Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas
13 de janeiro de 2023
Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.
Nosso protocolo é fácil de usar. Usando esta técnica, qualquer um pode facilmente isolar o componente do sangue. A contaminação pode ser minimizada e os materiais podem ser separados com precisão.
Com a automação e o estabelecimento deste protocolo, os pesquisadores podem facilmente obter substâncias relacionadas ao câncer com alta pureza, o que é útil para vários estudos a jusante. Em particular, espera-se que proporcione vantagens importantes para a investigação do utilizador final. Demonstrando seu procedimento estará Jay Jeong, pesquisador sênior e gerente assistente do Cancer Genomics Research Institute.
Para começar, carregue o cartucho LBx 1 selecionando o tipo de cartucho no painel touchscreen do instrumento. Pressione o botão de seta para alterar o número de amostras. Em seguida, abra a porta do instrumento e insira todos os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho.
Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão Executar na tela do touchpad.
O instrumento fecha as válvulas nos cartuchos, o que leva aproximadamente 30 segundos. Siga a mensagem para abrir a porta. Remova a roda de suporte e remova o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho.
Pipetar um máximo de 10 mililitros de uma amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total. Depois de inserir os cartuchos no instrumento, feche a porta do instrumento e pressione o botão OK.
Os casacos plasmáticos e bufantes são automaticamente separados do sangue total, o que leva aproximadamente 30 minutos. Uma vez que o plasma e o casaco bufante são separados, uma mensagem na tela acompanhada por um som de alarme aparecerá. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão de parada.
Abra a porta. Remova o cartucho e coloque-o sobre a mesa. Recupere três mililitros de plasma da saída de plasma usando uma ponta de pipeta de um mililitro.
Em seguida, recupere três mililitros do buffy coat da saída do buffy coat usando uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, carregue o cartucho LBx 2 selecionando o nome do cartucho no painel touchscreen do instrumento. Pressione o botão de seta para alterar o número de amostras e siga o mesmo procedimento mostrado para que o cartucho LBx 1 insira o cartucho no suporte do cartucho.
Depois de inserir o cartucho e fechar a porta, pressione o botão Executar na tela do touchpad. Siga o procedimento mostrado anteriormente para remover o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho e colocá-lo sobre a mesa. Pipetar a solução de gradiente de densidade utilizando uma pipeta serológica.
Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada do cartucho e injete lentamente a solução. Em seguida, pipete a amostra de sangue total e injete-a lentamente na entrada da amostra. Depois de inserir e fixar o cartucho, feche a porta e pressione o botão OK.
Uma vez que o plasma e o PBMC são automaticamente separados do sangue total, uma mensagem acompanhada por um som de alarme aparecerá. Abra a porta e retire o cartucho. Recupere três mililitros de plasma da saída de plasma usando uma ponta de pipeta de um mililitro e, em seguida, recupere três mililitros do PBMC da saída PBMC.
Da mesma forma, para o cartucho FAST-auto, depois de remover o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho, injete seis mililitros da solução PBS na entrada PBS do cartucho. Em seguida, pipetar três mililitros de sangue total ou buffy coat obtido de LBx 1, ou PBMC amostra obtida de LBx 2, e injetar lentamente a amostra na entrada da amostra do cartucho. Depois de inserir o cartucho e prendê-lo, feche a porta e pressione o botão OK.
Quando o enriquecimento automático das CTCs estiver concluído, pare o alarme. Remova o cartucho e insira o removedor de placa traseira, ou BPR, nos quatro orifícios na frente do cartucho. Pressione a asa azul escura com os polegares de ambas as mãos e, em seguida, pressione o corpo azul claro até que ele clique.
Remova cuidadosamente o corpo do cartucho levantando-o. Muito suavemente, pegue a membrana do filtro pela borda usando um tzezer e coloque a membrana em um tubo de 1,5 mililitro para preparação de ácido nucleico ou em um vidro deslizante para a coloração. Se necessário, recupere o sangue filtrado para a saída de sangue usando uma ponta de pipeta de um mililitro.
Os cfDNAs extraídos foram avaliados por meio do Bioanalyzer, e fitas de tela de cfDNA foram utilizadas em conjunto com uma escada eletrônica. A linha verde foi utilizada para alinhar a escada e a amostra. As marcas triangulares indicam a banda de DNA.
A maioria dos cfDNA tem um comprimento de 166 pares de bases e alguns existem em múltiplos inteiros de comprimento. Normalmente, a concentração de cfDNA mede até o tamanho de 50 a 700 pares de bases. Embora haja uma diferença na quantidade obtida de cada amostra individual, como 8,47 nanogramas por mililitro e 5,2 nanogramas por mililitro, os resultados da extração de cfDNA foram bons tanto para a concentração quanto para a distribuição de tamanho em todos os casos.
Esses resultados indicam que o método LBx 1 separa com precisão o plasma contendo cfDNA. No FAST-auto, a membrana foi removida e corada com anticorpos fluorescentes para detectar CTCs e glóbulos brancos. A membrana corada, colocada em lâminas de vidro, foi observada em microscópio de fluorescência.
Após a coloração da membrana, as células mostram DAPI ou sinais positivos nucleares em azul, enquanto EpCAM e CK ou CTCs positivos são destacados em verde, e CD45 ou leucócitos positivos são destacados em vermelho. Não é difícil remover a membrana. No entanto, é necessário ter cuidado com a perda e contaminação das CTCs.
Sangue total, PBMC e casaco bufante estão todos disponíveis. Em vez disso, você só precisa definir o volume inteiro. Outros líquidos também podem ser usados, embora testes sejam necessários.
Esta técnica pode ser operada diretamente em hospitais e a substância pode ser obtida rapidamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo de fácil utilização para a separação e coleta automatizadas de substâncias a partir de sangue total, incluindo DNA livre de células e células tumorais circulantes. Esta técnica minimiza a contaminação e permite uma separação precisa, facilitando a extração com alta pureza de substâncias relacionadas ao câncer para estudos subsequentes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Processamento automatizado de sangue
- Genômica do câncer
- Extração de substâncias
Contexto
- Importância do isolamento de substâncias relacionadas ao câncer a partir do sangue.
- Dificuldades na minimização da contaminação durante a extração.
- Necessidade de protocolos eficientes na pesquisa sobre câncer.
- Papel da automação no aumento da eficiência da pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de fácil utilização para extração de substâncias.
- Melhorar a pureza dos materiais extraídos.
- Facilitar estudos subsequentes na pesquisa de câncer.
Métodos Utilizados
- Equipamento automatizado para separação.
- Estabelecimento de protocolo para acessibilidade do usuário.
- Minimização da contaminação durante a extração.
- Coleta de DNA livre de células e células tumorais circulantes.
Resultados Principais
- Alta pureza das substâncias extraídas.
- Isolamento eficaz de componentes relacionados ao câncer.
- Demonstração do protocolo por um pesquisador sênior.
- Vantagens potenciais para a pesquisa do usuário final.
Conclusões
- O protocolo automatizado aumenta a eficiência da extração.
- Ele oferece benefícios significativos para a pesquisa sobre câncer.
- A acessibilidade do protocolo pode auxiliar diversos estudos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A separação automatizada de substâncias relacionadas ao câncer a partir de amostras clínicas resolve um gargalo crítico em fluxos de trabalho de biópsia líquida, permitindo a extração com alta pureza e reprodutível de analitos como cfDNA e CTCs. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na descoberta precoce e na pesquisa translacional, minimizando a contaminação e padronizando o preparo das amostras. A flexibilidade da plataforma apoia diversos estudos omicos e de biomarcadores em etapas subsequentes, fortalecendo a tomada de decisões em portfólios em pontos críticos de inflexão.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite o isolamento preciso de cfDNA e CTCs para investigação orientada por hipóteses das vias do câncer.
- Reduz a ambiguidade biológica ao fornecer analitos de alta pureza para validação funcional de alvos.
- Oferece confiança preditiva em estudos de biomarcadores e mecanicistas em estágios iniciais.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Fornece preparação padronizada e reprodutível de amostras para ensaios moleculares e celulares subsequentes.
- Facilita o desenvolvimento de ensaios ao fornecer material de entrada consistente entre lotes e estudos.
- Permite fluxos de trabalho escaláveis de triagem por meio de automação e minimização da variabilidade do operador.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estratégias translacionais de biomarcadores ao apoiar a extração de analitos clinicamente relevantes de amostras de pacientes.
- Mantém a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, garantindo a integridade e comparabilidade das amostras.
- Reduz os riscos nas decisões de avanço ao fornecer dados robustos e com mínima contaminação para equipes multidisciplinares.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma automatizada de separação integra-se na interface da aquisição de amostras e da análise molecular subsequente, conectando fluxos de trabalho de descoberta inicial, identificação de compostos ativos e pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar analitos relevantes para doenças a partir do sangue.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaios e reproduzíveis para plataformas de triagem molecular e celular.
- Análises: Permite a medição quantitativa da concentração de cfDNA e a contagem de CTCs para estudos comparativos.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento de biomarcadores e a continuidade pré-clínica por meio da padronização das entradas de amostras.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma capacidade reutilizável e automatizada, adaptável a múltiplos tipos de amostras e objetivos de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e a validação de alvos ao fornecer analitos de alta pureza com contaminação minimizada.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade, escalabilidade e padronização entre equipes e locais de pesquisa.
- Valor Estratégico: Aprimora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas de biomarcadores e terapêuticos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento técnico em manipulação de amostras e análises moleculares posteriores.
- Necessita de instrumentação compatível e infraestrutura analítica para fluxos de trabalho automatizados.
- Exige padronização entre equipes de protocolos e medidas de controle de qualidade.
- Adaptável a diversos tipos de amostras derivadas de sangue; requer validação para outros fluidos corporais.
- É necessário manuseio cuidadoso para evitar perda ou contaminação de analitos raros, como CTCs.
