Name: Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprenda a registrar potenciais de ação intracelulares em cardiomiócitos usando poração a laser e matrizes de microeletrodos. Este método melhora a classificação de potenciais pró-arrítmicos para testes de segurança farmacológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer à Foresee Biosystems por emprestar o sistema IntraCell durante os estudos. Eles também gostariam de agradecer a Hae In Chang pela assistência técnica. Este trabalho recebeu financiamento do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo da convenção de subvenção n.º 964518 (ToxFree), do Programa do Conselho Europeu de Inovação Horizonte Europa da UE, projeto SiMulTox (convenção de subvenção n.º 101057769), e do Ministério de Estado de Baden-Wuerttemberg para os Assuntos Económicos, Trabalho e Turismo.

1. Preparação de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas
NOTA: Os cardiomiócitosiCell 2 (referidos como cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas [iPSCs]) foram preparados de acordo com o protocolo fornecido pelo fornecedor. O protocolo será resumido brevemente na seção a seguir.
<ol><li>Descongelar o meio de descongelamento e de manutenção a 4 °C durante 24 horas antes da utilização.</li>
	<li>Preparar o revestimento de fibronectina dissolvendo fibronectina estéril em água estéril a uma concentração de 1 mg/mL. Congele esse estoque em alíquotas (por exemplo, 25 μL por alíquota). Diluir a solução-mãe alíquota 1:20 em solução salina balanceada de Dulbecco (dPBS) estéril.</li>
	<li>Revestir os campos dos eletrodos dos MEAs previamente autoclavados sob o exaustor de fluxo laminar, em termos de gotículas em condições estéreis com fibronectina usando uma pipeta de 10 μL. Para isso, solte 5 μL da solução de revestimento de fibronectina nos campos do eletrodo e observe a formação de uma gotícula no topo da área do eletrodo. Certifique-se de não tocar nos eletrodos sensíveis. NOTA: Para manter as condições estéreis, transfira o chip MEA para uma placa de Petri estéril antes de removê-lo do exaustor de fluxo laminar.</li>
	<li>Incubar os MEAs revestidos durante 1 h a 37 °C numa incubadora de preferência.</li>
	<li>Descongelar o criovial contendo os cardiomiócitos em banho-maria a aproximadamente 37 °C durante 2 minutos até que reste apenas um pouco de cristal de gelo. Transfira a solução celular suavemente para um tubo de 50 ml.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de meio de chapeamento ao criovial vazio. Transfira a solução gota a gota durante um período de tempo de 90 s para o tubo de 50 mL para reduzir o choque osmótico. Adicione suavemente mais 8 mL de meio de chapeamento no tubo.</li>
	<li>Misture cuidadosamente a suspensão celular utilizando uma pipeta de 10 ml. Calcule o número total de células viáveis usando citometria de fluorescência automatizada. O número deve estar próximo do número na ficha técnica fornecida pelo fabricante.</li>
	<li>Gire a solução celular para baixo por 3 min a 200 x g à temperatura ambiente. Remova o sobrenadante por aspiração usando uma pipeta de vidro presa a um sistema de bombeamento. Ajuste o número de células entre 6.000 e 15.000 células viáveis/μL. NOTA: O número de células geralmente está no intervalo fornecido acima, mas pode variar dependendo do respectivo fornecedor.</li>
	<li>Remova a solução de revestimento que foi aplicada na etapa 1.3 da área do eletrodo MEA usando uma pipeta de 10 μL diretamente antes da semeadura da célula. Semeia as células imediatamente após a remoção para evitar a secagem do revestimento. Para isso, semeie as células gota a gota a 4 μL para MEAs de 6 poços e MEAs de 1 poço nos campos de eletrodos da mesma maneira que feito com o revestimento.</li>
	<li>Permitir que as células adiram por 1 h na incubadora a 37 °C e 5% de CO2 antes de encher os poços com o meio de revestimento estéril aquecido a aproximadamente 37 °C a 200 μL para MEA de 6 poços e 1 mL para MEA de poço único sob o exaustor de fluxo laminar.</li>
	<li>Realizar uma troca completa do meio 48 h após o revestimento sob o exaustor de fluxo laminar. Para isso, remova o meio de revestimento por aspiração usando uma pipeta de vidro presa a um sistema de bombeamento. Em seguida, adicione 200 μL de meio de manutenção estéril aquecido a 37 °C aos poços.</li>
	<li>Realize mudanças completas de mídia a cada dois dias.</li>
	<li>Comece a medir as células 5-8 dias após o descongelamento. Realize uma mudança completa de meio 2 h antes de iniciar os experimentos.</li>
</ol>2. Gravações MEA
NOTA: O dispositivo usado para transformar o sinal FP em liAP consiste em um microscópio vertical e um laser de 1064 nm.
<ol><li>Coloque o sistema MEA em cima do dispositivo com o suporte do chip MEA centralizado sobre o orifício da objetiva. Posicione o MEA configurado de modo que a objetiva esteja diretamente sob o orifício do sistema MEA para permitir que o laser se concentre nos eletrodos.</li>
	<li>Transfira o chip MEA com as células cultivadas da incubadora para a configuração MEA 15 minutos antes do registro, permitindo que as células se recuperem da perturbação mecânica.</li>
	<li>Limpe cuidadosamente as almofadas e pinos de contato usando isopropanol e um cotonete para diminuir os níveis de ruído. Coloque o MEA cuidadosamente na configuração do MEA. Posicione o chip MEA com o logotipo na parte inferior do lado superior esquerdo (MEA de 6 poços) ou com o eletrodo de referência à esquerda (MEA de poço único).</li>
	<li>Ajuste o aquecimento integrado ao sistema MEA para 38 °C. Coloque uma pequena câmara em cima do chip MEA para perfundir constantemente as células com carbogênio umidificado (5% CO 2 e 95% O2) para recriar as condições da incubadora e evitar a evaporação.</li>
	<li>Feche a tampa do dispositivo. O interruptor de segurança integrado só permite que o laser seja ativado se a tampa estiver fechada sobre o chip MEA. Defina o filtro do sistema MEA usando o programa de configuração MEA para 0,1 Hz ou menos high-pass e 3.500 Hz low-pass.</li>
	<li>Use o software MC_Rack (software de gravação) ou qualquer software alternativo para gravação. Ajuste a faixa de entrada de acordo com suas necessidades, garantindo que o sinal não satura o amplificador e a taxa de amostragem (por exemplo, 20 kHz). Use a função de exibição de longo prazo do software para verificar a gravação.</li>
</ol>3. Poração celular induzida por laser
<ol><li>Depois de inserir o chip MEA na configuração MEA e configurar o software, inicialize a mecânica a laser usando o software FB Alps (software de inicialização).</li>
	<li>Primeiro, clique no botão Inicialização . No final da inicialização, o ponto laser virtual estará no poço D para um MEA de 6 poços e no canto inferior esquerdo para um MEA de poço único, respectivamente.</li>
	<li>Mova o ponto laser virtual com Ctrl + clique do mouse no meio do eletrodo D5 e ajuste o foco. Ajuste o foco com Ctrl + rolagem com a roda do mouse.</li>
	<li>Pressione o botão Set P1 ( Definir P1). O ponto laser virtual se moverá automaticamente para o poço F. Repita o processo com o eletrodo F5 e selecione Definir P2.</li>
	<li>Após este procedimento, o ponto laser se moverá para o poço B. Repita o mesmo processo com o eletrodo B5 e pressione Set P3 no software. O sistema agora está alinhado.</li>
	<li>Ajuste a potência do laser e o tempo de processo de acordo com as necessidades de suas células. Aqui, foram utilizados 40% de potência e 25% de tempo de processo.</li>
	<li>Para ativar o laser, clique no botão Laser Off , que aparecerá como laser ligado. Mude para o software de gravação, escolha um nome de arquivo e clique no botão Gravação Vermelha seguido pelo botão Reproduzir na parte superior da janela para gravar a medição.</li>
	<li>Registre uma linha de base de 60 s antes de abrir as células com o laser. Volte para o software de inicialização.</li>
	<li>Desative os eletrodos a serem excluídos pelo laser no mapa virtual do lado direito usando Ctrl + clique do mouse. Selecione os eletrodos de interesse ativando-os na representação da matriz no lado direito da janela do software.</li>
	<li>Para iniciar o laser, use Alt + clique do mouse e selecione o eletrodo central deste poço. Isso inicia o laser para abrir automaticamente as células em cada eletrodo deste poço. Repita para cada poço. O laser abrirá automaticamente todos os eletrodos previamente ativados do poço selecionado.</li>
</ol>4. Manuseamento e aplicação de medicamentos
<ol><li>Prepare todas as substâncias a serem usadas para testes de drogas recentemente no dia das medições. Certifique-se de que a concentração final de aplicação seja 10 vezes maior no meio para fazer uma diluição de 1:10 nos poços.</li>
	<li>Dissolva a nifedipina, E4031 e dofetilida primeiro em DMSO em concentração de mM e, em seguida, em meio a 10x da concentração desejada. Nunca exceda uma concentração final de DMSO de 0,1% no poço.</li>
	<li>Registre a atividade de linha de base por 60 s. Inicie a poração induzida por laser, conforme descrito na etapa 3 do protocolo, resultando em uma transformação do FP em forma de liAP.</li>
	<li>Aplique todos os medicamentos como concentração única por poço. Remova 20 μL de meio por poço para MEAs de 6 poços e 100 μL para MEAs de poço único, respectivamente. Adicione 20 μL ou 100 μL, dependendo do tipo de MEA, da solução-mãe da droga a ser medida no poço e cuidadosamente pipete para cima e para baixo 2-3 vezes. Realizar pelo menos três repetições de cada droga e concentração para alcançar relevância estatística.</li>
	<li>Deixe os compostos lavarem por 300 s. Durante esse tempo, a forma liAP pode se transformar novamente em forma de FP. Novamente, induza a poração induzida por laser e registre possíveis efeitos induzidos por compostos no liAP por mais 60 s.</li>
</ol>5. Exportação de dados
<ol><li>Selecione os eletrodos relevantes reproduzindo a gravação no software de gravação. Use MC_DataTool para converter arquivos MC_Rack em arquivos ASCII .txt.</li>
	<li>Clique em Arquivo > Abrir MCD > Selecione um arquivo MC_Rack. Clique no botão txt (texto azul).</li>
	<li>Selecione um eletrodo. O eletrodo selecionado será mostrado na lista do lado direito.</li>
	<li>Clique em Procurar para selecionar a pasta e alterar o nome do novo arquivo .txt. Clique em Salvar.</li>
	<li>Desmarque o eletrodo exportado e selecione o próximo eletrodo a ser exportado. Repita o procedimento para todos os eletrodos de interesse.</li>
</ol>6. Tratamento de dados e análise estatística
<ol><li>Importe rastreamentos binários convertidos em R19. Visualize/analise os dados usando scripts personalizados contendo os seguintes pacotes: dplyr, tidyr e ggplot220,21,22.</li>
</ol>

<ol><li>Shah, M., Akar, F. G., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of arrhythmias.</a> Circulation. 112 (16), 2517-2529 (2005).</li>
<li>Bowlby, M. R., Peri, R., Zhang, H., Dunlop, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hERG+%28KCNH2+or+Kv11.1%29+K%2B+channels%3A+screening+for+cardiac+arrhythmia+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">hERG (KCNH2 or Kv11.1) K+ channels: screening for cardiac arrhythmia risk.</a> Current Drug Metabolism. 9 (9), 965-970 (2008).</li>
<li>Priest, B. T., Bell, I. M., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hERG+potassium+channel+assays+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Role of hERG potassium channel assays in drug development.</a> Channels (Austin). 2 (2), 87-93 (2008).</li>
<li>Fenton, F., Cherry, E., Glass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Scholarpedia%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia.</a> Scholarpedia. 3 (7), 1665(2008).</li>
<li>Tisdale, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+arrhythmias%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug-induced arrhythmias: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 142 (15), 214-233 (2020).</li>
<li>Kramer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MICE+models%3A+superior+to+the+HERG+model+in+predicting+Torsade+de+Pointes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MICE models: superior to the HERG model in predicting Torsade de Pointes.</a> Scientific Reports. 3, 2100(2013).</li>
<li>Rampe, D., Roy, M. -L., Dennis, A., Brown, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+proarrhythmic+effects+of+cisapride+%28Propulsid%29%3A+high+affinity+blockade+of+the+human+cardiac+potassium+channel+HERG%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the proarrhythmic effects of cisapride (Propulsid): high affinity blockade of the human cardiac potassium channel HERG.</a> FEBS Letters. 417 (1), 28-32 (1997).</li>
<li>Girouard, S. D., Laurita, K. R., Rosenbaum, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+properties+of+cardiac+action+potentials+recorded+with+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Unique properties of cardiac action potentials recorded with voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 7 (11), 1024-1038 (1996).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Hou, J. H., Kralj, J. M., Douglass, A. D., Engert, F., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mapping+of+membrane+voltage+and+calcium+in+zebrafish+heart+in+vivo+reveals+chamber-specific+developmental+transitions+in+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mapping of membrane voltage and calcium in zebrafish heart in vivo reveals chamber-specific developmental transitions in ionic currents.</a> Frontiers in Physiology. 5, 344(2014).</li>
<li>Ronzhina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Di-4-ANEPPS+modulates+electrical+activity+and+progress+of+myocardial+ischemia+in+rabbit+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Di-4-ANEPPS modulates electrical activity and progress of myocardial ischemia in rabbit isolated heart.</a> Frontiers in Physiology. 12, 1-15 (2021).</li>
<li>Beck, C., Gong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed%2C+bright%2C+red+fluorescent+voltage+sensor+to+detect+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A high-speed, bright, red fluorescent voltage sensor to detect neural activity.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15878(2019).</li>
<li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li>
<li>Kovacs, G. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+sensors+with+living+cellular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%22%5BJournal%5D)">Electronic sensors with living cellular components.</a> Proceedings of the IEEE. 91 (6), 915-929 (2003).</li>
<li>Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+field+potentials+measured+on+a+multi+electrode+array+in+pharmacological+toxicity+screening+on+primary+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 497 (4), 1135-1141 (2018).</li>
<li>Deo, M., Akwaboah, A., Tsevi, B., Treat, J. A., Cordeiro, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rapid+delayed+rectifier+K%2B+current+in+human+induced+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Stem+Cell+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Role of the rapid delayed rectifier K+ current in human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes.</a> Archives of Stem Cell and Therapy. 1 (1), 14-18 (2020).</li>
<li>Hondeghem, L. M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+test+in+isolated+female+rabbit+heart+reliably+identifies+action+potential+duration+prolongation+and+proarrhythmic+drugs%3A+importance+of+triangulation%2C+reverse+use+dependence%2C+and+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Blinded test in isolated female rabbit heart reliably identifies action potential duration prolongation and proarrhythmic drugs: importance of triangulation, reverse use dependence, and instability.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 41 (1), 14-24 (2003).</li>
<li>Dipalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+action+potential+recordings+from+cardiomyocytes+by+ultrafast+pulsed+laser+irradiation+of+fuzzy+graphene+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Intracellular action potential recordings from cardiomyocytes by ultrafast pulsed laser irradiation of fuzzy graphene microelectrodes.</a> Science Advances. 7 (15), (2021).</li>
<li>R Core Team. R: A language and environment for statistical computing: R Foundation for Statistical Computing. , Vienna Austria. Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2021).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer-Verlag. New York. (2009).</li>
<li>Wickham, H., Girlich, M. tidyr: Tidy messy data: R package version 1.2.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2022).</li>
<li>Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A grammar of data manipulation. R package version 1.0.6. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tidyr.tidyverse.org">https://tidyr.tidyverse.org</a> (2021).</li>
<li>Godfraind, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of calcium channel blockers.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 286(2017).</li>
<li>Vater, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology+of+4-%282%27-nitrophenyl%29-2%2C6-dimethyl-1%2C4-dihydropyridine-3%2C5-dicarboxylic+acid+dimethyl+ester+%28Nifedipine%2C+BAY+a+1040%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arzneimittelforschung%22%5BJournal%5D)">Pharmacology of 4-(2'-nitrophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester (Nifedipine, BAY a 1040).</a> Arzneimittelforschung. 22 (1), 1-14 (1972).</li>
<li>Kim, I., Boyle, K. M., Carroll, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+development+of+E-4031-sensitive+potassium+current+in+rat+carotid+chemoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postnatal development of E-4031-sensitive potassium current in rat carotid chemoreceptor cells.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1469-1477 (2005).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiwell+cardiac+%C2%B5GMEA+platform+for+action+potential+recordings+from+human+iPSC-derived+cardiomyocyte+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).</li>
<li>Fendyur, A., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+on-chip%2C+in-cell+recordings+from+cultured+cardiomyocytes+by+arrays+of+gold+mushroom-shaped+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Toward on-chip, in-cell recordings from cultured cardiomyocytes by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes.</a> Frontiers in Neuroengineering. 5, 21(2012).</li>
<li>Hayes, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+action+potential+measurements+from+intact+cardiac+monolayers+with+multiwell+microelectrode+array+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel method for action potential measurements from intact cardiac monolayers with multiwell microelectrode array technology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11893(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este método inovador demonstra uma nova forma de investigar in vitro a modulação farmacológica do potencial de ação cardíaca durante a aplicação de compostos de ferramentas farmacológicas cardioativas.
As gravações clássicas de MEA permitem gravações de FP, que são a derivada da PA cardíaca14. Esse registro indireto envolve o curso temporal da despolarização e, assim, elimina características essenciais do AP. Além disso, embora a mudança de tensão transcelular de um AP atinja tipicamente valores de aproximadamente 100 mV, a amplitude geral do FP permanece comparativamente baixa, com amplitudes de pico entre vários 100 μV e baixos valores de mV de um dígito. Devido ao princípio de registro, a fase de repolarização é pequena; em muitos casos, é meramente detectável e muitas vezes de forma pouco clara, dificultando a definição do final do PF. A abertura da membrana celular nos permite obter acesso à voltagem intracelular, descobrindo assim o curso temporal da PA cardíaca. Existem várias vantagens deste método de gravação em comparação com as gravações FP. Em primeiro lugar, a amplitude do sinal é mais proeminente, proporcionando uma relação sinal-ruído superior. Em segundo lugar, a forma de onda resulta em uma melhor detecção da repolarização. Em terceiro lugar, a forma da fase de repolarização contribui com insights sobre o modo de ação do composto de teste, fornecido pela inclinação do relaxamento do sinal. E, por fim, esse método oferece uma sensibilidade aprimorada para detectar efeitos adversos críticos de medicamentos, demonstrada pelo exemplo de registro exibido na Figura 6 para a ocorrência de EADs no liAP, mas não no FP.
Até agora, existem duas maneiras de obter acesso à PA intracelular. A primeira é obtida por eletroporação26,27. Aqui, pulsos de tensão curtos e fortes aplicados através dos eletrodos de gravação podem abrir a membrana celular28. A segunda possibilidade é a abertura da membrana através de um pulso de laser, fazendo uso de um fenômeno físico denominado ressonância plasmônica de superfície, como demonstrado aqui. Uma das vantagens em comparação com a eletroporação é o aumento da probabilidade de aberturas consecutivas. Devido ao ponto laser altamente focado (1-3 μm), este efeito é muito limitado localmente ao eletrodo de interesse. Curiosamente, o início do liAP não alterou a propagação do sinal do sincício cultivado. Isso indica que, embora a integridade celular esteja danificada, os cardiomiócitos não parecem se despolarizar através do orifício na membrana.
Existem limitações para este método. Como com a eletroporação, a abertura da membrana, na maioria dos casos, não dura durante todo o curso experimental. As configurações mínimas de potência e duração do pulso de laser necessárias para a abertura estável do tipo específico de célula de interesse precisam ser definidas independentemente antes dos experimentos. Descobrimos (não mostrado) que os parâmetros variam drasticamente entre diferentes tipos de células (no nosso caso, vários cardiomiócitos primários e derivados de hiPS). Isso evita o estresse desnecessário sobre as células durante o experimento de teste composto e resulta em dados mais confiáveis e reprodutíveis. É de importância crítica ajustar o eixo z para fornecer um foco claro nas células e nos eletrodos. Uma imagem de câmera desfocada produz em um ponto de laser localizado em um nível abaixo do ideal, potencialmente resultando na incapacidade de abrir a membrana celular. Mesmo com os parâmetros mais bem ajustados, o efeito liAP é transitório e a amplitude diminui ao longo do tempo. Além disso, o acesso ao espaço intracelular das células varia entre as induções de liAP, tanto dentro de aberturas consecutivas no mesmo eletrodo quanto entre eletrodos. Isso resulta em alta variabilidade da amplitude do liAP. A razão ainda não é totalmente compreendida. Possíveis explicações incluem problemas mecânicos, como uma deriva do foco do laser ou localização subcelular diferente da abertura da membrana. Isso torna a análise dos efeitos de amplitude dos compostos de teste complicada neste momento. Além disso, o registro da atividade elétrica por um sistema MEA requer filtragem passa-alta para compensar a inevitável deriva da linha de base. Embora no sistema aqui utilizado, essa filtragem tenha sido ajustada para 0,1 Hz (a menor configuração de filtro disponível para este sistema), os efeitos de filtragem durante a fase de platô ainda eram visíveis, resultando em uma tendência lenta da deflexão de voltagem em direção à linha de base durante a fase de platô da PA cardíaca. Isso é especialmente problemático com APs subjacentes extensivamente longos, como os cardiomiócitos iCell2 derivados de iPSC usados aqui, que já geram AP >700 ms sob condições de controle. O uso de sistemas com menor filtragem pode conservar melhor a forma do AP e permitir um acesso ainda melhor ao curso temporal da fase de repolarização.

A contribuição elétrica de um batimento cardíaco resulta de uma interação complexa e precisamente cronometrada de muitos canais e transportadores cardíacos, bem como da propagação precisamente sintonizada de sinais elétricos através do miocárdio1. A alteração desses mecanismos estreitamente coordenados (por exemplo, o uso de drogas) pode resultar em consequências graves para a função do coração (ou seja, arritmia com risco de vida)2,3. As arritmias são definidas como batimentos cardíacos irregulares que alteram o ritmo normal do coração, o que pode ter consequências fatais. Eles podem ser causados tanto pelo início prejudicado de uma onda de excitação cardíaca quanto pela propagação anormal da excitação cardíaca4, o que, por sua vez, resulta em uma disfunção do mecanismo de bombeamento do coração.
Muitos candidatos a fármacos altamente potentes devem ser excluídos de investigações futuras durante a fase inicial de desenvolvimento de fármacos devido ao seu potencial (pró-) arrítmico 2,3. Eles modulam os principais canais cardíacos (por exemplo, o canal genético humano relacionado ao éter-a-go-go-go [hERG]) que são responsáveis pela formação e terminação do potencial de ação cardíaca normal, bem como pela subsequente propagação do sinal5.
As empresas farmacêuticas usam rotineiramente medições de patch-clamp ou matrizes de microeletrodos (MEA) para investigar potenciais efeitos cardiotóxicos fora do alvo induzidos por candidatos a medicamentos. Os registros patch-clamp permitem decifrar o impacto de substâncias nos canais iônicos cardíacos e analisar o potencial de ação cardíaca transcelular com alta resolução espaço-temporal 6,7. No entanto, as desvantagens desta técnica incluem baixo rendimento com patch-clamp manual e aplicabilidade limitada de automação devido à dependência deste método de células em suspensão. Além disso, os efeitos crônicos não podem ser investigados devido à invasividade do método. Finalmente, normalmente apenas células únicas são estudadas simultaneamente, em vez de todo o sincício cardíaco, tornando impossível abordar informações sobre a propagação do sinal.
Corantes sensíveis à voltagem são valiosos para investigar de forma não invasiva potenciais de ação cardíaca e arritmias induzidas por drogas8. Eles permitem a investigação da atividade de célula única e do sincício. As desvantagens deste método são os efeitos citotóxicos dos corantes em si ou do produto de reação durante a iluminação. São utilizados para experimentos agudos e dificilmente aplicáveis para estudos de longo prazo 9,10,11. As proteínas sensíveis à voltagem como alternativas têm avançado significativamente nos últimos dois anos em termos de usabilidade e sensibilidade, mas requerem modificação genética das células de interesse e carecem de alta resolução temporal em comparação com as técnicas eletrofisiológicas12.
Informações da mais recente iniciativa CiPA13 afirmam que os MEAs são amplamente utilizados em exames de segurança cardíaca como uma abordagem eletrofisiológica alternativa, pois representam uma ferramenta poderosa e bem estabelecida para investigar a função cardíaca e a farmacologia de segurança. Os cardiomiócitos são cultivados como um sincício diretamente em cima dos chips, e os potenciais de campo extracelular (PFs) são registrados de forma não invasiva através de microeletrodos integrados ao substrato. Este princípio de gravação permite a realização de rastreios de maior rendimento ao longo de vários dias, o que os torna adequados para pesquisas farmacêuticas sobre efeitos crônicos. A forma de onda FP resultante é uma derivada da AP intracelular14. Parâmetros como a taxa de batida, a amplitude da parte inicial do PF e a duração do FP são facilmente acessíveis15. Outros critérios essenciais, como a diferenciação entre prolongamento e triangulação do PF (um importante marcador de proarritmia16,17) são inacessíveis devido ao efeito filtrante da CA da técnica. Além disso, a detecção de outros pequenos eventos proarrítmicos, como pós-despolarizações precoces e tardias (EAD e DAD, respectivamente) são muitas vezes facilmente negligenciados devido à sua pequena amplitude.
Aqui descrevemos um método para obter acesso ao potencial de membrana intracelular através da abertura da membrana dos cardiomiócitos. O dispositivo IntraCell (doravante denominado dispositivo de gravação intracelular) permite repetidas aberturas de membrana de cardiomiócitos cultivadas em cima dos eletrodos MEA utilizando um feixe de laser de nanossegundos altamente focado através de um fenômeno físico específico (ressonância plasmônica de superfície)18. Como resultado, a gravação transita de um FP regular para um AP intracelular (AP induzido por laser, liAP). O protocolo mostra como isso permite obter acesso a aspectos cinéticos da forma de onda que não podem ser facilmente capturados pela análise de PFs. Este método representa uma ponte entre o patch-clamp intracelular tradicional e as gravações de MEA. A tecnologia é, portanto, uma poderosa extensão dos atuais métodos de avaliação de segurança cardíaca.

<table><tbody><tr><td>1 chip MEA de poço</td><td>Sistemas Multicanal MCS GmbH</td><td>890301</td><td></td></tr><tr><td>6 poços MEA chip</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td>7600069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck KGaA</td><td>20-139 Solvente Sigma-Aldrich</td><td>para medicamentos</td></tr><tr><td>Dofetilide</td><td>ALOMONE LABS SEDE DE ISRAEL</td><td>D-100</td><td>Medição de Drogas</td></tr><tr><td>dPBS</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>12037539</td><td>Coating</td></tr><tr><td>E4031</td><td>ALOMONE LABS SEDE DE ISRAEL</td><td>E-500</td><td>Medição de Medicamentos</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>FB Alps versão 0.5.005</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Merck KGaA</td><td>11051407001</td><td></td></tr><tr><td>Revestimento iCell cardiomiócitos</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>IntraCell</td><td>Foresee Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>CN09.1</td><td>Para limpeza de almofadas de contato MEA</td></tr><tr><td>Meio de manutenção</td><td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>#M1003</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>MC_Data Tool</td><td>Multi Channel Systems MCS GmbH</td><td></td><td>Exportação de dados</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Sistemas multicanal MCS GmbH</td><td></td><td>Gravação MEA</td></tr><tr><td>MEA 2100 - 2x60 - sistema</td><td>Sistemas multicanal MCS GmbH</td><td>890485</td><td>Para gravações MEA</td></tr><tr><td>Nifedipina</td><td>Merck KGaA</td><td>N7634 Sigma-Aldrich</td><td>Meio</td></tr><tr><td>de Plaqueamento</td> de Medição de Drogas <td>FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI)</td><td>M1001</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>VWR International, LLC</td><td>1304-1</td><td>limpeza de MEAs</td></tr></tbody></table>

medições do potencial de ação induzidas por laser de cardiomiócitos em matrizes de microeletrodos para maior previsibilidade da farmacologia de segurança

Laser-Induced Action Potential-Like Measurements of Cardiomyocytes on Microelectrode Arrays for Increased Predictivity of Safety Pharmacology

A arritmia cardíaca induzida por drogas com risco de vida é frequentemente precedida por potenciais de ação cardíaca (PA) prolongados, comumente acompanhados por pequenas flutuações do potencial de membrana proarrítmica. A forma e o curso temporal da fração repolarizante da PA podem ser fundamentais para a presença ou ausência de arritmia.
As matrizes de microeletrodos (MEA) permitem fácil acesso aos efeitos de compostos cardiotóxicos através de potenciais de campo extracelular (FP). Embora seja uma ferramenta poderosa e bem estabelecida em pesquisa e farmacologia de segurança cardíaca, a forma de onda FP não permite inferir a forma original da PA devido ao princípio de registro extracelular e à filtragem intrínseca de corrente alternada (CA) resultante.
Um novo dispositivo, descrito aqui, pode abrir repetidamente a membrana de cardiomiócitos cultivados em cima dos eletrodos MEA em vários pontos de tempo de cultivo, usando um feixe de laser de nanossegundos altamente focado. A poração do laser resulta na transformação do sinal eletrofisiológico de FP para APs intracelulares (AP induzida por laser, liAP) e permite o registro de deflexões de tensão transcelular. Esse acesso intracelular permite uma melhor descrição da forma da PA e uma classificação melhor e mais sensível dos potenciais proarrítmicos do que os registros regulares de MEA. Este sistema é uma extensão revolucionária dos métodos eletrofisiológicos existentes, permitindo uma avaliação precisa do efeito cardiotóxico com todas as vantagens das gravações baseadas em MEA (experimentos fáceis, agudos e crônicos, análise de propagação de sinal, etc.).

O sistema de gravação usado para registrar a atividade elétrica de cardiomiócitos cultivados consistia em um sistema MEA padrão equipado com um aquecedor e uma câmara de carbogênio conectada a um computador. O sistema foi montado em cima do dispositivo de gravação intracelular, que por sua vez foi montado em cima de uma pequena unidade antivibração (Figura 1A-B).
Os cardiomiócitos 2 derivados de iPSC começaram a bater espontaneamente dentro de 2-3 dias após o descongelamento (dias in vitro, DIV) e foram visíveis ao microscópio. A partir da DIV 4, a frequência de batimento tornou-se regular, e potenciais de campo extracelular (FP) com amplitudes de pico a pico do componente despolarizante entre 1 a 5 mV puderam ser detectados na maioria dos eletrodos dentro dos respectivos poços dos chips MEA. A atividade elétrica pôde ser detectada em mais de 95% dos poços sob investigação. A partir da DIV 7 em diante, a probabilidade de descolamento celular aumentou, impossibilitando o uso adicional desses poços.
O software para controlar a abertura da membrana induzida por laser permite ajustar tanto a potência quanto o tempo de processo do laser que medeia a abertura da membrana celular apenas no eletrodo sob investigação (Figura 1C), enquanto outros eletrodos no respectivo poço não são afetados. Embora configurações muito conservadoras não tenham alterado a forma de onda da FP, configurações muito altas resultaram na lesão putativa dos cardiomiócitos, indicada por batidas vigorosas, mas transitórias, ou perda do sinal. Quando ajustado para uma configuração de 40% de potência e 25% de tempo de processo bem tolerado pelas células, o acionamento do pulso de laser resultou em múltiplas alterações na forma de onda registrada (veja a Figura 1D para uma gravação exemplar). Nessas condições, nenhuma alteração do material do eletrodo foi observada macroscopicamente. A amplitude do sinal registrado aumentou maciçamente em 4,1 ± 0,41 (n = 20, intervalo de 1,34-8,83) vezes, analisadas a partir de um subconjunto de registros escolhidos aleatoriamente, resultando em amplitudes entre 7 e 22 mV. Além disso, a forma de onda transformou-se de uma forma padrão de FP com deflexão de tensão rápida, bifásica e transitória no início, seguida por uma fase de platô de volta na linha de base e uma pequena deflexão indicando o final do FP para uma forma mais próxima de um AP registrado intracelularmente com um rápido aumento, fase de platô despolarizado estendido e uma fase de repolarização com um undershoot abaixo da linha de base (Figura 1E ). Definimos essas deflexões de tensão como AP induzida por laser (liAP). Na maioria dos casos, a transição foi transitória e pelo menos parcialmente invertida dentro de 5 minutos. A propagação do sinal dentro do sincício cardíaco permaneceu inalterada após a indução do liAP (Figura 2), indicando que o sincício remanescente não foi afetado pelo dano potencial do pulso laser.
As semelhanças com os APs registrados intracelularmente permitiram extrair parâmetros do liAP que não são acessíveis aos FPs (para parâmetros exemplares, ver, por exemplo, a Figura 3A), mais proeminentemente a medição da duração do liAP em pontos de tempo específicos (por exemplo, a 20%, 50% e 90%) (Figura 3B), análogo ao APD20/50/90 comumente usado para a descrição de APs.
Em seguida, testamos a resposta dos cardiomiócitos abertos a laser a compostos de ferramentas farmacológicas cardioativas comumente usados. Um projeto de protocolo exemplar pode ser encontrado na Figura 3C. Como a transformação do liAP nem sempre persistiu durante todo o experimento, a aplicação do composto foi realizada como uma concentração única por poço, e não de forma cumulativa para reduzir o tempo total de registro. No entanto, foi necessário reabrir as células ou abrir outra área do eletrodo antes da aplicação do composto de teste.
A adição do bloqueador de canais específico do tipo L Ca 2+, Nifedipina23,24, reduziu a fase de platô do liAP de maneira dependente da concentração e, assim, encurtou todo o liAP (Figura 4A,B). Esse encurtamento foi comparável à análise obtida a partir de PFs de cardiomiócitos de eletrodos não manipulados (Figura 4C), indicando que esse método de registro não apresentou efeitos adversos em comparação com os registros clássicos de PF.
E4031 inibe a repolarização do canal de potássio Kv1.11 (hERG) relevante25 e leva ao comportamento arrítmico dos cardiomiócitos em concentrações aumentadas. Semelhante à análise obtida a partir dos registros de FP, o E4031 aumentou a duração do liAP de forma dependente da concentração (Figura 5). Além disso, em concentrações de 0,01 μM e superiores, pequenas deflexões de tensão positiva no final do liAP foram visíveis. Essas deflexões tornaram-se mais proeminentes com concentrações mais altas, indicando uma nova despolarização transitória, ao contrário dos FPs, onde essas deflexões eram virtualmente invisíveis (ver Figura 5B-C, traços superiores (FP) vs inferiores (liAP). Esse comportamento é conhecido como pós-despolarização precoce (EAD). Na concentração mais alta de 0,1 μM, esses EADs escalaram ao longo do tempo em batimentos ectópicos, que são potenciais de ação prematura (Figura 5C). Tanto o EAD quanto as batidas ectópicas são indicadores-chave da atividade proarrítmica. Ao final do exemplo mostrado na Figura 5D, a atividade elétrica resultou em batida arrítmica. Além disso, as relações concentração-resposta-exibidas entre os registros de FP e liAP foram correspondentes (Figura 5E). No entanto, existe uma variabilidade mais considerável nos dados do PF resultante da fraca componente de repolarização dos PFs em concentrações mais elevadas do composto de ensaio. Parece ser a natureza característica dos cardiomiócitos derivados de iPSC2 tender a gerar APs infisiologicamente longas sob condições de controle também (durações de AP &gt; 700 ms). O sistema MEA aplicou uma filtragem intrínseca de 0,1 Hz AC, que por sua vez resultou em uma forma parcialmente filtrada do liAP, embora sem ocluir as informações qualitativas sobre o início e a terminação da PA subjacente.
Verificou-se que a ocorrência inicial de deflexões de tensão proarrítmica poderia ser detectada em concentrações mais baixas em liAPs em comparação com os registros de FP. Mostrado na Figura 6 é o registro da atividade elétrica durante a aplicação de Dofetilida a uma concentração de 3 μM. A gravação foi obtida no mesmo poço. Embora tanto o FP quanto o liAP apresentassem durações de aproximadamente 2 s, a forma de onda do FP foi discreta, apresentando deflexões repolarizantes regulares. Ao mesmo tempo, no final dos liAPs, EADs em diferentes magnitudes tornaram-se visíveis. Este aumento na sensibilidade farmacológica de segurança relevante apoia ainda mais a descoberta de que os liAPs induzidos pela ressonância plasmônica de superfície permitem uma melhor qualificação da fase de repolarização e, assim, ajudam a aprender mais sobre o modo de ação dos compostos de teste sob investigação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2.jpg"> Figura 1: A configuração de gravação intracelular e gravações exemplares. (A) Visão geral da configuração. (B) Vista superior do sistema de gravação com amplificador de gravação MEA aberto. (C) Software de inicialização com o mapa MEA virtual no lado direito. 1: mesa anti-vibração, 2: sistema de gravação intracelular, 3: tampa de proteção a laser, 4: câmara de carbogênio umidificada, 5: sistema de aquecimento MEA, 6: placa de interface MEA, 7: chip MEA de 1 poço dentro do amplificador de gravação. (D) Exemplos de gravação de um eletrodo antes e depois da indução de liAPs. Topo: gravação de aproximadamente 6 min. Linhas pontilhadas marcam as áreas expandidas mostradas na parte inferior. (E) FP ampliado (em cima) e liAP (em baixo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig1v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig02.jpg"> Figura 2: O padrão de propagação do sinal permanece conservado após a indução do liAP. Codificação de cores falsas da propagação do sinal da onda de excitação dentro do sincício. Azul indica cedo (a partir de -4 ms); vermelho indica pontos de tempo tardios (+3 ms) do sinal obtido no eletrodo de referência E54, conforme indicado pela barra de cores. O sinal viaja de cima à direita para o canto inferior esquerdo da matriz de eletrodos. (A) Antes da indução do liAP, (B) 1 min após a indução do liAP. (C) 4 min após a indução do liAP. O símbolo Flash indica o ponto de indução do laser no eletrodo 64. Observe que nenhuma diferença na direção geral de propagação é visível. Retângulos pretos indicam dados inválidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2.jpg"> Figura 3: Definição de parâmetros FP/liAP e protocolo de gravação . (A) Parâmetros que podem ser extraídos do FP clássico. (B) Parâmetros adicionais que podem ser obtidos de liAPs. (C) Linha do tempo de medição de medicamentos. Da esquerda para a direita: registro de controle para 60 s, indução de liAP, gravação de liAP para 60 s, aplicação de drogas, tempo de lavagem 300 s, re-indução de liAP, gravação de liAP para 60 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig3v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2.jpg"> Figura 4: A nifedipina encurta o liAP cardíaco de forma dependente da concentração. (A) Topo: Traços de FP no controle (azul) e na presença de 0,3 μM de nifedipina (vermelho). Os rastreamentos são exibidos com um deslocamento do eixo y para melhor visualização. Fundo: traços de liAP a partir da mesma gravação de MEA, resultando em um encurtamento do liAP combinado com um aumento na taxa de batida. (B) Superposição de liAPs únicos durante o controle (azul) e aplicação de diferentes concentrações de Nifedipina (vermelho). a: 0,01 μM, b: 0,1 μM e c: 0,3 μM. Observe o encurtamento da duração do liAP com concentrações crescentes. (C) A relação concentração-resposta da largura do sinal obtida a partir de registros FP (preto) e liAP (vermelho). Os dados são de n = 3 experimentos e normalizados para controle. As barras de erro indicam o erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig4v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2.jpg"> Figura 5: E4031 induz (pró-) comportamento arrítmico. (A) FP (superior) e liAP (inferior) em condições de controle. (B-C) FPs e liAPs foram registrados em diferentes momentos após a aplicação do E4031 (0,1 μM). Após 80 s, os primeiros EADs são visíveis no final do liAP (B; marcado por uma seta vermelha). Os EADs se convertem em batimentos ectópicos após 320 s na presença do composto de teste (C). (D) Após 530 s, o sincício cardíaco entra em um estado taquicárdico. Traço representado a partir da gravação do liAP. (E) Relação concentração-resposta de largura FP (preto) e liAP (vermelho). Dados de n = 4 experimentos, normalizados para controle. As barras de erro indicam o erro padrão da média. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig5v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64355/64355fig06.jpg"> Figura 6: A detecção de eventos proarrítmicos é mais sensível em liAPs do que em FPs . (A) registro de FP e (B) registro de liAP dentro do mesmo poço durante a aplicação de Dofetilida 3 μM. Embora no final de alguns liAPs, os EADs sejam detectáveis, eles permanecem indetectáveis em gravações de FP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64355/64355fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Life-threatening drug-induced cardiac arrhythmia is often preceded by prolonged cardiac action potentials (AP), commonly accompanied by small ...

Este método permite registrar potenciais de ação intracelulares semelhantes em MEA'S tradicionais, permitindo assim uma melhor descrição da forma da PA e uma classificação mais sensível dos potenciais pró-arrítmicos. Em comparação com os registros típicos do potencial de campo, a forma potencial real intracelular fornece mais informações sobre a autorização precisa dos canais iônicos subjacentes. Quando aplicado a cardiomiócitos derivados de pacientes clínicos através da tecnologia de células-tronco, o método pode contribuir para o diagnóstico causal, e personalização de C R P e, doenças cardíacas como arritmias Nossa técnica, Karin Gebhardt irá demonstrar o cultivo de cardiomiócitos.Para começar a revestir os campos de eletrodos dos MEAs previamente autoclavados, Dropwise com fibronectina usando uma pipeta de 10 microlitros sob o exaustor de fluxo laminar. Para reduzir o choque osmótico, transfira a solução de revestimento gota a gota por 90 segundos para o tubo de 50 mililitros contendo cardiomiócitos descongelados. Adicione suavemente oito mililitros de meio de chapeamento no tubo e misture a suspensão celular com cuidado.Usando uma pipeta de 10 mililitros, remova o sobrenadante, garantindo não descartar o pellet e ajuste o número de células para a concentração final. Antes do assento da célula, remova a solução de revestimento aplicada da área do eletrodo MEA usando uma pipeta de 10 microlitros. Para evitar a secagem da semente de revestimento as células imediatamente, adicionando quatro microlitros das células gota a gota sobre os campos de eletrodos para ambos, seis poços MEA e um poço M E A.Agora, permita que as células adiram aos poços por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Sob o exaustor de fluxo laminar, adicione 200 microlitros e um mililitro de chapeamento estéril médio aquecido a 37 graus Celsius para seis Well MEA e MEA de poço único, respectivamente. Para gravações MEA, coloque o sistema MEA em cima do dispositivo com o suporte do chip MEA centralizado sobre o orifício da objetiva. Em seguida, permita que o laser se concentre nos eletrodos posicionando a configuração do MEA, de modo que a objetiva esteja diretamente sob o orifício do sistema MEA.Para permitir que as células se recuperem da perturbação mecânica, transfira o chip MEA com as células cultivadas da incubadora para a configuração MEA 15 minutos antes da gravação. Em seguida, limpe as almofadas de contato e os pinos com cuidado, usando um cotonete de isopropanol para diminuir os níveis de ruído. Coloque o MEA cuidadosamente na configuração do MEA e posicione o chip MEA de seis poços com o número de série visível no lado direito ou um único chip MEA de poço com o eletrodo de referência à esquerda.Agora, defina o sistema de aquecimento integrado MEA para 38 graus Celsius. Feche a tampa do dispositivo, pois o interruptor de segurança integrado só permite que o laser seja ativado se a tampa estiver fechada sobre o chip MEA. Usando o programa de configuração MEA, defina o filtro do sistema MEA passa-alta e passa-baixa para 0,1 hertz ou menos e 3.500 hertz, respectivamente.Use o software de rack MC ou qualquer software alternativo para gravação. Ajuste o intervalo de entrada de acordo com o experimento. Garantir que o sinal não satura o amplificador e a taxa de amostragem.Use a função de exibição de longo prazo do software para verificar a gravação. Depois de inserir o chip MEA na configuração do MEA e configurar o software, inicialize a mecânica do laser usando o software FB ALP. Agora, clique no botão de inicialização.No final da inicialização, o ponto laser virtual estará no poço D para um MEA de seis poços e no canto inferior esquerdo para um único MEA de poço, respectivamente. Em seguida, usando a tecla de controle com um clique do mouse, mova o ponto laser virtual para o meio do eletrodo D cinco e ajuste o foco segurando a tecla de controle e rolando com a roda do mouse. Como alternativa, use a função de foco automático.Pressione o botão definido P um e o ponto laser virtual se moverá automaticamente para o poço F.O sistema agora está alinhado. Ajuste a potência do laser e o tempo de processo de acordo com os requisitos experimentais. Para ativar o laser, clique no botão de desligamento do laser que aparecerá como laser ligado, Alterne para o software de gravação.Escolha um nome de arquivo e clique no botão vermelho de gravação seguido pelo botão de reprodução na parte superior da janela para gravar a medição. Antes de abrir as células com o laser, grave uma linha de base por 60 segundos. Volte para o software de inicialização e desative os eletrodos a serem excluídos pelo laser no mapa virtual no lado direito da janela do software.Para iniciar o laser use Alt clique do mouse, e selecione o eletrodo central deste poço. Isso inicia o laser para abrir as células em cada eletrodo deste poço automaticamente, repita para cada poço para abrir todos os eletrodos previamente ativados deste poço selecionado. Dissolva a concentração milimolar de Nifedipina E-40 31 e Dofetilida em DMSO primeiro e, em seguida, em meio completo até 10 vezes a concentração desejada.Nunca exceda uma concentração final de DMSO de 0,1% no poço. Registre a atividade de linha de base por 60 segundos. Inicie a peração induzida pelo laser como demonstrado anteriormente, resultando em uma transformação do FPS em liAPs.Aplique todas as drogas como concentração única por poço. Remova 20 microlitros e 100 microlitros de meio por poço de seis poços e MEAs de poço único, respectivamente. Adicione 20 microlitros ou 100 microlitros da solução de estoque de drogas a ser medida no poço.Dependendo do tipo MEA, e cuidadosamente pipetar para cima e para baixo duas a três vezes. Deixe os compostos lavarem por 300 segundos. Durante esse tempo, a forma liAP pode se transformar na forma FP.Novamente, o laser induzido induziu a peração e registrou possíveis defeitos induzidos por compostos no liAP por mais 60 segundos. A adição de nifedipina reduziu a fase de platô dos liAPs de maneira dependente da concentração e, assim, encurtou todo o liAP. Esse encurtamento foi comparável aos potenciais de campo dos cardiomiócitos de eletrodos não manipulados.O E-40 31 inibiu a repolarização dos canais de potássio relevantes do KV um ponto 11 e levou ao comportamento arrítmico dos cardiomiócitos em concentrações aumentadas. Além disso, o E-40 31 aumentou a duração do liAP de maneira dependente da concentração. No final do liAP foram observadas pequenas deflexões de tensão positiva a 0,1 micromolar, que se tornaram mais proeminentes com concentrações mais elevadas, indicando uma nova despolarização transitória chamada EAD's.Na concentração mais alta de 0,1 micromolar, esses EADs escalaram ao longo do tempo em batimentos ectópicos. Que são potenciais de ação prematura. EAD e batidas ectópicas são indicadores-chave da atividade pró-arrítmica.E no final, a atividade elétrica resulta em batidas arrítmicas. As relações de resposta à concentração correlacionaram-se com os registros de FP's e liAP. Além disso, na presença de dofetilida, tanto FP quanto liAP apresentaram durações de aproximadamente dois segundos dentro do mesmo poço, a forma de onda FP apresentou deflexões regulares de repolarização.Enquanto no liAP EAD's são detectáveis. É importante ajustar o foco antes que cada melomen, pois uma imagem de microscópio fora de foco pode afetar a abertura das células. Além disso, o potencial de ação é tomado logo após a opterperação deve ser usado para análise.Esta técnica é mais sensível na detecção de efeitos arrítmicos prévios em comparação com o MEA padrão, permitindo mais precisamente a detecção de efeitos adversos de compostos.

laser-induced-action-potential-like-measurements-cardiomyocytes-on

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

Apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos eletromecânicos da ativação do GtACR1 em cardiomiócitos de coelho. Fornecemos informações detalhadas sobre isolamento celular, cultivo e transdução adenoviral, e sobre experimentos funcionais com as técnicas de patch-clamp e fibra de carbono.

Avaliação eletromecânica da atividade cardiomiocito optogeneticamente modulada

Este protocolo descreve o procedimento de secção e cultivo de fatias cardíacas humanas para testes de drogas pré-clínicos e detalha o uso de mapeamento óptico para o registro de tensão transmembrana e sinais de cálcio intracelular simultaneamente a partir dessas fatias.

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

Aprenda a registrar potenciais de ação intracelulares em cardiomiócitos usando poração a laser e matrizes de microeletrodos. Este método melhora a classificação de potenciais pró-arrítmicos para testes de segurança farmacológica.

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança (Vídeo) | JoVE Journal

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Explorar mais vídeos