Name: Quantificação e Análise Baseada em Citometria de Fluxo de Células B do Miocárdio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Aprenda a quantificar e analisar células B do miocárdio por citometria de fluxo. Este protocolo otimizado aumenta o rendimento de recuperação celular e reduz a variabilidade em amostras cardíacas de camundongos.

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Este estudo foi financiado pelas bolsas NHLBI 5K08HLO145108-03 e 1R01HL160716-01 concedidas a Luigi Adamo.
O citômetro de fluxo Aurora usado para desenvolver este estudo foi financiado pelo NIH Grant S10OD026859. Reconhecemos o apoio do JHU Ross Flow Cytometry Core.

Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados com a aprovação da IACUC da Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Preparações
<ol><li>Prepare o buffer FACS, conforme descrito na Tabela 1.</li>
	<li>Certifique-se de que há CO2 suficiente para eutanasiar os animais.</li>
	<li>Prepare o espaço de dissecação (coloque a almofada de bancada e coloque a fita adesiva e as ferramentas de dissecação nas proximidades).</li>
	<li>Rotule os tubos de 15 ml, coloque 3 ml de HBSS com cálcio e magnésio em cada tubo (ver Tabela de Materiais) e coloque-os no gelo (um tubo por coração e um extra para o grupo de referência/controlos de citometria de fluxo). Além disso, encha as pequenas placas de Petri (35 mm) com HBSS.</li>
	<li>Ligue o agitador com temperatura controlada, ajuste-o para 37 °C e pré-arrefeca a centrífuga a uma temperatura de 4 °C.</li>
	<li>Prepare a bomba da seringa e ajuste o caudal para 3 ml/min. Encha uma seringa de 20 ml com HBSS, prima a linha do tubo com tampão e remova quaisquer bolhas.</li>
</ol>2. Coloração intravascular de células B (in vivo)
<ol><li>Pese um rato macho de 12 semanas de idade da estirpe C57BL/6J. Carregue uma seringa de insulina de 3/10 cc com 100 μL da diluição do anticorpo B220 (1:10, em PBS). Cubra a seringa com papel alumínio para proteger da luz.</li>
	<li>Anestesiar um rato.<ol><li>Aplicar uma injeção intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 2% com uma dose de 400 mg/kg e esperar 10-20 min. NOTA: Monitore a respiração e o movimento do mouse. Uma vez que o rato pare de se mover, estimule a dor beliscando o dedo do pé; a ausência de um reflexo de abstinência indica anestesia adequada.</li>
		<li>Se a anestesia adequada não for alcançada no curso de 20 min, uma dose adicional de anestésico a 100 mg/kg pode ser administrada, e uma avaliação da cinética do camundongo, reflexo de abstinência e respiração deve ser feita a cada 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o mouse no banco de laboratório em uma almofada de banco inclinada para um lado, puxe suavemente a pele das costas para baixo e pressione levemente o corpo contra o banco para fazer o olho se projetar.</li>
	<li>Injete o anticorpo B220 diluído a partir da etapa 2.1 por injeção retroorbital.<ol><li>Introduza a seringa no olho a 45° do plano sagital da cabeça do rato. Injete lentamente a solução. Se a resistência for sentida, retire a seringa e entre novamente. Aguarde 2 min. NOTA: O tempo de incubação prolongado comprometeria a capacidade de discriminar as células B intravasculares versus extravasculares, pois daria tempo para o anticorpo injetado se difundir fora da vasculatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanasiar o rato de acordo com os regulamentos da IACUC.<ol><li>Abra o fluxo de CO2 para a câmara de eutanásia a uma taxa de 0,5 L/min, ou a taxa de fluxo recomendada com base no tamanho da sua câmara.</li>
		<li>Coloque o rato na câmara durante o tempo recomendado, garantindo que já não está a respirar. Removê-lo e realizar luxação cervical como um método secundário de eutanásia.</li>
		<li>Uma vez que o rato é sacrificado, proceda prontamente à extração de órgãos e perfusão.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Coleção de corações
<ol><li>Abertura do peito.<ol><li>Segure a pele do rato com pinça na área epigástrica. Faça uma abertura de 2 mm na pele usando uma tesoura e use a pinça para descascar a pele para revelar a camada da fáscia, uma camada translúcida brilhante, do peito e do abdômen. Corte no epigástrio através da fáscia e peritônio para abrir a parede abdominal e revelar o processo xifoide. Aperte o processo xifoide usando pinça hemostática.</li>
		<li>Com a tesoura, faça um corte vertical através da parede torácica ao nível da linha médio-clavicular de cada lado e levante a parede torácica anterior para revelar o conteúdo do mediastino, usando pinça hemostática como peso para manter a abertura.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusão e extração cardíaca.<ol><li>Usando fórceps, remova qualquer gordura ou tecido tímico ao redor do coração.</li>
		<li>Segure a aorta com segurança por trás usando fórceps. Introduza a agulha da seringa (25 G) no ápice do coração. Perfundir com 3 mL de HBSS a uma taxa de 3 mL/min. NOTA: Monitore a perfusão. O fígado deve encher, e o sangue nos vasos coronários deve ser totalmente removido. Recomenda-se o uso de uma bomba de seringa calibrada para 1 mL / minuto para manter um fluxo constante.</li>
		<li>Corte a aorta usando uma tesoura e tire o coração. Lave o coração na placa de Petri com HBSS para remover qualquer sangue restante. Usando tesoura e fórceps, remova a gordura, o tecido conjuntivo e o timo, e seque o coração. Pese o coração isolado e observe o peso em miligramas. Pique o coração à temperatura ambiente em pequenos pedaços (1-2 mm) com uma lâmina. NOTA: Corações de ratos adultos podem pesar entre 0,090-0,210 mg.</li>
		<li>Meça a massa de tecido cardíaco e coloque 60 mg do coração picado para ser digerido em um tubo de 15 mL com 3 mL de HBSS. Reter o tecido cardíaco restante e colocar num tubo rotulado como "Tecido de controlo de referência"; isso será usado para controle de compensação para sinal de mortos-vivos e autofluorescência.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Digestão do coração e coloração celular
<ol><li>Adicionar enzimas a cada tubo que contenha tecido picado (ver Tabela 1). Adicionar 0,5 μL/mg de DNase 1 (300 Unidades para 60 mg de tecido cardíaco), 0,5 μL/mg de colagenase II (625 Unidades para 60 mg de tecido cardíaco) e 0,2 μL/mg de hialuronidase (50 Unidades para 60 mg de tecido cardíaco) ao tubo.</li>
	<li>Coloque a reação de digestão no agitador por 30 min a 300 rpm. Ajuste o rack do agitador para cerca de 25° de inclinação.</li>
	<li>Adicionar 7 ml de HBSS a cada um dos tubos de reação de 15 ml e centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C com aceleração e ruptura ajustadas para moderada ou lenta. Decantar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 5 mL de tampão de lise ACK para remover os glóbulos vermelhos. Incubar no tampão de lise ACK durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 10 mL de PBS a cada tubo, misture e, em seguida, filtre em um tubo de 50 mL com um filtro de 40 μm. Certifique-se de que todos os detritos estão dentro da câmara de filtro. Esmague quaisquer detritos no filtro com um êmbolo de seringa até que esteja completamente suspenso dentro da câmara de filtro.</li>
	<li>Adicionar PBS através do filtro até que o volume atinja 25 mL por coração; isso permitirá que as células suspensas passem pelo filtro. Adicione mais 25 mL de PBS ao tubo de tecido de controle de referência e divida o volume em tubos diferentes (25 mL cada). Rotule um dos tubos como "Não manchado" e o outro como "Morto-vivo". Centrífuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: Neste ponto, prepare a diluição para a mancha de mortos-vivos (diluição: 1:500 em 1x PBS).</li>
	<li>Decantar o sobrenadante, ressuspender o pellet no tubo não corado em 100 μL de PBS e cada um dos outros pellets em 100 μL da diluição da mancha de mortos-vivos. Incube no gelo por 30 minutos no escuro, cobrindo o balde de gelo com papel alumínio.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de tampão FACS a cada amostra e transferi-lo para um tubo FACS rotulado através de um filtro de 40 μm. Centrifugar os tubos FACS a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Ressuspeite o pellet em 500 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de solução de bloqueio de Fc (ver quadro 1) a cada tubo, com excepção dos tubos não corados e vivos. Misture e incube por 5 min.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de solução de mistura de anticorpos (ver Tabela 1) a cada tubo, com excepção dos tubos não corados e mortos-vivos, e incubar durante 30 minutos no escuro, cobrindo o balde de gelo com papel alumínio.</li>
	<li>Adicionar 2 ml de tampão FACS a cada tubo e centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuscite em 300-500 μL de buffer FACS.</li>
</ol>5. Citometria de fluxo
<ol><li>Configure as configurações de controle do instrumento. NOTA: Neste protocolo a amostra é analisada com um citômetro de fluxo Cytek Aurora de 4 lasers. Outro citômetro de fluxo apropriado poderia ser usado para detectar os marcadores de interesse.<ol><li>Abra o software de controle do instrumento (consulte Tabela de materiais). Na parte superior da janela, selecione a guia Aquisição e clique em Novo +. Uma janela chamada Criar Novo Experimento será exibida.</li>
		<li>Na seção Biblioteca, no campo Tipo a ser filtrado, digite PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, clicando em Adicionar depois de digitar cada um. Os nomes dos fluoróforos devem ser vistos à direita. Em seguida, clique em Avançar para prosseguir para a guia Grupo .</li>
		<li>Na guia Grupo , clique no símbolo com um tubo para adicionar o coração para a análise.</li>
		<li>Clique no grupo + Referência e uma janela será exibida. Na coluna de etiqueta fluorescente, selecione Zombie Aqua e, na coluna de tipo de controlo, selecione Células e, em seguida, clique em Guardar.</li>
		<li>Clique na guia Avançar > Marcadores ; uma tabela será exibida com os nomes dos fluoróforos. Digite o marcador celular correspondente na primeira linha de cada coluna de fluoróforo e digite Enter: CD45 para PerCP-Cy5.5; CD19 para BV421; CD11b para Alexa Fluor 700; B220 para PE; e mortos-vivos para Zombie Aqua.</li>
		<li>Clique em Avançar duas vezes para ir para a guia Aquisição . Em Eventos a Registrar do grupo experimento, digite 10.000.000 e no mesmo campo para o grupo de referência tipo de linha 200.000. Clique em Salvar e Abrir. As outras configurações devem permanecer como padrão, Tempo de parada para 10.000 e Parando o volume para 3.000.</li>
		<li>No canto inferior esquerdo, clique em Controle de instrumentos. Defina a tensão para FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Em seguida, selecione o Controle de aquisição. Para a opção Taxa de fluxo , selecione Alta no menu suspenso.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquira amostras de referência com um citômetro e desmisture o software.<ol><li>Vórtice do tubo cardíaco não manchado e coloque-o firmemente na porta de injeção da amostra (SIP). Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta, clique em Iniciar no painel de Controle de Aquisição do software do citômetro e aguarde até que os eventos sejam registrados. Faça o mesmo para o tecido cardíaco manchado de mortos-vivos.</li>
		<li>Selecione o menu Unmix e defina os seguintes controles:<ol><li>Marque as caixas de seleção para PE, PerCP-Cy5.5, BV421 e Alexa Fluor 700 na coluna da biblioteca. Certifique-se de que Zombie Aqua está desmarcado na mesma coluna. Na parte inferior, marque a opção de Autofluorescência como uma Etiqueta Fluorescente.</li>
			<li>Clique em Avançar para prosseguir para a guia Identificar Populações Positivas/Negativas . Nesta guia, um gráfico de FSC-A vs. SSC-B-A será exibido. Clique e arraste os pontos do polígono para selecionar uma área entre 1,0 M e 4,0 M no eixo FSC-A e entre 0,2 M e 3,0 M no eixo SSC-B-A.</li>
			<li>No próximo gráfico à direita, V5-A será exibido no eixo X. Mova os portões para selecionar metade do pico na extrema direita como positivo e uma região no lado esquerdo do gráfico como negativo. No gráfico intitulado Grupo de Referência - Não Manchado, selecione uma população em um intervalo semelhante. Para isso, o não manchado não positivo-negativo tem que ser definido.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Adquirir amostras experimentais.<ol><li>Para cada tubo que contenha uma amostra para um rato individual, vortex o tubo e coloque-o firmemente no SIP. Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta, clique em Iniciar no painel Controle de Aquisição do software do citômetro e aguarde até que os eventos sejam registrados.</li>
	</ol></li>
	<li>Estratégia de confinamento.<ol><li>Selecione a guia Planilha Não Mista Padrão . Crie um gráfico FSC-A vs. SSC-A usando a ferramenta Gráfico de pontos na parte superior. Selecione eventos maiores que 0,4 M no eixo FSC-A e maiores que 0,8 M no eixo SSC-A usando a ferramenta de seleção de polígonos. Clique duas vezes nesta seleção e um novo gráfico será exibido.</li>
		<li>No gráfico recém-criado, clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo X e selecione AF-A; clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo Y e selecione Mancha de morto-vivo. Clique na ferramenta de seleção de retângulo na parte superior e selecione todos os eventos abaixo de 105 no eixo de mortos-vivos que correspondem ao sinal de morto-vivo inferior. Clique duas vezes nesta seleção e um novo gráfico será exibido.</li>
		<li>No novo gráfico, clique com o botão direito do mouse para selecionar PerCP-Cy5.5-A para o eixo X e SSC-A para o eixo Y. Usando a ferramenta Seleção de retângulo, selecione os eventos superiores a 104 no eixo PerCP-Cy5.5-A que correspondem às células CD45 positivas. Clique duas vezes na seleção e um novo gráfico será exibido.</li>
		<li>No novo gráfico, clique com o botão direito do mouse para selecionar FSC-A para o eixo X e FSC-H para o eixo Y. Usando a ferramenta de seleção Polygon, selecione os eventos que seguem uma tendência na qual o valor FSC-A e o valor SSC-A são os mesmos; com isso, os duplicados de células serão removidos e a população na seleção será referida como a população CD45+. Clique duas vezes na seleção para exibir um novo gráfico com a população CD45+.</li>
		<li>No gráfico de população CD45+, clique com o botão direito do mouse para selecionar BV421 no eixo X vs. SSC-A no eixo Y. Usando a ferramenta de seleção de polígonos, selecione a população à direita no eixo BV421 . Esta é a população de células B. Clique duas vezes nesta população para criar dois novos gráficos com a população de células B.<ol><li>Clique com o botão direito do mouse para configurar o primeiro gráfico de células B com PE-A no eixo X e BV421-A no eixo Y. A população à direita corresponde às células B intravasculares, e a população à esquerda representa as células B intersticiais. Use a ferramenta de seleção de polígono para fazer uma seleção de ambos.</li>
			<li>Clique com o botão direito do mouse para configurar o segundo gráfico de células B com Alexa Fluor 700-A no eixo X e SSC-A no eixo Y. A população à esquerda corresponde às células CD11b-, e os eventos à direita (se houver) correspondem às células CD11b+.</li>
			<li>Clique com o botão direito do mouse em cada seleção e, em seguida, clique em Propriedades do Portão. Clique em Contar e % Pai para exibir os tamanhos e porcentagens. Registre o número de eventos e porcentagens para análise de dados adicional.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li>
<li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li>
<li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li>
<li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li>
<li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2%28-%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li>
<li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta%281%29-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li>
<li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li>
<li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).</li>
<li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li>
<li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%28gamma%29+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li>
<li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li>
<li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li>
<li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+knowledge+on+aetiology%2C+diagnosis%2C+management%2C+and+therapy+of+myocarditis%3A+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis%2C+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li>
<li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction%3A+an+experimental+medicine+safety+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li>
<li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4%2B+T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li>
</ol>

Luigi Adamo é co-fundador da i-Cordis, LLC, uma empresa focada no desenvolvimento de moléculas imunomoduladoras para o tratamento da insuficiência cardíaca, com um interesse específico em derivados da droga moduladora de células B pirfenidona. Os demais autores não têm conflitos a declarar.

Um crescente corpo de evidências indica que as células B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e do remodelamento/adaptação miocárdica à lesão 7,8,9,10,11,12,13,36. A citometria de fluxo é uma excelente ferramenta para estudar...

Os linfócitos B são células imunes altamente especializadas que desempenham um papel importante nas respostas imunes adaptativas e inatas1. Existem duas populações principais de células B: uma população menor de células B1 que são produzidas principalmente durante a vida embrionária, e uma população preponderante de células B2 que são produzidas na vida adulta na medula óssea1. Após a maturação na medula óssea, as células B migram para os órgãos linfoides primários e secundários. A partir daí, recirculam continuamente entre os órgãos linfoides que viajam através dos vasos sanguíneos e dos vasos linfáticos2. As células B expressam anticorpos específicos em sua superfície, que funcionam como receptores. Quando as células B encontram um antígeno que se liga ao seu receptor, um sinal de ativação pode ser acionado. As células B ativadas migram para o tecido onde o antígeno foi encontrado ou retornam à medula óssea, onde podem amadurecer em plasmócitos produtores de anticorpos 3,4.
Recentemente, tem sido apreciado que o coração abriga uma população considerável de células B. Estudos em roedores mostraram que as células B colonizam o coração precocemente durante o desenvolvimento embrionário5, e que as células B associadas à miocárdia são principalmente intravasculares, células B2 ingênuas aderidas ao endotélio6,7, com uma pequena porcentagem de células B1 7. Ainda existem muitas áreas de incerteza, mas os dados disponíveis indicam que as células B desempenham um papel importante tanto no coração ingênuo quanto no contexto da adaptação miocárdica à lesão.
Estudos no coração murino ingênuo mostraram que, no início do estudo, as células B miocárdicas estão localizadas principalmente no espaço intravascular, aderidas ao endotélio (>95% das células B cardíacas murinas estavam localizadas no espaço intravascular). Verificou-se que essas células B têm padrões de expressão gênica diferentes daqueles das células B circulantes isoladas do sangue periférico. A análise de corações ingênuos de animais deficientes em células B e controles singênicos descobriu que os animais sem células B tinham corações menores e maior fração de ejeção6. Todas essas evidências sugerem que as células B podem modular o crescimento miocárdico e/ou a função miocárdica, e que não apenas as células B intersticiais, mas também intravasculares, podem ser responsáveis por tais observações. Observou-se também que as células B modulam o fenótipo dos macrófagos residentes no miocárdio8.
Diversos estudos têm demonstrado que as células B desempenham um papel importante no contexto da adaptação miocárdica à lesão 8,9,10,11,12,13. As células B se acumulam transitoriamente no coração lesado, provavelmente através de um mecanismo dependente da CXCL13-CXCR511,13. A partir daí, as células B promovem o remodelamento cardíaco adverso por meio de vários mecanismos que incluem o recrutamento de monócitos mediados por citocinas 9,12. Além disso, as células B podem produzir anticorpos contra proteínas cardíacas que podem promover a extensão do dano cardíaco e o remodelamento cardíaco adverso através de diversos mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . As células B também podem exercer efeitos protetores sobre o coração lesado através da secreção de IL-1010.
À medida que cresce o número de grupos que investigam o papel das células B no coração ingênuo e lesado, torna-se cada vez mais importante definir protocolos compartilhados para quantificar e avaliar adequadamente as células B miocárdicas e, assim, evitar inconsistências que já começaram a aparecer na literatura. Até agora, as células B têm sido relatadas como sendo uma das células imunes mais prevalentes no coração de roedores7 e estando presentes em uma prevalência marcadamente menor do que as células mieloides26,27, ou como sendo bastante raras28. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda 7,9,13, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado29. Estudos sobre células imunes cardíacas raramente dão detalhes sobre as condições de perfusão e não há consenso sobre as condições de digestão. Como no coração de roedores uma grande proporção de células B é intravascular e a extração de células imunes do miocárdio é altamente dependente do método de digestão utilizado, as diferenças relatadas na literatura podem ser o resultado de diferenças na perfusão de órgãos e digestão tecidual.
Apresenta-se aqui um método detalhado para quantificação baseada em citometria de fluxo de células B miocárdicas murinas que maximiza o rendimento da recuperação de células B, otimizando as condições de perfusão e digestão e permite a discriminação de células B miocárdicas intravasculares versus extravasculares6. Esse protocolo é uma adaptação e otimização de outros protocolos similares que distinguem entre células imunes intravasculares e intersticiais 28,30,31.
Neste protocolo, padronizamos a perfusão miocárdica para eliminar as células B que flutuam no espaço intravascular sem remover as células B biologicamente relevantes aderidas ao endotélio microvascular. Além disso, com base em protocolos anteriores que descreveram o uso de injeção intravenosa de anticorpos para distinguir células imunes intravasculares de intersticiais32, e aproveitando o fato de que as células B expressam o marcador de superfície B22033, demonstramos como distinguir células B miocárdicas intravasculares versus extravasculares através da injeção intravascular de um anticorpo específico B220 imediatamente antes do sacrifício animal e da perfusão cardíaca. Este protocolo é relevante para a pesquisa de qualquer cientista interessado em incluir a análise de células B miocárdicas no coração ingênuo e ferido. A implementação generalizada deste protocolo reduzirá as inconsistências entre os grupos de pesquisa, permitirá a análise de alterações nos pools intravascular e extravascular de células B miocárdicas e, assim, reforçará o avanço das descobertas no campo da imunologia cardíaca.
Em resumo, o protocolo representa um fluxo de trabalho otimizado para quantificar e analisar as células B miocárdicas via citometria de fluxo e, ao mesmo tempo, distinguir entre as células localizadas no espaço extravascular e no espaço intravascular.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-camundongo/humano CD11b Anticorpo</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; g 200 &micro; L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) Filtro de Células, 40 &micro; m, Blue</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Tubo de Microcentrífuga Natural</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Injeção de Cloreto de Sódio, USP</td><td>114-055-101</td><td>Qualidade Biológica</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>1.5 mL Tubo de Microcentrífuga Natural</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Pontas de Filtro Graduadas TipOne</td><td>11213810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Pontas de Filtro Graduadas TipOne</td><td>11267810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga de 15 mL, Tampa de Vedação de Plugue, Polipropileno,</td><td>Válvula de Parada de</td> 1 Via 430052 <td>Livre</td><td></td>de RNase</tr><tr><td>, Policarbonato</td><td>SVPT951</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoetanol</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pontas de Filtro TipOne Graduadas</td><td>11208810</td> Válvula de Parada de 3 Vias <td>da USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>, Policarbonato</td><td>SVPT953</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno de 5 mL, estilo 12 x 75 mm</td><td>352054</td><td>Falcon, um</td> Tubo de Centrífuga de 50 mL da Marca <td></td>Corning</tr><tr><td>, Tampa de Vedação de Plugue, Polipropileno, Livre de RNase-/DNase</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK ( Tampão de Lise de Cloreto de Amônio-Potássio)</td><td>118-156-101</td><td>Qualidade</td><td>Osmolalidade Biológica: 290 + ou -5% mOsm/Kg Adaptador H20</td></tr><tr><td>4x50ml, para balde retangular de 250 mL no Rotor A-4-63</td><td>5810759005</td><td>Adaptador Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>para Tubos de Centrífuga de 15 mL, 9 Tubos por Adaptador, Fundo Cônico para uso com Modelo de Rotor A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador para 15 tubos de fundo redondo 2.6 - ndash; 7 mL, para balde retangular de 250 mL em Rotor A-4-62</td><td>22638246</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Folha de Alumínio 12 in x 75' Rolo .0007</td><td>UPC 109153</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td></tr> Câmara de <tr><td>Indução de Anestesia - Mouse</td><td>RWD-AICMV-100</td> Seringa <td>de</td> Ponta Deslizante BD Luer da Conduct Science <td></td></tr><tr><td>com agulha anexada 25 G x 5/8 pol., estéril, uso único, 1 mL</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de Insulina Ultra-Fina Brandzig 29G 1cc 1/2" Pacote com 100 CMD</td><td>2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19</td><td>Anticorpo 115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>CAPS para Tubos de Fluxo com malha de filtro 35 &micro; m, Posição dupla para tubos de 12 x 75 mm, estéril</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>Dióxido de Carbono USP E CGA 940&nbsp;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Copo de Forma Baixa, Vidro, 500 mL</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase 2</td><td>LS004176</td><td>Conector Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>latão cromado 1/4" fêmea NPT x 1/4" barb</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora Citômetro</td><td></td><td>de Fluxo Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 Mamilo 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet&nbsp; 3 - Controlador de pipeta eletrônico</td><td>4430000018</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Electronic Balance, AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5810R</td><td></td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Research plus pipetas variáveis de</td><td></td> 1 canal <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.1</td><td></td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>GLACIERbrand, Ice Pan de densidade tripla (IPAN-3100)</td><td>Z740287</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td><td>14025076</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostats, Reta</td><td>13018-14</td> Seringa Luer Slip da <td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>estéril, uso único, 20 mL</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson Underpads, Moderado</td><td>4033- CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator Balança Portátil Multiuso</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE anti-camundongo/humano CD45R/B220 Anticorpo</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 anti-camundongo CD45 Anticorpo</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; g 500 uL</td></tr><tr><td>Placa de Petri, Empilhável 35 mm x 10 mm Poliestireno Estéril</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Poderoso Iluminador LED de 6 Watts Duplo Pescoço de Ganso</td><td>LED-6W</td><td>AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Agulha 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Rato purificado Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td>The R Foundation</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>Regulador analítico de dois estágios entrega de 0-25 psi CGA320 Entrada de 3500 psi</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Rotor A-4-62, incl. 4 baldes retangulares de 250 mL</td><td>Rotor A-4-62</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, entupida, 10 mL, estéril, isento de pirogênios/endotoxinas, não citotóxico, 1 unid./blister</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG & Fita adesiva Co KG</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>L8394</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Reto, Macho Luer Lock x 1/8" Mangueira Barb; 1/EA</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>Std Wall Lab Tubing, Tamanho S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long</td><td>CG-730-003</td><td>Excelon Laboratory</td><td></td></tr><tr><td>Seringa PP/PE sem agulha, 3 mL</td><td>Z683566</td><td>Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>55-1199 (95-240)</td><td>Harvard Apparatus</td> Thomas Alarme Temporizador de 3 Canais <td></td></tr><tr><td>TM10500</td><td>9371W13</td><td>Suporte</td> para Tubos Thomas Scientific<td></td></tr><tr><td>, 12&nbsp; posições, 6 para 5.0&nbsp; mL e 15&nbsp; tubos de mL e 6 para 25&nbsp; mL e 50&nbsp; tubos mL, polipropileno, posições numeradas, autoclaváveis</td><td>30119835</td><td>Suporte para Tubos Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>, 12&nbsp; posições, para 5.0&nbsp; mL e 15&nbsp; Tubos mL, polipropileno, posições numeradas, autoclaváveis</td><td>30119827</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &times; O.D. 1/4 in. &times; 3/8 in.</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Dissecção VWR com Pino Guia com Pontas Curvas</td><td>89259-946</td><td>Avantor, por VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação VWR, Ponta Afiada, 4&frac12; "</td><td>82027-578</td><td>Avantor, da VWR</td><td></td></tr><tr><td>VWR Incubating Orbital Shaker, Modelo 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, da VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Kit de Viabilidade Fixável</td><td>423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação e análise baseada em citometria de fluxo de células b do miocárdio

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Um crescente corpo de evidências mostra que os linfócitos B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e da adaptação miocárdica à lesão. No entanto, a literatura relata dados contrastantes sobre a prevalência de células B miocárdicas. Foi relatado que as células B estão entre as células imunes mais prevalentes no coração do roedor ou estão presentes, mas com uma prevalência marcadamente menor do que as células mielóides, ou como sendo bastante raras. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado. A implementação de um método compartilhado e reprodutível para avaliar a prevalência de células B miocárdicas é fundamental para harmonizar as observações de diferentes grupos de pesquisa e, assim, promover o avanço do estudo das interações miocárdicas de células B. Com base em nossa experiência, as observações aparentemente contrastantes relatadas na literatura provavelmente decorrem do fato de que as células B miocárdicas murinas são principalmente intravasculares e conectadas ao endotélio microvascular. Portanto, o número de células B recuperadas de um coração murino é extremamente sensível às condições de perfusão usadas para limpar o órgão e ao método de digestão usado. Aqui relatamos um protocolo otimizado que leva em conta essas duas variáveis críticas de uma maneira específica. Este protocolo capacita a análise reprodutível, baseada em citometria de fluxo, do número de células B miocárdicas murinas e permite que os pesquisadores distingam células B miocárdicas extravasculares versus intravasculares.

Uma vez concluída a aquisição e coletados todos os eventos, os dados devem ser analisados de acordo com a prática padrão de citometria de fluxo. O foco da análise irá variar dependendo do objetivo individual de cada experimento. Neste caso, a quantificação de células B intravasculares e extravasculares foi buscada, e foi expressa como o número de células por mg de tecido.
Ao usar um citômetro espectral, recomenda-se iniciar a análise com um bloqueio inicial para remover detritos com tamanhos q...

Relatamos aqui um protocolo para a quantificação e diferenciação de linfócitos B miocárdicos com base em sua localização no espaço intravascular ou endotelial utilizando citometria de fluxo.

Quantificação e Análise Baseada em Citometria de Fluxo de Células B do Miocárdio

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

A literatura relata dados contrastantes sobre a prevalência de células B miocárdicas. Isso provavelmente decorre da variabilidade nas técnicas de perfusão e digestão. Nosso protocolo capacita a análise baseada em citometria de fluxo reprodutível em células B miocárdicas.Esta técnica maximiza o rendimento de recuperação de células B e reduz a variabilidade na contagem de citometria de fluxo entre células B e outras populações de amostras cardíacas. Este método otimizado de digestão e isolamento pode ser facilmente modificado para implementar um painel de anticorpos estendido para estudar diferentes tipos de células imunes no coração. O protocolo também pode ser aplicado a outros órgãos, como pulmão ou fígado, para estudar células B associadas a esses órgãos.Para começar, pese um rato macho de 12 semanas de idade. Carregue uma seringa de insulina de 310 cc com 100 microlitros da solução de anticorpos B220. Injete o anticorpo B220 diluído por injeção retro-orbital e proceda imediatamente à colheita e perfusão de órgãos.Após a eutanásia, segure a pele do rato com fórceps na área epigástrica. Faça uma abertura de dois milímetros na pele usando uma tesoura e use a pinça para descascar a pele para revelar a camada da fáscia. Corte no epigástrio através da fáscia e do peritônio.Aperte o processo xifoide usando pinça hemostática. Faça um corte vertical através da parede torácica ao nível da linha clavicular média de cada lado e levante a parede torácica anterior para revelar o conteúdo do mediastino. Segure a aorta com segurança por trás usando fórceps.Introduza a agulha da seringa no ápice do coração. Perfundido com três mililitros de HBSS a uma taxa de três mililitros por minuto. Corte a aorta e remova o coração.Lave o coração na placa de Petri com HBSS. Pese o coração isolado e observe o peso em miligramas. Pique o coração à temperatura ambiente em pequenos pedaços com uma lâmina.As peças do coração devem ter cerca de 1,5 milímetros de tamanho. Meça a massa de tecido cardíaco usando uma balança e coloque 60 miligramas do coração picado para ser digerido em um tubo de 15 mililitros no gelo com três mililitros de HBSS. Repita este processo para um rato que não recebeu a injeção de anticorpos B220 e coloque-o no tubo com três mililitros de tecido de controlo de referência marcado com HBSS.Adicione enzimas a cada tubo contendo tecidos picados. Adicione 0,5 microlitros por miligrama de DNase I, um 0,5 microlitros por miligrama de colagenase II e 0,2 microlitros por miligrama de hialuronidase. Coloque a reação de digestão no agitador por 30 minutos a 300 rotações por minuto.Os tubos são colocados no agitador em um pequeno ângulo, cerca de 25 graus de inclinação. Adicione sete mililitros de HBSS a cada um dos tubos de reação de 15 mililitros e centrifugar a 250 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a decantação do sobrenadante, ressuscite cada pellet em cinco mililitros de tampão de lise ACK.Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de adicionar 10 mililitros de PBS a cada tubo, misture e filtre em um tubo de 50 mililitros com um filtro de 40 micrômetros. Esmague quaisquer detritos no filtro com um êmbolo de seringa para garantir que todo o material passe pelo filtro.Depois de adicionar PBS através do filtro até que o volume atinja 25 mililitros por coração, adicione mais 25 mililitros de PBS ao tubo de tecido de controle de referência e divida o volume em dois tubos diferentes. Rotule um dos tubos não manchado e o outro vivo/morto. Após centrifugação a 250 G por cinco minutos a quatro graus Celsius, decantar o sobrenadante e ressuspender o tubo não corado em 100 microlitros de PBS e cada um dos outros pellets em 100 microlitros da solução de coloração viva/morta.Incube no gelo por 30 minutos no escuro. Depois de adicionar 500 microlitros de tampão FACS a cada amostra, transfira-o para um tubo FACS através de um filtro de 40 micrômetros. Depois de recusar os tubos FACS a 250 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante, ressuscite o pellet em 500 microlitros de tampão FACS.Adicionar 50 microlitros de solução de bloqueio FC a cada tubo, com excepção dos tubos não corados e vivos/mortos. Misture e incube por cinco minutos. Depois de adicionar 50 microlitros de solução de mistura de anticorpos a cada tubo, exceto para os tubos não corados e vivos / mortos, incube por 30 minutos no escuro, cobrindo o balde de gelo com papel alumínio.Tal como acontece com a mancha viva / morta, lave novamente com 500 microlitros de tampão FACS e ressuspenda em 300 a 500 microlitros de tampão FACS. Abra o software de controle do instrumento. Na parte superior da janela, selecione a guia Aquisição e clique em Novo.Na seção biblioteca, no campo Tipo a filtrar, digite PE, PerCP-Cy5.5, violeta brilhante 421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, selecionando o fluoro-4 e clicando em Adicionar depois de digitar cada um. Em seguida, clique em Avançar para prosseguir para a guia Grupos. Agora clique no símbolo com um tubo para adicionar o coração para a análise.Clique no grupo de referência e uma janela será exibida. Na coluna de tags fluorescentes, selecione Zombie Aqua como a tag fluorescente, excluindo quaisquer outras clicando no ícone vermelho da lixeira ao lado de cada uma. Em seguida, no ícone Tipo de Controle, selecione Células.Em seguida, clique em Salvar. Clique em Avançar. Em seguida, clique na guia Marcadores.Uma tabela será exibida. Digite o marcador de célula correspondente na primeira linha de cada coluna fluoro-4 e pressione Enter. Clique em Avançar duas vezes para ir para a guia Aquisição.Em Eventos a Registrar das amostras experimentais, tipo 10 milhões, e no mesmo campo para a linha do grupo de referência, tipo 200.000. Clique em Salvar e Abrir. No canto inferior esquerdo, clique em Controle de Instrumentos.Ajuste a tensão para FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selecione o Controle de Aquisição. Para a opção de taxa de fluxo, selecione Alta no menu suspenso.Vórtice o tubo cardíaco não manchado e coloque-o firmemente na porta de injeção da amostra. Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta. Em seguida, clique em Gravar e aguarde até que os eventos sejam registrados.Faça o mesmo para o tecido cardíaco manchado vivo / morto. Selecione o menu Unmix e defina os controles. Marque a caixa de seleção Autofluorescência como uma Marca Fluorescente.Em seguida, clique em Avançar para prosseguir para a guia Identificar Populações Positivas/Negativas. Nesta guia, um gráfico de área de dispersão para frente versus área de dispersão lateral será exibido. Clique e arraste os pontos do polígono para selecionar uma área entre 1 e 4 milhões no eixo da área de dispersão para a frente e entre 0,2 e 3 milhões no eixo da área de dispersão lateral.No próximo gráfico à direita, V5-A será exibido no eixo X. Mova os portões para selecionar metade do pico na extrema direita como positivo e uma região no lado esquerdo do gráfico como negativo. No gráfico intitulado Grupo de Referência - Não Manchado, selecione uma população em um intervalo semelhante.Para os não corados, nenhum positivo/negativo deve ser selecionado. Clique no botão Live Unmixing. Agora adquira as amostras experimentais, vortex o tubo e coloque-o com segurança no SIP.Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta. Em seguida, clique em Gravar no painel de Controle de Aquisição do software do citômetro e aguarde até que os eventos sejam registrados. Selecione a guia Planilha Não Mista Padrão.Crie um gráfico FCS-A versus SSC-A usando a ferramenta de gráfico de pontos na parte superior. Selecione eventos superiores a 0,4 milhão no eixo FSC-A e superiores a 0,8 milhões no eixo SSC-A usando a ferramenta de seleção de polígonos. Crie um novo gráfico clicando duas vezes na seleção e, nesse novo gráfico, clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo Y e selecione a mancha viva/morta.Clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo X e selecione Autofluorescência A.Selecione todos os eventos abaixo de 10 para o quinto no eixo vivo/morto. Estas são as células vivas. Clique duas vezes nesta seleção.No novo gráfico, selecione PerCP-Cy5.5A para o eixo X e SSC-A para o eixo Y. Selecione as populações do lado direito do PerCP-Cy5.5A. Estas são as células do sistema imunológico.Clique duas vezes na seleção. No novo gráfico, selecione FSC-A para o eixo X e altura de dispersão para a frente para o eixo Y. Selecione os eventos que seguem uma tendência na qual o valor FSC-A e o valor SSC-A são os mesmos.Isso seleciona células individuais e elimina dubletos. Clique duas vezes nesta seleção para exibir um novo gráfico na população de célula única positiva para CD45. No gráfico de população de célula única positiva para CD45, selecione violeta brilhante 421 no eixo X versus SSC-A no eixo Y.Selecione a população à direita no eixo violeta brilhante 421. Esta é a população de células B. Clique duas vezes nessa população para criar dois novos gráficos com a população de células B.Configure o primeiro gráfico de células B com PEA no eixo X e violeta brilhante 421A no eixo Y. A população à direita corresponde às células B intervasculares, e a população à esquerda representa as células B intersticiais. Selecione ambos.Configure o segundo gráfico de células B com Alexa Fluor 700A no eixo X e SSC-A no eixo Y. A população à esquerda corresponde às células CD11b-negativas, e os eventos à direita correspondem às células CD11b-positivas. Clique com o botão direito do mouse em cada seção e, em seguida, clique em Propriedades do portão.Clique em Contar e Pai para exibir o número de eventos e porcentagens das populações pai. Registre o número de eventos e porcentagens para análise de dados adicional. Após a remoção de dubletos em um coração ingênuo e não ferido, espera-se que cerca de 20% das células CD45-positivas sejam células B CD19-positivas.Dessas células, em média, 5,5% estão localizadas no espaço intersticial. 94,5% estão no espaço intravascular. De toda a população de células B encontrada no coração, apenas cerca de 1,6% corresponde a células B1 com base no marcador de superfície CD11b e os outros 98,4% correspondem a células B2.Ao analisar as células B miocárdicas via citometria de fluxo, é crucial perfundir e picar o coração adequadamente seguindo o protocolo. A filtração adequada do coração digerido também é essencial para maximizar a recuperação das células imunes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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