Name: Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda a separação automatizada de DNA livre de células e células tumorais circulantes do sangue total. Este protocolo minimiza a contaminação e permite extração de alta pureza para estudos oncológicos posteriores.

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Este manuscrito foi apoiado em parte pelo Fundo de Desenvolvimento de Dispositivos Médicos da Coreia (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) e pelo Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).

Todas as amostras de sangue total foram obtidas de pacientes com câncer de pulmão. A pesquisa e a análise na Clinomics são realizadas pelo Cancer Genomics Research Institute, e a aprovação da pesquisa do IRB pelo governo é liderada pelo Comitê de Revisão Institucional do Asan Medical Center (IRB NO. 2021-0802) com o número do IRB registrado para pesquisa na Clinomics.
1. Preparação da amostra
<ol><li>Colete 9 mL de sangue total em um tubo de coleta de sangue estável em EDTA ou cfDNA.</li>
	<li>Misture bem virando o tubo para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.</li>
	<li>Conservar as amostras à temperatura ambiente (RT; para armazenagem a curto prazo) ou a 4 °C (para armazenagem a longo prazo). Não congele e descongele.</li>
</ol>2. Preparação do dispositivo
<ol><li>Pressione o interruptor de energia para ligar o instrumento. NOTA: Uma tela de carregamento aparece no touchpad e o instrumento é inicializado. Mantenha as mãos afastadas do instrumento durante a inicialização. A tela de seleção do cartucho é exibida após a conclusão da inicialização do instrumento.</li>
	<li>Selecione o modo de exemplo a ser usado. Altere o número de amostras pressionando a seta.</li>
</ol>3. Operação do dispositivo e coleta de amostras
<ol><li>Carregamento do cartucho LBx-1<ol><li>Selecione o tipo de cartucho no painel touchscreen do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.</li>
		<li>Abra a porta do instrumento e insira todos os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Certifique-se de que insere corretamente o cartucho e o suporte do cartucho. Se o cartucho não for inserido corretamente, pode causar danos consideráveis ao instrumento.</li>
		<li>Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.</li>
		<li>Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo.</li>
		<li>Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touchpad. O instrumento fecha as válvulas nos cartuchos, o que leva aproximadamente 30 s.</li>
		<li>Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte e remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho.</li>
		<li>Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a amostra de sangue total. Pipetar um máximo de 10 ml de amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. CUIDADO: Perigos de manusear sangue. Durante todo o procedimento de manuseio de amostras de sangue e reagentes, é importante usar um jaleco de laboratório e luvas de laboratório. A FISPQ fornecida deve ser minuciosamente estudada pelos trabalhadores do laboratório.</li>
		<li>Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total. NOTA Ao usar mais ou igual a 9 mL de amostra de sangue total, nenhuma adição de solução salina tamponada com fosfato (PBS) é necessária. Ao usar menos de 9 mL de amostra de sangue total, adicione PBS para fazer o volume total para 9 mL. Por exemplo, ao usar 7,2 mL de sangue total, adicione 1,8 mL de PBS na entrada da amostra. Uma pipeta sorológica ou uma ponta de pipeta pode ser usada para a injeção de sangue total e PBS. Ao usar menos de 8 mL de amostra de sangue total, o revestimento bufante pode não ser recuperado, mesmo adicionando 1 mL de PBS. Para a preparação do gDNA, use 200 μL de sangue total, que foi separado antes desta etapa.</li>
		<li>Insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK . NOTA: O plasma e o inchaço são separados do sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 30 minutos. CUIDADO Perigo durante a operação. Abrir a porta ou tocar no instrumento durante operações de rotação de alta velocidade pode causar ferimentos graves. Há também um risco de lesão devido à carga assimétrica do rotor. Se ocorrerem vibrações e ruídos incomuns quando o instrumento for iniciado no enriquecimento celular assistido ou no modo especialista, a colocação do cartucho pode ser assimétrica. Pressione imediatamente a tecla liga/desliga para parar e instalar corretamente o cartucho.</li>
		<li>Procure a mensagem na tela acompanhada por um som de alarme, que aparece quando a separação do plasma e do casaco bufante está completa.</li>
		<li>Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP . Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa.</li>
		<li>Recupere 3 mL de plasma da saída plasmática usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Recupere a pelagem bufante de 3 mL da saída da pelagem bufante usando uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregando o cartucho LBx-2<ol><li>Selecione o nome do cartucho no painel touchscreen do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.</li>
		<li>Abra a porta e insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho.</li>
		<li>Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.</li>
		<li>Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Certifique-se de inserir corretamente o cartucho no suporte do cartucho. Se o cartucho não for inserido corretamente, pode causar danos consideráveis ao instrumento.</li>
		<li>Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touchpad. O instrumento fecha as válvulas no cartucho, o que leva aproximadamente 30 s.</li>
		<li>Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte, remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho e colocá-lo sobre a mesa.</li>
		<li>Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a solução de gradiente de densidade e a amostra de sangue total. Verificar o volume da solução de gradiente de densidade e PBS a injetar, dependendo do volume da amostra de sangue total (Tabela Suplementar 1).</li>
		<li>Pipetar a solução de gradiente de densidade utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada do cartucho e injete lentamente a solução de gradiente de densidade.</li>
		<li>Após a injeção da solução de gradiente de densidade, pipetar a amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total. NOTA: Ao usar menos de 9 mL da amostra de sangue total, adicione PBS consultando esta tabela (Tabela Suplementar 1).</li>
		<li>Insira os cartuchos a serem usados em ordem de acordo com o número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .</li>
		<li>O plasma e o PBMC são separados do sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 30 minutos. Procure a mensagem que aparece acompanhada por um som de alarme, quando a separação do plasma e do PBMC estiver completa.</li>
		<li>Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP . Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa.</li>
		<li>Recupere 3 mL de plasma da saída plasmática usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Recupere 3 mL do PBMC da saída do PBMC usando uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregando o cartucho FAST-auto<ol><li>Selecione o cartucho no painel de tela sensível ao toque do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.</li>
		<li>Abra a porta e insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.</li>
		<li>Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo.</li>
		<li>Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touch pad. O instrumento fecha as válvulas no cartucho, o que leva aproximadamente 30 s.</li>
		<li>Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte e remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho.</li>
		<li>Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a solução de PBS e a amostra de sangue total. Pipeta 6 mL de solução de PBS utilizando uma pipeta sorológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada PBS do cartucho e injete lentamente 6 mL da solução PBS.</li>
		<li>Após a injeção da solução de PBS, pipeta 3 mL de sangue total ou amostra de PBMC obtida de LBx-2 utilizando uma pipeta sorológica, que foi previamente enxaguada com 1% de BSA para evitar a aderência do resíduo. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.</li>
		<li>Insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .</li>
		<li>CTCs são enriquecidos a partir de sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 15 min. Procure uma mensagem que apareça acompanhada por um som de alarme quando o enriquecimento das CTCs estiver concluído. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP .</li>
		<li>Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa. Insira o removedor da placa traseira (BPR) nos quatro orifícios na parte frontal do cartucho. Pressione a asa azul escura com os polegares de ambas as mãos e, em seguida, pressione o corpo azul claro até que ele clique.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o corpo do cartucho levantando-o. Pegue muito suavemente a membrana do filtro pela borda usando um tweezer. Certifique-se de usar a borda externa (a parte da borda de 1 mm de largura) da membrana do filtro para apertar e segurar a membrana do filtro.</li>
		<li>Coloque cuidadosamente a membrana filtrante (na qual as CTCs enriquecidas estão residindo) em um tubo de 1,5 mL para preparação de ácido nucleico. Se necessário, recupere o sangue filtrado para a saída de sangue usando uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Manutenção do sistema
<ol><li>Preparação para limpeza e desinfecção do instrumento<ol><li>Limpe todas as superfícies acessíveis do instrumento e dos acessórios uma vez por semana usando etanol e tecido seco, e também imediatamente quando contaminado.</li>
		<li>Limpe a tigela e o eixo do rotor regularmente usando álcool (etanol e isopropanol) ou desinfetantes à base de álcool.</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza e desinfecção do instrumento NOTA: Para obter soluções gerais de problemas e outras observações sobre a máquina, consulte a Tabela Suplementar 2.<ol><li>Desligue o instrumento usando o interruptor de alimentação principal. Desconecte o plugue de alimentação da fonte de alimentação.</li>
		<li>Abra a porta e limpe e desinfete todas as superfícies acessíveis do instrumento, incluindo o cabo de alimentação, usando um pano úmido e os agentes de limpeza recomendados.</li>
		<li>Verifique se há danos no eixo do rotor. Inspecione o instrumento quanto à corrosão e danos.</li>
		<li>Conecte o instrumento à fonte de alimentação somente se ele estiver totalmente seco por dentro e por fora.</li>
	</ol></li>
	<li>Desconecte o plugue de alimentação principal e remova o suporte do fusível. O suporte do fusível está localizado acima da tomada de energia. Substitua o fusível usado por um reservado do recipiente.</li>
</ol>

<ol><li>Babayan, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+liquid+biopsy+approaches+for+early+detection+and+monitoring+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer.</a> Genome Medicine. 10 (1), 21(2018).</li>
<li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).</li>
<li>Bardelli, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%2C+what+we+do+not+know+%28yet%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies, what we do not know (yet).</a> Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).</li>
<li>Mattox, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+liquid+biopsies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Applications of liquid biopsies for cancer.</a> Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).</li>
<li>Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+liquid+biopsies+for+the+early+detection+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36(2017).</li>
<li>Scudellari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myths+that+will+not+die%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myths that will not die.</a> Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).</li>
<li>Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+oncology%3A+origins%2C+optimism%2C+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Precision oncology: origins, optimism, and potential.</a> The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).</li>
<li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective%3A+The+precision-oncology+illusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspective: The precision-oncology illusion.</a> Nature. 537 (7619), 63(2016).</li>
<li>Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+liquid+biopsies+into+the+management+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Integrating liquid biopsies into the management of cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).</li>
<li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-and+late-stage+human+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24(2014).</li>
<li>Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+distribution+of+cell-free+DNA+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Size distribution of cell-free DNA in oncology.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455(2021).</li>
<li>Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+%28CTC%29+detection%3A+clinical+impact+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions.</a> Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).</li>
<li>Loeian, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+using+the+nanotube-CTC-chip%3A+capture+of+invasive+CTCs+with+high+purity+using+preferential+adherence+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients.</a> Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).</li>
<li>Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+affects+the+purity+of+liquid+biopsy-based+tumor+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers.</a> Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+isolation%2C+culture%2C+and+downstream+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+advances%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis.</a> Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).</li>
<li>Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+and+next-generation+sequencing+in+the+service+of+personalized+medicine+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer.</a> Oncotarget. 7 (43), 71013(2016).</li>
<li>Lowes, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+%28CTC%29+and+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+workshop+2016%3A+scientific+opportunities+and+logistics+for+cancer+clinical+trial+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505(2016).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+cell-free+DNA+in+different+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Concentration of cell-free DNA in different tumor types.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).</li>
<li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+as+an+indicator+of+early+and+systemic+recurrence+after+surgical+resection+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).</li>
<li>Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%3A+Potential+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies: Potential and challenges.</a> International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).</li>
<li>Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA%3A+the+role+in+pathophysiology+and+as+a+biomarker+in+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1(2018).</li>
<li>Thierry, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+quantification+of+circulating+DNA+in+mice+with+human+colorectal+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).</li>
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<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell-lung-cancer+patients+using+a+multi-flow+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel.</a> Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8(2019).</li>
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<li>Bailey, P. C., Martin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+CTC+biology+and+clinical+impact+emerging+from+advances+in+capture+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology.</a> Cells. 8 (6), 553(2019).</li>
<li>Ahn, S. M., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+fluid+proteomics%3A+Prospects+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics-Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery.</a> Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este trabalho.

A quantidade e a concentração de cfDNA e CTC dependem do indivíduo, estágio e tipo de câncer. Depende também da condição do paciente 2,4,5,10,20. Em particular, nos estágios iniciais ou pré-cancerosos do câncer, as concentrações de substâncias relacionadas ao câncer são muito baixas, por isso há uma grande possibilidade de que não possa ser detectado. No entan...

A detecção precoce e precisa de várias doenças, incluindo o câncer, é o fator mais importante para o estabelecimento de uma estratégia de tratamento 1,2,3,4. Em particular, a detecção precoce do câncer está intimamente relacionada ao aumento das chances de sobrevida do paciente 5,6,7,8. Recentemente, biópsias líquidas têm estado no centro das atenções para a detecção precoce do câncer. Os tumores sólidos sofrem angiogênese e liberam várias substâncias no sangue. Em particular, DNAs circulantes (ctDNAs), RNAs circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas, como exossomos, e células tumorais circulantes (CTCs) foram encontrados no sangue de pacientes com câncer 2,9. Embora existam diferenças na quantidade dessas substâncias, elas são consistentemente observadas não apenas nos estágios iniciais, mas também nos estágios posteriores 6,10. No entanto, essas diferenças individuais são muito altas; por exemplo, a quantidade de DNA livre de células (cfDNA) contendo ctDNA é inferior a 1.000 ng, e o número de CTCs é inferior a 100 em 10 mL de sangue total de pacientes com câncer11,12,13. Muitos estudos caracterizaram o câncer usando essas substâncias presentes em quantidades menores (ou seja, cfDNA, ctDNA e CTCs). Para obter resultados precisos, é importante separar com precisão pequenas quantidades de substâncias com alta pureza13,14. Os métodos convencionais de centrifugação são comumente usados, mas são difíceis de manusear e têm baixa pureza, dependendo da habilidade do usuário. Desde a descoberta das CTCs, várias técnicas de separação foram desenvolvidas, como centrifugação ou separação de grau de densidade, imunoesferas e métodos microfluídicos. Várias técnicas de contenção foram desenvolvidas desde a descoberta das CTCs. No entanto, essas técnicas são frequentemente limitadas quando é necessário isolar células dos vários cavacos e membranas utilizados para isolá-las15. Além disso, os métodos de marcação exigem equipamentos como o FACS, e há limites para o processo a jusante devido à contaminação por marcação.
Recentemente, o uso de biópsias líquidas aumentou, e vários estudos estão sendo realizados para a detecção precoce do câncer. Embora esse método seja simples, ainda existem dificuldades na análise a jusante, e vários estudos estão tentando superar essas dificuldades16,17. Além disso, muitos locais, incluindo hospitais, exigem métodos automatizados, reprodutíveis e de alta pureza que sejam convenientes de usar. Aqui, desenvolvemos um laboratório em um disco para a separação automatizada de substâncias de amostras de sangue após uma biópsia líquida. Esses dispositivos são baseados no princípio da centrifugação, microfluídica e captura de células do tamanho de poros. Existem três tipos de discos: LBx-1 pode adquirir plasma e pelagem bufante, enquanto LBx-2 pode adquirir plasma e PBMC do sangue total com um volume inferior a 10 mL; O FAST-auto também pode adquirir CTCs usando uma membrana removível do disco. Até quatro de cada disco podem ser usados em uma execução. Acima de tudo, a vantagem deste dispositivo e método é que ele pode obter uma variedade de substâncias derivadas do câncer da mesma amostra usando uma pequena quantidade de sangue. Isso significa que o sangue do paciente só precisa ser retirado uma vez. Além disso, tem a vantagem de excluir erros devido a diferenças no período de amostragem de sangue. Esta plataforma é fácil de usar e fornece resultados precisos para biópsias líquidas e aplicações a jusante. Neste protocolo, o uso do dispositivo e do cartucho é introduzido.

<table><tbody><tr><td>1% BSA (Albumina de Soro Bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 15 mL</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>4150 Sistema TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td>Fita de Tela de DNA Livre de Células (Agilent, 5067-5630), Tampão de Amostra de DNA Livre de Células (Agilent, 5067-5633)</td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de DNA Livre de Células de Alta Eficiência MiniMax Apostle</td><td>Apostle</td><td>A17622-250</td><td>5 mL X 50 versões preparatórias</td></tr><tr><td>BD Tubos de coleta de sangue Vacutainer</td><td>Tubo</td> de coleta de sangue BD <td>367525</td><td>EDTA (10 mL)</td></tr><tr><td>BioViewCCBS</td><td>Clinomics</td><td></td><td>BioView Clinomics-Customized Bioview System. Equipamento de personalização baseado em microscópio Allegro Plus</td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo monoclonal (HI30), PE-Alexa Fluor 610</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD4522</td><td></td></tr><tr><td>FAST Cartucho automático</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M3001</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho LBx-1</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M4101</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho LBx-2</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M4201</td><td></td></tr><tr><td>OPR-2000 instrumento</td><td>Clinomics</td><td>CLX-I2001</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de Vidro</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0101040</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 2 Suporte de Ímã</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Solution</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>solução de gradiente de densidade</td></tr><tr><td>Ponta de Filtro, 10 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-10</td><td>As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Ponta do Filtro, 200 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-200</td><td>As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Ponta do Filtro, 100 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-100</td><td>As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Ponta de Filtro, 1000 &micro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-1000</td><td>As pontas de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a prevenir a contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD326 (EpCAM) FITC</td><td>BioLegend</td><td>324204</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Citoqueratina Humana</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído (35% em peso em H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433284</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Wipers</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41117</td><td></td></tr><tr><td>Luva de látex</td><td>Microflex</td><td>63-754</td><td></td></tr><tr><td>Rack de separação de esferas magnéticas</td><td>V & P Scientific</td><td>VP 772F2M-2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetagem Manual&nbsp; (0,5-10 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetagem Manual&nbsp; (2-20 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3120000038</td><td></td></tr><tr><td>Pipetagem Manual&nbsp; (10-100 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>Pipetagem Manual&nbsp; (20-200 &micro; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Pipetagem Manual&nbsp; (100-1000 &micro; L)</td> Meio de montagem <td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>com DAPI - Aquoso, Fluoroshield</td><td>abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Controle de IgG Humana Normal</td><td>R& D Systems</td><td>1-001-A</td><td></td></tr><tr><td>OLYMPUS BX-UCB</td><td>Olympus</td><td>9217316</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53-9003-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Solução salina tamponada com fosfato)</td><td>Corning</td><td>21-040CVC</td><td></td></tr><tr><td>Auxiliar de pipeta portátil</td><td>Drummond</td><td>4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-1000612</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de coloração StainTray</td><td>Pipeta</td> sorológica estéril Simport <td>M920</td><td></td></tr><tr><td>(10 mL)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; Solução X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Sangue</td><td></td><td></td> Total <td>Armazenado a 4-8 &deg; C coletando em tubo estável de EDTA ou cfDNA : Se o sangue total for insuficiente em 9 mL, adicione PBS (solução salina tamponada com fosfato) o quanto for necessário.</td></tr><tr><td>X-Cite 120Q (Iluminador de Lâmpada de Fluorescência)</td> <td>Excelitas</td><td>010-00157</td><td></td></tr></tbody></table>

separação automática e coleta de substâncias relacionadas ao câncer de amostras clínicas

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Recentemente, biópsias líquidas têm sido usadas para diagnosticar várias doenças, incluindo câncer. Os fluidos corporais contêm muitas substâncias, incluindo células, proteínas e ácidos nucleicos originários de tecidos normais, mas algumas dessas substâncias também se originam da área doente. A investigação e análise dessas substâncias nos fluidos corporais desempenham um papel fundamental no diagnóstico de várias doenças. Portanto, é importante separar com precisão as substâncias necessárias, e várias técnicas são desenvolvidas para serem usadas para esse fim.
Desenvolvemos um tipo de dispositivo e plataforma lab-on-a-disc chamado CD-PRIME. Este dispositivo é automatizado e tem bons resultados para contaminação da amostra e estabilidade da amostra. Além disso, tem vantagens de um bom rendimento de aquisição, um curto tempo de operação e alta reprodutibilidade. Além disso, dependendo do tipo de disco a ser montado, plasma contendo DNA livre de células, células tumorais circulantes, células mononucleares do sangue periférico ou casacos bufantes podem ser separados. Assim, a aquisição de uma variedade de materiais presentes nos fluidos corporais pode ser feita para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo o estudo da ômica.

O objetivo desta técnica é isolar de forma fácil e automática substâncias associadas ao câncer do sangue total. Em particular, qualquer um pode usar esta técnica em todos os campos adequados de pesquisa e análise. A separação simultânea e reprodutível de múltiplas substâncias em uma única amostra de sangue é significativa em biópsias líquidas. Os discos LBx-1 e LBx-2 são usados para isolar plasma e buffy coat ou PBMC do sangue total. A Figura 1 mostra os materiais separados pela aplicação de...

Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.

Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Nosso protocolo é fácil de usar. Usando esta técnica, qualquer um pode facilmente isolar o componente do sangue. A contaminação pode ser minimizada e os materiais podem ser separados com precisão.Com a automação e o estabelecimento deste protocolo, os pesquisadores podem facilmente obter substâncias relacionadas ao câncer com alta pureza, o que é útil para vários estudos a jusante. Em particular, espera-se que proporcione vantagens importantes para a investigação do utilizador final. Demonstrando seu procedimento estará Jay Jeong, pesquisador sênior e gerente assistente do Cancer Genomics Research Institute.Para começar, carregue o cartucho LBx 1 selecionando o tipo de cartucho no painel touchscreen do instrumento. Pressione o botão de seta para alterar o número de amostras. Em seguida, abra a porta do instrumento e insira todos os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho.Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão Executar na tela do touchpad.O instrumento fecha as válvulas nos cartuchos, o que leva aproximadamente 30 segundos. Siga a mensagem para abrir a porta. Remova a roda de suporte e remova o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho.Pipetar um máximo de 10 mililitros de uma amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total. Depois de inserir os cartuchos no instrumento, feche a porta do instrumento e pressione o botão OK.Os casacos plasmáticos e bufantes são automaticamente separados do sangue total, o que leva aproximadamente 30 minutos. Uma vez que o plasma e o casaco bufante são separados, uma mensagem na tela acompanhada por um som de alarme aparecerá. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão de parada.Abra a porta. Remova o cartucho e coloque-o sobre a mesa. Recupere três mililitros de plasma da saída de plasma usando uma ponta de pipeta de um mililitro.Em seguida, recupere três mililitros do buffy coat da saída do buffy coat usando uma ponta de pipeta de um mililitro. Em seguida, carregue o cartucho LBx 2 selecionando o nome do cartucho no painel touchscreen do instrumento. Pressione o botão de seta para alterar o número de amostras e siga o mesmo procedimento mostrado para que o cartucho LBx 1 insira o cartucho no suporte do cartucho.Depois de inserir o cartucho e fechar a porta, pressione o botão Executar na tela do touchpad. Siga o procedimento mostrado anteriormente para remover o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho e colocá-lo sobre a mesa. Pipetar a solução de gradiente de densidade utilizando uma pipeta serológica.Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada do cartucho e injete lentamente a solução. Em seguida, pipete a amostra de sangue total e injete-a lentamente na entrada da amostra. Depois de inserir e fixar o cartucho, feche a porta e pressione o botão OK.Uma vez que o plasma e o PBMC são automaticamente separados do sangue total, uma mensagem acompanhada por um som de alarme aparecerá. Abra a porta e retire o cartucho. Recupere três mililitros de plasma da saída de plasma usando uma ponta de pipeta de um mililitro e, em seguida, recupere três mililitros do PBMC da saída PBMC.Da mesma forma, para o cartucho FAST-auto, depois de remover o cartucho fechado por válvula do suporte do cartucho, injete seis mililitros da solução PBS na entrada PBS do cartucho. Em seguida, pipetar três mililitros de sangue total ou buffy coat obtido de LBx 1, ou PBMC amostra obtida de LBx 2, e injetar lentamente a amostra na entrada da amostra do cartucho. Depois de inserir o cartucho e prendê-lo, feche a porta e pressione o botão OK.Quando o enriquecimento automático das CTCs estiver concluído, pare o alarme. Remova o cartucho e insira o removedor de placa traseira, ou BPR, nos quatro orifícios na frente do cartucho. Pressione a asa azul escura com os polegares de ambas as mãos e, em seguida, pressione o corpo azul claro até que ele clique.Remova cuidadosamente o corpo do cartucho levantando-o. Muito suavemente, pegue a membrana do filtro pela borda usando um tzezer e coloque a membrana em um tubo de 1,5 mililitro para preparação de ácido nucleico ou em um vidro deslizante para a coloração. Se necessário, recupere o sangue filtrado para a saída de sangue usando uma ponta de pipeta de um mililitro.Os cfDNAs extraídos foram avaliados por meio do Bioanalyzer, e fitas de tela de cfDNA foram utilizadas em conjunto com uma escada eletrônica. A linha verde foi utilizada para alinhar a escada e a amostra. As marcas triangulares indicam a banda de DNA.A maioria dos cfDNA tem um comprimento de 166 pares de bases e alguns existem em múltiplos inteiros de comprimento. Normalmente, a concentração de cfDNA mede até o tamanho de 50 a 700 pares de bases. Embora haja uma diferença na quantidade obtida de cada amostra individual, como 8,47 nanogramas por mililitro e 5,2 nanogramas por mililitro, os resultados da extração de cfDNA foram bons tanto para a concentração quanto para a distribuição de tamanho em todos os casos.Esses resultados indicam que o método LBx 1 separa com precisão o plasma contendo cfDNA. No FAST-auto, a membrana foi removida e corada com anticorpos fluorescentes para detectar CTCs e glóbulos brancos. A membrana corada, colocada em lâminas de vidro, foi observada em microscópio de fluorescência.Após a coloração da membrana, as células mostram DAPI ou sinais positivos nucleares em azul, enquanto EpCAM e CK ou CTCs positivos são destacados em verde, e CD45 ou leucócitos positivos são destacados em vermelho. Não é difícil remover a membrana. No entanto, é necessário ter cuidado com a perda e contaminação das CTCs.Sangue total, PBMC e casaco bufante estão todos disponíveis. Em vez disso, você só precisa definir o volume inteiro. Outros líquidos também podem ser usados, embora testes sejam necessários.Esta técnica pode ser operada diretamente em hospitais e a substância pode ser obtida rapidamente.

automatic-separation-collection-cancer-related-substances-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Fluxo de Trabalho Padronizado SDS-PAGE para Perfil Personalizado de Corona de Proteínas na Detecção Precoce de Câncer

Aprenda a separação automatizada de DNA livre de células e células tumorais circulantes do sangue total. Este protocolo minimiza a contaminação e permite extração de alta pureza para estudos oncológicos posteriores.

Separação Automática e Coleta de Substâncias Relacionadas ao Câncer de Amostras Clínicas

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