Name: Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a amplificação do sinal de tiramida para detecção sensível de RIPK3 e MLKL fosforilados em células HT-29 humanas após infecção por HSV-1. Este método melhora a visualização imunofluorescente da necroptose induzida por ZBP1.

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Gostaríamos de agradecer ao VIB Bioimaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos. J.N. é apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação de Investigação Flandres (FWO). A investigação no grupo J.M. foi apoiada por uma bolsa Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), uma bolsa de investigação júnior (G031022N) da Fundação de Investigação da Flandres (FWO), uma bolsa de prova de conceito para jovens investigadores do CRIG e pela Universidade de Ghent. A investigação no grupo P.V. foi apoiada por EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), consórcios CRIG e GIGG e VIB.

1. Preparação de tiramida biotinilada
<ol><li>Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para fazer uma solução-mãe de 10 mM, dissolver 3,6 mg de biotina-tiramida em 1 mL de DMSO. Conservar o produto dissolvido em alíquotas a -20 °C para preservar a qualidade.</li>
</ol>2. Manutenção das células HT-29 em cultura
NOTA: Os HT-29 que expressam ZBP1 foram gerados por transdução com um lentivetor27 que codifica ZBP1 humano.
<ol><li>Manter as células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy suplementadas com L-glutamina, sódio-piruvato e 10% de soro fetal bovino (a partir de agora referido como meio completo) e manter em uma incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Idealmente, use células de um número de passagem baixo (menos de 10). Deixe as células se recuperarem por pelo menos 5 dias após o ciclo de descongelamento antes do início do experimento.</li>
	<li>Para separar as células do balão de cultura, retirar o meio e lavar as células com 5 ml de PBS (pré-aquecido a 37 °C). Em seguida, adicionar a quantidade adequada de tripsina/EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA a 0,032%, respetivamente, pré-aquecida a 37 °C) às células (2 ml para um balão T75, 3 ml para um balão T175).</li>
	<li>Incubar as células com tripsina/EDTA até 10 min numa incubadora a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Seguidamente, toque no balão e verifique visualmente se as células se desprenderam do balão utilizando um microscópio com uma ampliação objetiva de 4x-20x.</li>
	<li>Se as células não estiverem totalmente separadas, incubar durante mais 5 minutos a 37 °C. Quando as células estiverem descoladas, interromper a reacção enzimática adicionando 6 ml de meio completo ao balão.</li>
	<li>Reúna a suspensão celular em um tubo de 15 mL. Conte as células usando uma mancha azul de tripano para avaliar a viabilidade; recomenda-se uma diluição de 1:5. Só prossiga com o experimento se a viabilidade das células exceder 90%.</li>
</ol>3. Iniciando o experimento, semeadura e estimulação das células
<ol><li>Semear 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 em meio completo em uma placa de poço de área de superfície de 1 cm² que permite microscopia de alta qualidade. Use um volume final de 200 μL por poço.</li>
	<li>Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5% de dióxido de carbono. Leve em consideração que alguns poços extras precisam ser semeados para controles de coloração, o que é explicado com mais detalhes na etapa 5.6.</li>
	<li>Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, adicione um estímulo indutor de necroptose às células. Aqui, as células foram infectadas com HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicidade de infecção [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placas (pfu) divididas pelo número de células; o pfu foi quantificado usando um ensaio de placa em células Vero) por 6 h, 8 h ou 10 h.</li>
	<li>Como controle positivo para indução de necroptose, estimular as células por 4 h com um coquetel indutor de necroptose contendo 30 ng/mL de TNF, 20 μM do inibidor da pan-caspase zVAD-fmk e 5 μM do mimético SMAC BV6.</li>
	<li>Como controle negativo para a coloração p-RIPK3 (S227), inclua GSK'840 (1 μM) para inibir a atividade da quinase RIPK3 e prevenir a autofosforilação da S227. Idealmente, adicione o inibidor em uma condição não tratada e após a estimulação da necroptose. O inibidor pode ser adicionado simultaneamente com a infecção viral.</li>
	<li>Preparar as injeções em meio completo, pré-aquecidas a 37 °C. Use um volume final de 200 μL por poço para todas as estimulações.</li>
</ol>4. Fixação das células
<ol><li>Retire o meio e lave as células com 200 μL de 1x PBS. Em seguida, adicione 150 μL de PFA a 4% (já equilibrado à temperatura ambiente) às células e incube à temperatura ambiente por 30 min. Observação : se você estiver usando células que se desprendem facilmente, a fixação das células pode ser otimizada da seguinte maneira. Remova 100 μL de meio do poço, de modo que um volume de 100 μL permaneça na placa. Adicione 100 μL de 4% de PFA às células. Incubar as células durante 5 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, retire o meio/fixador dos poços e substitua por 150 μL de PFA a 4%. Incubar as células por mais 20 minutos à temperatura ambiente para garantir a fixação completa das células.</li>
	<li>Após a fixação, retire o PFA a 4% e lave as células 3x com 200 μL de PBS 1x. As amostras podem ser armazenadas em excesso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante a noite até processamento posterior.</li>
</ol>5. Permeabilização e coloração primária
<ol><li>Remova o PBS e adicione 100 μL de tampão de permeabilização (0,5% Triton X-100 em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Retirar o tampão de permeabilização e, posteriormente, lavar os poços com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem por 5 min à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado (20-30 movimentos de balanço por minuto).</li>
	<li>Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos primários, adicionar 100 μL de meio bloqueador e incubar à temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, esta etapa de bloqueio pode ser substituída por bloqueio com 3% de BSA, 0,1% de Triton-X-100 em PBS por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.</li>
	<li>Depois de remover o tampão de lavagem, adicionar os anticorpos primários à câmara de imagem e incubar durante a noite a 4 °C. Use um volume final de 100 μL para cobrir o poço. Durante a incubação durante a noite a 4 °C, não coloque a câmara de imagem num agitador de laboratório inclinado. NOTA: Anti p-MLKL (S358; diluição: 1:200) e anti-p-RIPK3 (S227; diluição: 1:200) compartilham coelho como espécie hospedeira e, portanto, não devem ser combinados em um poço. Para monitorar a infecção viral, combine um anticorpo primário contra uma proteína viral de escolha com p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227). Aqui, as células foram infectadas com infecção por HSV-1 seguida de coloração ICP0 (diluição: 1:50, espécie hospedeira: camundongo).</li>
	<li>Leve em consideração os controles de coloração necessários neste momento. Sempre inclua uma condição sem anticorpos primários para visualizar o contexto potencial da etapa de amplificação da TSA para definir o limiar de mascaramento (consulte a etapa 9). NOTA: No caso de um protocolo de cocoloração (por exemplo, combinando p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227] com um anticorpo contra uma proteína viral), use também coloração única. O uso de manchas únicas é importante para corrigir possíveis sinais de sangramento em outros canais de imagem.</li>
</ol>6. Amplificação de sinal de tiramida (TSA)
<ol><li>Remova a mistura de anticorpos primários e lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.</li>
	<li>Remova o tampão de lavagem e adicione 100 μL de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies de anticorpos primários que precisam ser amplificadas. Para amplificar o sinal p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), adicione 100 μL de anti-coelho-HRP e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado. NOTA: Somente p-MLKL (S358) ou p-RIPK3 (S227) serão amplificados. A coloração de uma proteína viral será visualizada usando um método padrão de coloração indireta.</li>
	<li>Posteriormente, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.</li>
	<li>Nas próximas etapas, adicione a tiramida biotinilada à placa microscópica. Usando o grupo HRP acoplado aos anticorpos secundários, a reação enzimática desencadeará a formação de radicais tiramida nas proximidades do alvo primário (aqui, p-MLKL [S358] ou p-RIPK3 [S227]).</li>
	<li>Para ativar a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante juntamente com a tiramida biotinilada. Para conseguir isso, complemente o tampão TSA (0,1 M de ácido bórico [pH 8,5]) com 0,03 M H 2 O2; especificamente, tome 5 mL de tampão TSA e adicione 5 μL de 30% H 2 O2.</li>
	<li>Agora, dilua a biotina-tiramida em tampão TSA suplementadocom H 2O2, variando de 1:1.000 a 1:20.000. NOTA: O fator de diluição da biotina-tiramida precisa ser otimizado por lote.</li>
	<li>Remova o tampão de lavagem dos poços e adicione biotina-tiramida diluída aos poços a um volume final de 100 μL. Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado.</li>
	<li>Em seguida, lave os poços 3x com 100 μL de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.</li>
</ol>7. Fluoróforos
NOTA: Como o sinal do anticorpo primário é convertido em um grupo biotina, p-MLKL (S358) e p-RIPK3 (S227) são visualizados usando estreptavidina acoplada a um fluoróforo (fluoróforo 568, diluição: 1:500). Além disso, os núcleos são corados com DAPI (5 μg/mL). Se uma proteína viral estiver incluída no protocolo de coloração, inclua um anticorpo secundário adequado marcado fluorescentemente contra a espécie hospedeira do seu anticorpo primário. Nos resultados representativos, foi utilizado um rato anti-ICP0. Como anticorpo secundário foi incluído um anticorpo caprino acoplado ao fluoróforo 633 (diluição: 1:1.000).
<ol><li>Faça a mistura de coloração em tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS) contendo os anticorpos e manchas mencionados acima. Retire o tampão de lavagem, adicione 100 μL de mistura de coloração e incube à temperatura ambiente por 1 h em um agitador de laboratório inclinado. Mantenha a câmara de imagem protegida da luz a partir deste passo.</li>
	<li>Em seguida, lave os poços 2x com tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 em PBS). Incubar as etapas de lavagem por 5 minutos à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.</li>
	<li>Finalmente, lave os poços 2x com 1x PBS. Armazenar as amostras em excesso (> 200 μL) de 1x PBS até a obtenção de imagem. Alternativamente, submerja as amostras no meio de montagem para preservar a coloração. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal.</li>
</ol>8. Imagem usando um microscópio confocal
<ol><li>Ligue o microscópio confocal e os lasers pelo menos 10 minutos antes da imagem.</li>
	<li>Use um objetivo de imersão para sensibilidade. De preferência, use a ampliação objetiva de 40x ou 63x. Antes da imagem, limpe as objetivas de imersão com o limpador de lentes usando bolas de algodão apropriadas. Objetivos sujos (por exemplo, devido à poeira) podem resultar em imagens de menor qualidade.</li>
	<li>Coloque uma quantidade excessiva de óleo no fundo da câmara de imagem. Além disso, adicione uma gota de óleo no objetivo de escolha.</li>
	<li>Coloque a câmara de imagem no microscópio. Encontre o campo de foco usando a coloração DAPI ou usando imagens de campo brilhante. Se necessário, mova-se ao redor da câmara de imagem para garantir a disseminação adequada do óleo de imersão.</li>
	<li>Configure as trilhas de imagem necessárias no microscópio. Dependendo do microscópio, os passos a seguir podem variar (Tabela 1). NOTA: Ao configurar as trilhas de imagem, programe as trilhas para que a coloração nuclear seja medida por último. O laser de 405 nm pode contribuir para o fotobranqueamento e, assim, a perda de sinal específico em todos os canais.</li>
	<li>Para analisar uma célula completa quanto à presença de p-RIPK3 (S227) ou p-MLKL (S358), meça pilhas z que abrangem a altura da célula. Aqui, as pilhas z foram feitas de 40 fatias a cada 0,16 μm, resultando em um intervalo de 6,22 μm.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Pista</td>
			<td>Laser</td>
			<td>Divisor de feixe</td>
			<td>Filtro</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Gene Viral: ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Núcleo: DAPI</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Faixas de imagem para visualização celular.
9. Análise e quantificação dos dados
<ol><li>Carregue as imagens microscópicas para o software. Use o foco estendido para visualizar todas as informações da pilha z em uma imagem 2D.</li>
	<li>Em seguida, programe o protocolo de análise para extrair as seguintes informações: o número de células por imagem, a soma dos voxels mostrando a coloração p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+. Um voxel representa um volume tridimensional, definido como o equivalente tridimensional de um pixel.</li>
	<li>Para quantificar o número de células por imagem, segmente o núcleo. Para reduzir o ruído nos resultados da segmentação, adicione uma limitação de tamanho à segmentação (>100 μm³). O número de núcleos segmentados representa o número de células na imagem.</li>
	<li>Para quantificar a quantidade de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+, programe uma segmentação baseada em limiar. Defina o limite para que nenhum sinal seja captado nas imagens sem anticorpos primários (NP).</li>
	<li>Adapte ainda mais o limiar usando as imagens da condição simulada não tratada. Para garantir a detecção sensível do aumento do sinal devido à estimulação da necroptose, limite a captação de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ em condições simuladas, definindo um limiar mais alto. Sempre verifique o protocolo de análise programada em várias imagens da condição simulada e da infecção viral indutora de necroptose.</li>
	<li>Execute a análise em todos os conjuntos de imagens. Exporte a quantificação de voxel e a segmentação de núcleo em um arquivo de .txt para processamento adicional em software de planilha.</li>
	<li>Faça uma tabela dinâmica dos dados mostrando o nome da imagem, a quantificação do núcleo e a soma dos voxels detectados.</li>
	<li>Em seguida, divida a soma dos voxels positivos pela contagem de células na imagem. Isso resulta em um valor relativo de voxels positivos por célula. Para visualizar o aumento da dobra, divida o valor relativo de voxels p-RIPK3 (S227)+ ou p-MLKL (S358)+ por célula pela mediana da condição não tratada (mock).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL26. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já presente nas amostras...

A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica 1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral 3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após interações mediadas por motivo de interação homotípica RIP (RHIM) com uma das três moléculas ativadoras a montante: RIPK1 (no engajamento do receptor de TNF 1 [TNFR1]), β de interferon indutor de adaptador contendo domínio TIR (TRIF; no engajamento do receptor Toll-like 3 e 4), ou o sensor de ácido nucleico antiviral Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . A sinalização da necroptose prossegue através de uma série de eventos de fosforilação começando com a autofosforilação do RIPK3. A autofosforilação da RIPK3 humana na serina (S)227 dentro de seu domínio da quinase é um pré-requisito para a necroptose, permitindo a interação com a MLKL e é comumente usada como marcador bioquímico para ativação da RIPK3 humana e morte celular necroptótica 1,5. Uma vez ativado, o RIPK3 fosforila o loop de ativação do MLKL na treonina (T)357 e S3581. Isso causa uma mudança na conformação do MLKL, resultando na exposição do domínio do feixe de quatro hélices N-terminal. O MLKL então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde forma um poro através da inserção dos quatro feixes de hélices expostos na bicamada lipídica, levando eventualmente à morte celular 2,6.
ZBP1 é um sensor de ácido nucleico antiviral que reconhece ácidos nucleicos canhotos da forma Z, incluindo RNA de fita dupla na conformação Z (Z-RNA). A ligação do Z-RNA ocorre através de dois domínios Zα posicionados no terminal N do ZBP1. Acredita-se que o Z-RNA que se acumula durante a infecção por vírus de RNA e DNA envolva diretamente o ZBP1 7,8. O ZBP1 ativado recruta RIPK3 através de seus RHIMs centrais e induz a morte celular regulada, incluindo necroptose 9,10. Os vírus adotaram inúmeros mecanismos de escape para neutralizar a necroptose de células hospedeiras induzida porZBP11 11. Por exemplo, a subunidade 1 da ribonucleotídeo redutase do vírus herpes simplex 1 (HSV-1), conhecida como ICP6 e codificada pelo UL39, abriga o RHIM em seu N-terminal que interfere na ativação do RIPK3 mediado por ZBP1 em células humanas12,13,14,15. O ZBP1 não apenas restringe a replicação viral, mas estudos em camundongos mostraram que a ativação do ZBP1 causa doenças inflamatórias e estimula a imunidade ao câncer 16,17,18,19,20,21. Protocolos que detectam eventos de sinalização que ocorrem durante a necroptose induzida por ZBP1 em células humanas são, portanto, valiosos para avaliar o papel do ZBP1 nesses processos.
A amplificação de sinal de tiramida (TSA), também conhecida como deposição catalisada de repórter (CARD), foi desenvolvida para melhorar o limite de detecção e a relação sinal-ruído em imunoensaios baseados em anticorpos. Durante a TSA, qualquer anticorpo primário pode ser usado para detectar o antígeno de interesse. A peroxidase de rábano (HRP), acoplada a um anticorpo secundário, catalisa o acúmulo local de radicais de tiramida biotinilados na presença de peróxido de hidrogênio. Esses radicais de biotina-tiramida ativados então reagem com resíduos proximais de tirosina para formar ligações covalentes. Potenciais substratos de tiramida-biotina incluem o próprio antígeno, os anticorpos primários e secundários e proteínas vizinhas. Assim, enquanto a TSA melhora significativamente a sensibilidade do ensaio, parte de sua resolução espacial é perdida. Em uma etapa final, as moléculas de biotina são detectadas usando treptavidina marcada fluorescentemente. A reação HRP deposita muitas moléculas de tiramida-biotina sobre ou perto do antígeno de interesse. Isso aumenta muito o número de sítios de ligação treptavidina-fluorocromo, ampliando consideravelmente a sensibilidade do ensaio (Figura 1). Alternativamente, a tiraamida pode ser diretamente acoplada a um fluorocromo, eliminando a necessidade de fluoróforos acoplados à estreptavidina. A imuno-histoquímica proteica e a hibridização in situ DNA/RNA estavam entre os primeiros métodos pelos quais a ATS foi empregada para melhorar as intensidades de sinal22,23. Mais recentemente, a AST tem sido combinada com citometria de fluxo intracelular24 e espectrometria de massas25.
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar serina 227 RIPK3 humana fosforilada (p-RIPK3 [S227]) e MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) após a ativação de ZBP1 por infecção por HSV-1 usando microscopia de imunofluorescência. Usamos uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 sensível à necroptose que foi transduzida para expressar de forma estável a ZBP1 humana. Essas células foram infectadas com uma cepa de HSV-1 expressando uma proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) na qual quatro aminoácidos centrais dentro da IHMI viral (VQCG) foram substituídos por alaninas (AAAA), tornando a ICP6 incapaz de bloquear a necroptose mediada porZBP1 13,14,15. Para superar o problema da baixa relação sinal-ruído dos anticorpos atualmente disponíveis comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 e p-MLKL na imunocoloração26, realizamos uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta na detecção robusta de p-RIPK3 humano (S227) e melhora a sensibilidade de detecção de p-MLKL humano (S358) em uma ordem de magnitude.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho HRP</td><td>Agilent Technologies Bélgica</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP Polímero Marcado Anti-coelho</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0 Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Camundongo anti-ICP0(HSV-1) anticorpo</td></tr><tr><td>Soro de camundongo IAV-PR8</td><td>Produção interna</td><td>xx</td><td>Anticorpo policlonal anti-IAV-PR8 de camundongo</td></tr><tr><td>pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>Anticorpo anti-MLKL-fosfo S358 de coelho</td></tr><tr><td>pRIPK3</td><td>Abcam</td><td>ab209384</td><td>Coelho anticorpo anti-RIPK3-fosfo S227</td></tr> <tr><td>< forte > fluoróforos< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>Para visualizar o núcleo das células</td></tr><tr><td>Estreptavidina acoplada a Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>Para visulalizar moléculas de biotina</td></tr><tr><td>Compounds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Substrato oxidante, necessário para a atividade HRP</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>Para fixar/reticular as células</td></tr><tr><td>Biotinil-tiramida</td><td>R& D Systems</td><td>6241</td><td>Para amplificar o sinal, substrato HRP</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP Inhibitor</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Para cultura de células: para separar as células</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>8,0 g/L de NaCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,4 g/L de sal dissódico de EDTA</td></tr><tr><td>EDTA 0,04%</td><td>Formulação</td><td></td> interna <td>1,1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L NaH2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L KCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L Glicose</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>Para cultura de células, mantendo a cultura de células; número de lote: 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td></td><td>Inibidor de quinase AOB0917 RIPK3</td><td>Aobious</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Para cultura de células, mantendo a cultura de células</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>Solução de bloqueio</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>piruvato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>Para cultura de células, mantendo a cultura de células</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Molécula de sinalização de produção interna</td><td></td><td>, capaz de desencadear a morte celular em combinação com BV6 e zVAD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Para permeabilizar as células</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>Para contagem de células, usado como marcador vivo / morto a 0,1%</td></tr> <tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>Para cultura de células: para separar as células</td></tr><tr><td>zVAD</td><td>Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona</td></tr><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 poços de fundo de vidro alto</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>Para cultivar as células</td></tr><tr><td>Bolas de preparação de algodão-tamanho médio</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>71001-10</td><td>Para limpar as objetivas</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &deg; C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>Para visualizar a amostra em grandes ampliações</td></tr><tr><td>Limpador de lentes</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>Para limpar as objetivas</td></tr><tr><td>LSM880 Microscópio</td><td></td><td></td> confocal Fast Airyscan <td>Para visualizar a amostra</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office</td><td>xx</td><td>Para processar os dados</td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>Para analisar os dados - testes estatísticos e geração de gráficos</td></tr><tr><td>Volocidade 6.3</td><td>Volocidade</td><td>xx</td><td>Para realizar quantificações</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Para adquirir e processar imagens</td></tr><tr><td>Zen blue</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Para visualizar imagens</td></tr><tr><td>Vírus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cepa HSV-1 (mutRHIM) F</td><td>produzida por&nbsp; Dr. Jiahuai Han</td><td>replicação interna</td><td>HSV-1 como um gatilho para necroptose; O domínio central RHIM de UL39 / ICP6 é mutado (VQCG>AAAA)</td></tr> <tr><td>HSV-1 (WT) Cepa F</td><td>Produzido pelo Dr. Jiahuai Han</td><td>em replicação interna</td><td>HSV-1 (WT) como um controle negativo para indução de necroptose (inibição de ICP6)</td></tr> <tr><td>IAV PR8</td><td>em estoque doméstico</td><td>em casa replicação IAV</td><td>como um gatilho para necroptose</td></tr></tbody></table>

amplificação do sinal de tiramida para a coloração imunofluorescente da fosforilação dependente de zbp1 de ripk3 e mlkl após infecção por hsv-1 em células humanas

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.

A detecção imunofluorescente da fosforilação MLKL e, especialmente, da fosforilação RIPK3 em células humanas é tecnicamente desafiadora26. Apresentamos aqui um protocolo de coloração melhorado para p-RIPK3 humano (S227) e p-MLKL (S358) após a ativação do ZBP1. O protocolo inclui uma etapa da TSA para melhorar o limite de detecção e a sensibilidade dos sinais fluorescentes. Para validar o método, foi realizada uma comparação lado a lado da imunofluorescência mediada pela TSA com coloração fluoresce...

A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.

Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

A visualização robusta de RIPK3 e MLKL fosforilados, dois eventos-chave de sinalização durante a indução da necroptose, tem sido tecnicamente desafiadora. O protocolo de amplificação de tiramida apresentado permite a detecção sensível dessas duas moléculas. A etapa de amplificação do sinal reduz o limiar de detecção, permitindo a detecção robusta e reprodutível de RIPK3 e MLKL fosforilados.Comece a semear as 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy de força total em uma placa de poço de área de superfície quadrada de um centímetro, permitindo microscopia de ponta. Use um volume final de 200 microlitros por poço. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%.Uma vez que as células atinjam 70 a 80% de confluência, infecte as células em 200 microlitros pré-aquecidos, meio McCoy's 5A de força total contendo o vírus herpes simplex um, codificando uma ICP6 mutante de borda a uma multiplicidade de infecção de cinco. Incubar as células com o vírus por nove horas para induzir necroptose. Como controle positivo para a indução de necroptose, estimular as células por quatro horas com 200 microlitros de coquetel indutor de necroptose pré-aquecido.Como controle negativo, adicione 22 microlitros de 10 micromolares GSK840 pré-aquecidos a 37 graus Celsius para inibir a atividade da quinase RIPK3. Incluir este inibidor em uma condição não tratada e após estimulação da necroptose para evitar a autofosforilação da serina 227. Para fixar as células, retire o meio e lave as células com 200 microlitros de PBS.Em seguida, retire o PBS e adicione 150 microlitros de paraformaldeído a 4% equilibrado à temperatura ambiente. Incubar as células à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a fixação, retire o paraformaldeído a 4% e lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS.As amostras podem ser armazenadas em excesso de PBS a quatro graus Celsius durante a noite até processamento adicional. Remova o PBS da placa e incube as células com 100 microlitros de tampão de permeação à temperatura ambiente por 30 minutos em um agitador de laboratório inclinado. Após a incubação, remova o tampão de permeabilização e lave as células com 100 microlitros de tampão de lavagem.Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem durante cinco minutos à temperatura ambiente num agitador de laboratório inclinado. Para evitar a ligação inespecífica de anticorpos primários, incubar a placa com 100 microlitros de meio bloqueador à temperatura ambiente por duas horas em um agitador de laboratório inclinado. Em seguida, lave os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem com cinco minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.Depois de remover o tampão de lavagem, adicione 100 microlitros dos anticorpos primários à câmara de imagem. Certifique-se de incluir uma condição de anticorpo não primária para visualizar o fundo potencial da amplificação do sinal de tiramida e definir o limiar de mascaramento. Incubar a câmara durante a noite a quatro graus Celsius.Remova a mistura primária de anticorpos e lave os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem com cinco minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado. Após a remoção do tampão de lavagem, incubar as células com 100 microlitros de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies do anticorpo primário a serem amplificadas por 30 minutos em um agitador de laboratório inclinado. Durante a incubação de anticorpos, prepare a mistura de tiramida biotinilada.Para desencadear a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante ao tampão TSA imediatamente antes do uso. Em seguida, diluir a tiramida biotinilada no tampão TSA preparado utilizando a diluição optimizada. Após a incubação com anticorpo secundário marcado com HRP, lave os poços três vezes com tampão de lavagem com cinco minutos de incubação em um agitador de laboratório inclinado.Depois de remover o tampão de lavagem do poço, adicione biotina-tiramida diluída ao poço a um volume final de 100 microlitros. Incubar a reação à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado, seguido de três lavagens tampão de lavagem. Prepare a mistura de coloração contendo o anticorpo secundário, a estreptavidina acoplada e o tampão de coloração e lavagem nuclear.Retire o tampão de lavagem e incube a placa com 100 microlitros de mistura de coloração à temperatura ambiente durante uma hora num agitador de laboratório basculante. Mantenha as câmaras de imagem protegidas da luz a partir deste passo. Após a coloração, lave consecutivamente duas vezes com tampão de lavagem e enxágue os poços duas vezes com PBS.Armazenar as amostras em excesso de PBS a quatro graus Celsius para preservar a coloração até a imagem. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal. A inclusão da amplificação do sinal de tiramida permitiu a detecção robusta de RIPK3 fosforilado na serina 227 no citosol do vírus herpes simplex um, codificando uma borda mutante de células infectadas por ICP6.Uma potência do laser de 2% foi suficiente para a detecção sensível. Na imunofluorescência indireta padrão, uma maior potência do laser permaneceu insuficiente para a detecção de fosfo-RIPK3. Na quantificação das imagens tridimensionais da pilha Z, as células infectadas mostraram um aumento de aproximadamente 20 vezes de voxels positivos para RIPK3 fosforilado em relação às células tratadas simuladas.O aumento da coloração fosfo-RIPK3 de células infectadas pelo vírus herpes simplex do tipo selvagem em comparação com células tratadas simuladas indicou que o domínio da borda da ICP6 é incapaz de bloquear completamente a fosforilação da RIPK3 na serina 227. O GSK840 liga-se ao domínio da quinase de RIPK3 e impede a fosforilação de RIPK3 na serina 227 após a ativação do ZBP1, confirmando a especificidade do método de detecção de fosfo-RIPK3 mediado por amplificação de sinal de tiramida. As células tratadas simuladas apresentaram baixa coloração citosólica levemente pontuada de fosforilação MLKL na serina 358, enquanto forte coloração foi detectada no citosol, núcleo e membrana plasmática das células infectadas.A imunofluorescência indireta padrão exigiu 40% de potência laser para a detecção específica de um sinal fosfo-MLKL nas células infectadas. Em contraste, a amplificação do sinal de tiramida aumentou a sensibilidade de detecção de fosfo-MLKL, diminuindo assim a potência necessária do laser para 6% de quantificação de imagem de pilha Z 3D mostrou um aumento de aproximadamente 90 vezes no número de voxels positivos para fosfo-MLKL usando amplificação de sinal de tiramida, em comparação com um aumento de sete vezes usando o método padrão, indicando melhor limiar de detecção e sensibilidade para fosfo-MLKL. Semelhante ao vírus herpes simplex um, a infecção pelo vírus influenza A desencadeou necroptose dependente de ZBP1.A amplificação do sinal de tiramida permitiu a detecção robusta de fosfo-RIPK3 e fosfo-MLKL, indicando necroptose. Para interpretar a coloração confocal, vários controles de coloração precisam ser incluídos. Isso implica uma condição sem primária, manchas únicas, bem como um controle positivo.Ao adaptar este protocolo, vários alvos podem ser amplificados usando TSA sequencial. Isso permitiria a detecção de RIPK3 e MLKL fosforilados dentro da mesma célula. A detecção sensível de biomarcadores de necroptose pode ser perspicaz para pesquisas em andamento sobre ZBP1 sobre autoinflamação ou infecção por vírus, nas quais as vias de morte celular dependentes de ZBP1 executadas ainda precisam ser confirmadas como necroptose, apoptose ou piroptose.

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Research

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Enxaqueca e sua transformação para enxaqueca crônica são um fardo imenso de saúde que precisam de opções de tratamento melhoraram. Procuramos definir como sinalização imune neural modula a suscetibilidade à enxaqueca,...

Modelagem Neural Sinalização Imune de migrânea episódica e crônica Usando a depressão alastrante In Vitro</em

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Este vídeo demonstra um método para monitorar a proteína 0 da célula infectada, o tráfego de ICP0 na infecção pelo vírus herpes simplex-1. Após a síntese de novo, a ICP0 se transloca para o núcleo, movendo-se posteriormente para o citoplasma durante a progressão da infecção. A microscopia de imunofluorescência revela e analisa a localização subcelular da proteína, oferecendo informações sobre seu tráfego nas fases de infecção.

Uma técnica de imunofluorescência para localização de proteínas virais em células infectadas

Foi estabelecido um protocolo de hibridização fluorescente in situ para a detecção de um genoma do vírus de ADN persistente nas secções de tecido de modelos animais. Este protocolo permite estudar processo de infecção por codetection do genoma viral, os seus produtos de ARN, e proteínas virais ou celulares no interior das células individuais.

A detecção do genoma e Transcrições de um vírus DNA persistente em tecidos neuronais por fluorescentes Em situ Hibridização Combinado com Imunocoloração

A pele é um tecido-alvo do patógeno humano vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1). Para explorar a rota de invasão do HSV-1 no tecido, estabelecemos um modelo de infecção ex vivo de lâminas epidérmicas murinas que representam a camada mais externa da pele.

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.

Imagem latente funcional das fábricas de transcrição Viral usando microscopia de fluorescência 3D

ICP0 sofre translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. O mecanismo molecular deste evento não é conhecido. Aqui nós descrevemos o uso do microscópio confocal como uma ferramenta para quantificar o movimento de ICP0 na infecção pelo HSV-1, que estabelece as bases para a análise de quantitativamente ICP0 translocação em futuros estudos mecanicistas.

Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Nós descrevemos um protocolo que utiliza a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para visualizar RNAs herpética múltiplas dentro das pilhas humanas liticamente contaminadas, na suspensão ou no aderente. Este protocolo inclui a quantificação da fluorescência produzindo uma relação Mimivírus e pode ser estendido para o visualização simultâneo do anfitrião e das proteínas virais com imunofluorescência (se).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Neste estudo, apresentamos estratégias baseadas em inibidor e siRNA para interferir com o fluxo autofárgico no vírus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) células dendríticas derivadas de monocyte infectadas.

eletroporação siRNA para modular a autofagia em herpes simplex vírus tipo 1 infectado monocyte derivados células dendríticas

Apresenta-se aqui um protocolo para uma abordagem de imagem de fluorescência, multiplex immunofluorescente cell-based detection of DNA, RNA and protein (MICDDRP), um método capaz de visualização simultânea de fluorescência unicelular de proteínas virais e ácidos nucleicos de diferentes tipos e filamentos. Essa abordagem pode ser aplicada a uma gama diversificada de sistemas.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Aprenda a amplificação do sinal de tiramida para detecção sensível de RIPK3 e MLKL fosforilados em células HT-29 humanas após infecção por HSV-1. Este método melhora a visualização imunofluorescente da necroptose induzida por ZBP1.

Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas (Vídeo) | JoVE Journal

Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas

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