Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

A neuroinflamação é um jogador-chave em vários distúrbios neurológicos. Assim, é de grande interesse pesquisar e desenvolver modelos alternativos de neuroinflamação in vivo para facilitar os estudos do desenvolvimento patológico. A técnica descrita aqui é uma excelente ferramenta para entender melhor as alterações patológicas no cérebro por meio de imagens in vivo e para avaliar de forma rápida e eficiente possíveis medicamentos anti-neuroinflamatórios.

Prepare-se para a injeção puxando capilares de vidro usando um extrator de micropipeta seguindo o protocolo de cinco etapas para puxar tubos capilares de vidro. Abra a ponta da agulha para o tamanho apropriado em um ângulo usando fórceps. Encha a agulha com 0,1 mililitros de óleo mineral para garantir que não haja bolhas.

Remova a tampa de rosca da agulha de aço do aparelho de microinjeção. Alinhe o orifício da agulha de vidro com a agulha de aço e, em seguida, aperte a tampa de rosca. Monte o aparelho de microinjeção da agulha carregada em um micromanipulador.

Ajustar a posição do aparelho de microinjecção de modo a que o micromanipulador possa mover de forma flexível o aparelho ao microscópio. Descarregue um volume apropriado de óleo de parafina necessário para fazer a agulha de aço entrar no tubo de vidro capilar. Solte a solução injetável constituída por PBS ou lipopolissacarídeo sobre uma lâmina de vidro esterilizada com etanol a 70% e ajuste o aparelho de microinjeção de modo a que a ponta seja inserida na gota líquida.

Carregue aproximadamente dois microlitros de solução injetável na agulha. Configure o micromanipulador de modo que a ponta da agulha do aparelho de microinjeção esteja no mesmo campo de visão que as larvas em alta ampliação. Derreta uma solução de 2%agarose em água destilada duplamente utilizando um micro-ondas.

Despeje a agarose derretida em um prato de plástico. Use uma pipeta de transferência de plástico para transportar as larvas anestesiadas para o centro de um prato de plástico revestido de 2% de agarose. Oriente as larvas montadas com o lado do cérebro para cima para o acesso da agulha.

Ajuste a ampliação do microscópio para que a estrutura ventricular cerebral do peixe-zebra seja claramente exibida no campo de visão. Coloque a agulha cuidadosamente acima do tecto cerebral. Limpe a área do cérebro com etanol a 70% e perfure a pele do cérebro do peixe-zebra com a ponta da agulha lentamente usando o micromanipulador.

Pressione o pedal para ejetar um nanolitro de PBS 1X ou diferentes concentrações de lipopolissacarídeo. Transfira as larvas para um meio E3 limpo imediatamente após a injeção. Após 24 horas, coletar as larvas para imagens microscópicas, ensaio comportamental locomotor e determinação de outros indicadores.

Prepare uma solução de agarose com baixo teor de 1,5% de fusão em meio E3 e aqueça-a em um micro-ondas para formar um líquido claro. Use uma pipeta de transferência de plástico limpa para transportar as larvas para uma lâmina de vidro e remova o máximo de água possível. Use uma pipeta de transferência de plástico para adicionar uma gota de agarose de 1,5% de baixo derretimento às larvas.

Use uma agulha de seringa de um mililitro para orientar as larvas. Espere até que a agarose esfrie e solidifique antes de iniciar a imagem. Às 24 horas após a injeção ventricular cerebral do lipopolissacarídeo, prossiga com a determinação dos marcadores de expressão gênica.

Use duas seringas de um mililitro para separar as porções da cabeça das larvas sem as regiões do olho e do saco vitelino. Homogeneizar a porção da cabeça com 200 microlitros de reagente de extração de RNA usando um moedor de tecido a 11.000 rotações por minuto durante cinco segundos e, em seguida, realizar a extração de RNA usando o método de isopropanol de clorofórmio. Seque ao ar o pellet de RNA por cinco a 10 minutos e, em seguida, adicione 30 microlitros de água livre de RNAse para dissolver o pellet de RNA.

Sintetizar cDNA usando transcriptase reversa com primers aleatórios, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, execute PCR em tempo real em um sistema de qPCR usando um kit RT-qPCR comercialmente disponível para determinar a expressão dos genes-alvo. Às 24 horas após a injeção ventricular cerebral do lipopolissacarídeo, transfira as larvas do peixe-zebra para os poços de uma microplaca quadrada de 96 poços individualmente.

Adicione 300 microlitros de meio E3 a cada poço e, em seguida, incube as larvas por quatro horas para se aclimatar à placa de teste. Transfira a microplaca carregada de larvas para a caixa de rastreamento de peixe-zebra. Ligue a fonte de luz e incube as larvas na caixa de teste por 30 minutos para se aclimatar ao ambiente.

Monitore e registre o comportamento do peixe-zebra usando um sistema automatizado de rastreamento de vídeo. Registre 12 sessões de cinco minutos cada para larvas individuais de peixe-zebra e defina a distância total conforme descrito no manuscrito do texto. Após o tratamento por 24 horas, um a cinco miligramas por mililitro de lipopolissacarídeo injeção cerebral ventricular induziu uma perda significativa de neurônios RA no cérebro de TgEtvmat2:GFP zebrafish larval em comparação com os grupos controle e sham.

A linhagem transgênica elavl3:mCherry zebrafish demonstrou mudanças significativas na densidade integrada de fluorescência dos neurônios cerebrais larvais quando injetada com 2,5 a cinco miligramas por mililitro de lipopolissacarídeo, enquanto a injeção de um miligrama por mililitro de lipopolissacarídeo não mostrou efeito. Além disso, cinco miligramas por mililitro de lipopolissacarídeo induziram uma deficiência de locomoção e diminuíram a distância total do movimento do peixe-zebra durante um período de rastreamento de 60 minutos. A produção de óxido nitroso e a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias na cabeça de larvas de peixe-zebra foram aumentadas em 2,5 a cinco miligramas por mililitro de tratamento com lipopolissacarídeo em comparação com a expressão nos grupos controle e simulado.

A injeção de um a cinco miligramas por mililitro de lipopolissacarídeo demonstrou o recrutamento de neutrófilos para o cérebro larval de peixe-zebra, resultando em um aumento significativo no número de neutrófilos na região cerebral do peixe-zebra Tgmpo:eGFP. O tamanho de abertura das agulhas e a quantidade de força de injeção para microinjeção, juntamente com a separação da cabeça dos olhos e do corpo do peixe-zebra, são cruciais para este procedimento.