Name: Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a avaliar a saúde mitocondrial em fibroblastos associados ao câncer isolados de esferoides tumorais pulmonares 3D. Este método permite estudar a ativação de CAFs e disfunção mitocondrial.

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Este trabalho foi apoiado pelo SERB-Women Excellence Award Project, Índia (SB/WEA-02/2017) e pelo SERB-Early Career Research Award Project, Índia (ECR/2017/000892) para a DP. Os autores, LA e SR reconhecem o IIT Ropar e o MHRD por suas bolsas de pesquisa. MK reconhece o ICMR por sua bolsa de pesquisa.

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O presente estudo apresenta o desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares compreendendo células tumorais, população de células estromais (isto é, fibroblastos) e população de células imunes (ou seja, monócitos) usando um método modificado de gota suspensa. Fibroblastos e monócitos/macrófagos estão entre as populações mais significativas que constituem o microambiente tumoral (EMT), e sua presença está frequentemente ligada ao mau prognóstico do paciente16. Quando presentes na EMT, os fib...

Os tumores sólidos são compostos por populações celulares heterogêneas que são guiadas pelo microambiente tumoral (EMT), no entanto, a origem da maioria das células ainda não foi descoberta. Principalmente células estromais e imunes (fibroblastos, células endoteliais, monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T e seus subconjuntos) refletem a heterogeneidade tumoral em câncer de pulmão, mama, renal e outros cânceres sólidos 1,2,3. Compreender a origem de cada subtipo e seu potencial de transdiferenciação é de extrema necessidade para o desenvolvimento de terapias avançadas contra esses tipos de câncer. A análise dessa população celular diversificada em biópsias humanas apresenta-se com diversos desafios devido ao tipo de tumor, localização, estágio, limitação da quantidade de amostra e variabilidades específicas do paciente4. Assim, é necessário um modelo experimental, que não seja apenas confiável, mas também possa simular a condição tumoral in vivo, mostrando-se ideal para o estudo do crosstalk tumor-estroma e seu envolvimento na fisiopatologia da doença.
As culturas tridimensionais (3D) de tumores multicelulares esferoides (MCTS) são um sistema modelo in vitro vantajoso de tumores devido à sua semelhança com contrapartes naturais. O MCTS pode replicar melhor aspectos de tumores sólidos do que os modelos de cultura de células 2D, incluindo sua arquitetura espacial, respostas fisiológicas, liberação de mediadores solúveis, padrões de expressão gênica e mecanismos de resistência a medicamentos. Além disso, uma das principais vantagens do MCTS é que ele pode ser usado para estudar a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral (EMT). O método hanging-drop é a ferramenta mais comumente empregada para desenvolver e analisar o MCTS5. Neste método, as diferentes células com meios são suspensas na forma de gotículas, o que permite o seu crescimento de forma agregada 3D coerente e é de fácil acesso para exame. A técnica é simples; não requer muitas células e elimina a necessidade de um substrato especializado como a agarose para o desenvolvimento esferoide6. Uma vantagem adicional deste método reside na reprodutibilidade de sua técnica. Além disso, esse método também tem sido utilizado para co-cultivar populações de células mistas, como células endoteliais e células tumorais, para simular a angiogênese tumoral precoce7.
Neste estudo, esferoides de tumores pulmonares 3D multicelulares foram preparados com células de adenocarcinoma pulmonar, fibroblastos e monócitos usando o método de gota suspensa que imita o microambiente do tumor pulmonar. Em seguida, a população de fibroblastos associados ao câncer (CAF) foi isolada para investigar a saúde mitocondrial. A ideia principal por trás do desenvolvimento desses esferoides é isolar os CAFs, pois o crosstalk entre as células em esferoides poderia transformar os fibroblastos em um estado CAF ativado semelhante a um miofibroblasto. Em segundo lugar, este estudo também pode descrever como a produção aberrante de ERO e a disfunção mitocondrial impulsionam os fibroblastos normais em direção ao fenótipo CAF mais agressivo. Verificou-se que fibroblastos montados dentro de esferoides tumorais ganharam características miofibroblásticas com aumento da atividade das EROs e indução da expressão gênica metabólica. Este protocolo destaca a importância do microambiente tumoral na ativação da CAF e pode ser um excelente modelo para geração in vitro e estudo das características fenotípicas da CAF.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC anti-humano &alfa;-SMA</td><td>R& Sistemas D</td><td>Cat# IC1420A</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas antifibroblastos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>Linhas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549 células de adenocarcinoma de pulmão</td><td>NCCS</td> Pune-MRC-5 <td></td><td></td></tr><tr><td>fibroblastos de pulmão fetal</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 Monócitos humanos</td><td>NCCS Pune</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Himedia</td><td>Cat# 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dicloroindofenol (DCPIP)</td><td>SRL</td><td>Cat# 55287</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# C3099</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# D1306</td><td></td></tr><tr><td>DCFDA</td><td>Sigma</td><td>Cat# D6883</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11995073</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>Cat# 17892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>SRL</td><td>Cat# 62858</td><td></td></tr><tr><td>EZcoun Lactato Desidrogenase Kit de Ensaio de Células</td><td>HiMedia</td><td>Cat# CCK036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>Cat# </td><td></td>10082147</tr><tr><td>Halt Protease e Coquetel Inibidor de Fosfatase (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>Coração de cavalo Citocromo c</td><td>SRL</td><td>Cat# 81551</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT Reagente vermelho para hipóxia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# H10498</td><td></td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Dye Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# T3168</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>Cat# P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merck</td><td>Cat# M8266</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 69824</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH MB Grade</td><td>SRL</td><td>Cat# 54941</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 85124</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fenazina metossulfato (PMS)</td><td>SRL</td><td>Cat# 55782</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>Cat# P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11875093 Kit de</td><td></td></tr><tr><td>lise de célula única</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4458235</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de sódio</td><td>Merck</td><td>Cat# A7631</td><td></td></tr><tr><td>Cianeto de sódio</td><td>Sigma</td><td>Cat# 205222</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 89904</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3771</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio hexahidratado</td><td>SRL</td><td>Cat# 36313</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>Cat# S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO kit de síntese de cDNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11754-050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>Cat# T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0,25% EDTA</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25200072</td><td></td></tr><tr><td>Universal SYBR Green Supermix</td><td>BIO-RAD</td><td>Cat# 172-5124</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colunas MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de Células Automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL sistema de imagem central</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Número de série F0518-1727-0191</td><td></td></tr><tr><td>Software LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido fluorescente Leica</td><td>s</td><td>DMi8 automatizado S/N 424150)</td><td></td></tr><tr><td>Separador Midi MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-042-302</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da saúde mitocondrial em fibroblastos associados ao câncer isolados de esferoides de tumores pulmonares multicelulares 3d

Assessment of Mitochondrial Health in Cancer-Associated Fibroblasts Isolated from 3D Multicellular Lung Tumor Spheroids

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) estão entre as células estromais mais abundantes presentes no microambiente tumoral, facilitando o crescimento e a progressão do tumor. A complexidade dentro do microambiente tumoral, incluindo secretoma tumoral, inflamação de baixo grau, hipóxia e desequilíbrio redox, promove a interação heterotípica e permite a transformação de fibroblastos residentes inativos para se tornarem CAFs ativos. Os CAFs distinguem-se metabolicamente dos fibroblastos normais (NFs), pois são mais glicoliticamente ativos, produzem níveis mais altos de espécies reativas de oxigênio (ROS) e superexpressam o exportador de lactato MCT-4, levando à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP). Aqui um método foi descrito para analisar a saúde mitocondrial de CAFs ativados isolados dos esferoides tumorais 3D multicelulares compostos por células de adenocarcinoma pulmonar humano (A549), monócitos humanos (THP-1) e células de fibroblastos pulmonares humanos (MRC5). Os esferoides tumorais foram desintegrados em diferentes intervalos de tempo e, por meio da triagem celular ativada por magnetismo, os CAFs foram isolados. O potencial de membrana mitocondrial dos CAFs foi avaliado por meio do corante JC-1, da produção de ROS pela coloração de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) e da atividade enzimática nos CAFs isolados. A análise da saúde mitocondrial de CAFs isolados fornece uma melhor compreensão do efeito Warburg reverso e também pode ser aplicada para estudar as consequências das alterações mitocondriais do CAF, como fluxos metabólicos e os mecanismos regulatórios correspondentes na heterogeneidade do câncer de pulmão. Assim, o presente estudo defende a compreensão das interações tumor-estroma na saúde mitocondrial. Ele forneceria uma plataforma para verificar os candidatos a medicamentos específicos mitocondriais quanto às suas eficácias contra CAFs como terapêuticas potenciais no microambiente tumoral, evitando assim o envolvimento do CAF na progressão do câncer de pulmão.

A Figura 1 mostra o desenvolvimento de esferoides tumorais multicelulares utilizando três populações celulares diferentes - A549 (adenocarcinoma pulmonar), MRC-5 (fibroblastos) e THP-1 (monócitos) - pelo método da queda suspensa, conforme observado no dia 7 e no dia 10 ao microscópio. No 7º dia, os esferoides eram compactos e rígidos, com 260 ± 5,3 μm de diâmetro, e no 10º dia, os esferoides tinham 480 ± 7,5 μm de diâmetro (Figura 1A no painel superior, ...

Esferoides tumorais 3D multicelulares foram preparados com células de adenocarcinoma pulmonar, fibroblastos e monócitos, seguidos pelo isolamento de fibroblastos associados ao câncer (CAFs) desses esferoides. CAFs isolados foram comparados com fibroblastos normais para avaliar a saúde mitocondrial estudando o potencial transmembranar mitocondrial, espécies reativas de oxigênio e atividades enzimáticas.

Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are among the most abundant stromal cells present in the tumor microenvironment, facilitating tumor growth and ...

Este protocolo destaca a importância do microambiente tumoral na ativação dos fibroblastos associados ao câncer ou CAF. Poderia ser um excelente modelo in vitro para estudar características fenotípicas. As principais restrições na biologia do CAF reside na disponibilidade limitada de CAF a partir de amostras de biópsia de tumor primário.Portanto, essa técnica pode ser usada para estudar vários aspectos da biologia do CAF. Este estudo descreve a produção cruzada aberrante e a disfunção mitocondrial associada à ativação da CAF, levando a um prognóstico tumoral desfavorável. A aplicação deste método seria útil para avaliar as interações traumáticas do tumor, particularmente a ativação do CAF e a saúde mitocondrial.A fim de explorar os novos alvos de drogas. Os indivíduos devem ter experiência em procedimento celular antes de realizar esta técnica. A demonstração visual desta técnica permitirá compreender as etapas críticas no isolamento da população CAF dos esferoides tumorais e aplicações a jusante para estudar a biologia CAF.A senhorita Leena Arora, a senhorita Moyna Kalia e a Sra. Soumyajit Roy, assistentes do meu laboratório, realizam os experimentos. Para começar a crescer adenoc

assessment-mitochondrial-health-cancer-associated-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo descreve a técnica para realizar o ensaio de fluxo extracelular em esferoides 3D gerados a partir da co-cultura de células cancerígenas pancreáticas (Patu8902) e fibroblastos pancreáticos ativados (PS1) para medir as duas principais vias produtoras de energia, glicólise e respiração mitocondrial.

Ensaio de Fluxo Extracelular em Esferoides 3D: Um Método para Medir a Atividade Metabólica de Esferoides de Tumores Pancreáticos

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Um novo modelo esferoide tridimensional baseado na interação heteroplípica das células tumorais e fibroblastos estrômios é estabelecido. Aqui, apresentamos cocultura de células tumorais e fibroblastos estrômicos, imagens de lapso de tempo e microscopia confocal para visualizar a formação de esferoides. Este modelo tridimensional oferece uma plataforma pertinente para estudar interações tumor-stroma e testar a terapêutica do câncer.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Modelos in vitro abrangentes que recapitulem fielmente a doença humana relevante estão em falta. O presente estudo apresenta a criação e cultura de spheróides tumorais tridimensionais (3D), uma ferramenta in vitro confiável para estudar a interação tumor-estrommal no carcinoma hepatocelular humano.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

Esses protocolos ajudarão os usuários a sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides derivados de células cancerígenas 3D usando a análise de fluxo extracelular do Seahorse.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.

Geração de esferoides tumorais 3D para estudos de avaliação de fármacos

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Aprenda a avaliar a saúde mitocondrial em fibroblastos associados ao câncer isolados de esferoides tumorais pulmonares 3D. Este método permite estudar a ativação de CAFs e disfunção mitocondrial.

Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação da Saúde Mitocondrial em Fibroblastos Associados ao Câncer Isolados de Esferoides de Tumores Pulmonares Multicelulares 3D

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