgar o intestino.

Coloque o intestino sobre papel filtro e rotule o papel com o nome da seção e, em seguida, P no canto superior esquerdo para proximal ou D para distal no canto inferior esquerdo. Corte o intestino longitudinalmente com uma tesoura de ponta de bola. Abra o intestino no papel de filtro e lave com mais PBS conforme necessário.

Sanduíche o intestino entre dois papéis de filtro e grampee os papéis de filtro em quatro pontos ou cantos perto do intestino. Mergulhe em solução tampão neutra de formalina a 10% e agite usando um balancim de plataforma a cinco rpm durante a noite à temperatura ambiente. No segundo dia, aqueça a agarose 2% preparada em água destilada com uma barra de agitação em um copo coberto com papel alumínio.

Para recuperar os tecidos, retire o papel de filtro superior e enrole o intestino do lado proximal para que o lado proximal entre primeiro, e role para dentro de modo que o lúmen também esteja dentro da lâmina. Fixe com uma ou duas agulhas de calibre 30, conforme necessário. Aspirar um mililitro de agarose usando pipetas de transferência de graduação descartáveis e despeje a agarose em uma seção de intestino enrolado em uma superfície plana, evitando bolhas de ar nos tecidos.

Depois que a agarose esfriar e solidificar, use uma lâmina de barbear para aparar a agarose extra ao redor da seção de tecido. Finalmente, coloque as seções intestinais no processamento de tecidos ou incorporando e mergulhe-as em etanol 70% a quatro graus Celsius. A estimativa da biodiversidade das espécies no conteúdo cecal obtido de camundongos em dietas normais de sal e dietas ricas em sal é mostrada aqui.

Mudanças na microbiota intestinal em resposta ao alto teor de sal incluíram uma diminuição na biodiversidade bacteriana. A escala multidimensional não métrica mostra que as bactérias de camundongos com sal normal e dieta rica em sal formam agrupamentos separados. O alto teor de sal está associado a um aumento da relação Firmicutes para Bacteroidetes.

O transplante de microbiota fecal de camundongos alimentados com alto teor de sal predispõe camundongos livres de germes à hipertensão induzida por angiotensina II. A transferência de microbiota intestinal disbiótica induzida por alto teor de sal foi associada a um aumento significativo da pressão sistólica em camundongos livres de germes em comparação com camundongos que receberam microbiota intestinal normal de sal. As imagens representativas mostram a coloração de apolipoproteína A-I em ílios obtidos de camundongos que apresentaram hiperlipidemia sem ou com proteinúria.

Este protocolo alinha etapas para alcançar o sucesso da FMT em considerações experimentais importantes para doadores humanos e roedores.