Quantificação e Análise Baseada em Citometria de Fluxo de Células B do Miocárdio

A literatura relata dados contrastantes sobre a prevalência de células B miocárdicas. Isso provavelmente decorre da variabilidade nas técnicas de perfusão e digestão. Nosso protocolo capacita a análise baseada em citometria de fluxo reprodutível em células B miocárdicas.

Esta técnica maximiza o rendimento de recuperação de células B e reduz a variabilidade na contagem de citometria de fluxo entre células B e outras populações de amostras cardíacas. Este método otimizado de digestão e isolamento pode ser facilmente modificado para implementar um painel de anticorpos estendido para estudar diferentes tipos de células imunes no coração. O protocolo também pode ser aplicado a outros órgãos, como pulmão ou fígado, para estudar células B associadas a esses órgãos.

Para começar, pese um rato macho de 12 semanas de idade. Carregue uma seringa de insulina de 310 cc com 100 microlitros da solução de anticorpos B220. Injete o anticorpo B220 diluído por injeção retro-orbital e proceda imediatamente à colheita e perfusão de órgãos.

Após a eutanásia, segure a pele do rato com fórceps na área epigástrica. Faça uma abertura de dois milímetros na pele usando uma tesoura e use a pinça para descascar a pele para revelar a camada da fáscia. Corte no epigástrio através da fáscia e do peritônio.

Aperte o processo xifoide usando pinça hemostática. Faça um corte vertical através da parede torácica ao nível da linha clavicular média de cada lado e levante a parede torácica anterior para revelar o conteúdo do mediastino. Segure a aorta com segurança por trás usando fórceps.

Introduza a agulha da seringa no ápice do coração. Perfundido com três mililitros de HBSS a uma taxa de três mililitros por minuto. Corte a aorta e remova o coração.

Lave o coração na placa de Petri com HBSS. Pese o coração isolado e observe o peso em miligramas. Pique o coração à temperatura ambiente em pequenos pedaços com uma lâmina.

As peças do coração devem ter cerca de 1,5 milímetros de tamanho. Meça a massa de tecido cardíaco usando uma balança e coloque 60 miligramas do coração picado para ser digerido em um tubo de 15 mililitros no gelo com três mililitros de HBSS. Repita este processo para um rato que não recebeu a injeção de anticorpos B220 e coloque-o no tubo com três mililitros de tecido de controlo de referência marcado com HBSS.

Adicione enzimas a cada tubo contendo tecidos picados. Adicione 0,5 microlitros por miligrama de DNase I, um 0,5 microlitros por miligrama de colagenase II e 0,2 microlitros por miligrama de hialuronidase. Coloque a reação de digestão no agitador por 30 minutos a 300 rotações por minuto.

Os tubos são colocados no agitador em um pequeno ângulo, cerca de 25 graus de inclinação. Adicione sete mililitros de HBSS a cada um dos tubos de reação de 15 mililitros e centrifugar a 250 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a decantação do sobrenadante, ressuscite cada pellet em cinco mililitros de tampão de lise ACK.

Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de adicionar 10 mililitros de PBS a cada tubo, misture e filtre em um tubo de 50 mililitros com um filtro de 40 micrômetros. Esmague quaisquer detritos no filtro com um êmbolo de seringa para garantir que todo o material passe pelo filtro.

Depois de adicionar PBS através do filtro até que o volume atinja 25 mililitros por coração, adicione mais 25 mililitros de PBS ao tubo de tecido de controle de referência e divida o volume em dois tubos diferentes. Rotule um dos tubos não manchado e o outro vivo/morto. Após centrifugação a 250 G por cinco minutos a quatro graus Celsius, decantar o sobrenadante e ressuspender o tubo não corado em 100 microlitros de PBS e cada um dos outros pellets em 100 microlitros da solução de coloração viva/morta.

Incube no gelo por 30 minutos no escuro. Depois de adicionar 500 microlitros de tampão FACS a cada amostra, transfira-o para um tubo FACS através de um filtro de 40 micrômetros. Depois de recusar os tubos FACS a 250 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante, ressuscite o pellet em 500 microlitros de tampão FACS.

Adicionar 50 microlitros de solução de bloqueio FC a cada tubo, com excepção dos tubos não corados e vivos/mortos. Misture e incube por cinco minutos. Depois de adicionar 50 microlitros de solução de mistura de anticorpos a cada tubo, exceto para os tubos não corados e vivos / mortos, incube por 30 minutos no escuro, cobrindo o balde de gelo com papel alumínio.

Tal como acontece com a mancha viva / morta, lave novamente com 500 microlitros de tampão FACS e ressuspenda em 300 a 500 microlitros de tampão FACS. Abra o software de controle do instrumento. Na parte superior da janela, selecione a guia Aquisição e clique em Novo.

Na seção biblioteca, no campo Tipo a filtrar, digite PE, PerCP-Cy5.5, violeta brilhante 421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, selecionando o fluoro-4 e clicando em Adicionar depois de digitar cada um. Em seguida, clique em Avançar para prosseguir para a guia Grupos. Agora clique no símbolo com um tubo para adicionar o coração para a análise.

Clique no grupo de referência e uma janela será exibida. Na coluna de tags fluorescentes, selecione Zombie Aqua como a tag fluorescente, excluindo quaisquer outras clicando no ícone vermelho da lixeira ao lado de cada uma. Em seguida, no ícone Tipo de Controle, selecione Células.

Em seguida, clique em Salvar. Clique em Avançar. Em seguida, clique na guia Marcadores.

Uma tabela será exibida. Digite o marcador de célula correspondente na primeira linha de cada coluna fluoro-4 e pressione Enter. Clique em Avançar duas vezes para ir para a guia Aquisição.

Em Eventos a Registrar das amostras experimentais, tipo 10 milhões, e no mesmo campo para a linha do grupo de referência, tipo 200.000. Clique em Salvar e Abrir. No canto inferior esquerdo, clique em Controle de Instrumentos.

Ajuste a tensão para FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selecione o Controle de Aquisição. Para a opção de taxa de fluxo, selecione Alta no menu suspenso.

Vórtice o tubo cardíaco não manchado e coloque-o firmemente na porta de injeção da amostra. Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta. Em seguida, clique em Gravar e aguarde até que os eventos sejam registrados.

Faça o mesmo para o tecido cardíaco manchado vivo / morto. Selecione o menu Unmix e defina os controles. Marque a caixa de seleção Autofluorescência como uma Marca Fluorescente.

Em seguida, clique em Avançar para prosseguir para a guia Identificar Populações Positivas/Negativas. Nesta guia, um gráfico de área de dispersão para frente versus área de dispersão lateral será exibido. Clique e arraste os pontos do polígono para selecionar uma área entre 1 e 4 milhões no eixo da área de dispersão para a frente e entre 0,2 e 3 milhões no eixo da área de dispersão lateral.

No próximo gráfico à direita, V5-A será exibido no eixo X. Mova os portões para selecionar metade do pico na extrema direita como positivo e uma região no lado esquerdo do gráfico como negativo. No gráfico intitulado Grupo de Referência - Não Manchado, selecione uma população em um intervalo semelhante.

Para os não corados, nenhum positivo/negativo deve ser selecionado. Clique no botão Live Unmixing. Agora adquira as amostras experimentais, vortex o tubo e coloque-o com segurança no SIP.

Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta. Em seguida, clique em Gravar no painel de Controle de Aquisição do software do citômetro e aguarde até que os eventos sejam registrados. Selecione a guia Planilha Não Mista Padrão.

Crie um gráfico FCS-A versus SSC-A usando a ferramenta de gráfico de pontos na parte superior. Selecione eventos superiores a 0,4 milhão no eixo FSC-A e superiores a 0,8 milhões no eixo SSC-A usando a ferramenta de seleção de polígonos. Crie um novo gráfico clicando duas vezes na seleção e, nesse novo gráfico, clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo Y e selecione a mancha viva/morta.

Clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo X e selecione Autofluorescência A.Selecione todos os eventos abaixo de 10 para o quinto no eixo vivo/morto. Estas são as células vivas. Clique duas vezes nesta seleção.

No novo gráfico, selecione PerCP-Cy5.5A para o eixo X e SSC-A para o eixo Y. Selecione as populações do lado direito do PerCP-Cy5.5A. Estas são as células do sistema imunológico.

Clique duas vezes na seleção. No novo gráfico, selecione FSC-A para o eixo X e altura de dispersão para a frente para o eixo Y. Selecione os eventos que seguem uma tendência na qual o valor FSC-A e o valor SSC-A são os mesmos.

Isso seleciona células individuais e elimina dubletos. Clique duas vezes nesta seleção para exibir um novo gráfico na população de célula única positiva para CD45. No gráfico de população de célula única positiva para CD45, selecione violeta brilhante 421 no eixo X versus SSC-A no eixo Y.

Selecione a população à direita no eixo violeta brilhante 421. Esta é a população de células B. Clique duas vezes nessa população para criar dois novos gráficos com a população de células B.

Configure o primeiro gráfico de células B com PEA no eixo X e violeta brilhante 421A no eixo Y. A população à direita corresponde às células B intervasculares, e a população à esquerda representa as células B intersticiais. Selecione ambos.

Configure o segundo gráfico de células B com Alexa Fluor 700A no eixo X e SSC-A no eixo Y. A população à esquerda corresponde às células CD11b-negativas, e os eventos à direita correspondem às células CD11b-positivas. Clique com o botão direito do mouse em cada seção e, em seguida, clique em Propriedades do portão.

Clique em Contar e Pai para exibir o número de eventos e porcentagens das populações pai. Registre o número de eventos e porcentagens para análise de dados adicional. Após a remoção de dubletos em um coração ingênuo e não ferido, espera-se que cerca de 20% das células CD45-positivas sejam células B CD19-positivas.

Dessas células, em média, 5,5% estão localizadas no espaço intersticial. 94,5% estão no espaço intravascular. De toda a população de células B encontrada no coração, apenas cerca de 1,6% corresponde a células B1 com base no marcador de superfície CD11b e os outros 98,4% correspondem a células B2.

Ao analisar as células B miocárdicas via citometria de fluxo, é crucial perfundir e picar o coração adequadamente seguindo o protocolo. A filtração adequada do coração digerido também é essencial para maximizar a recuperação das células imunes.