Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares

Este protocolo fornece um método de solução rápida e de tamanho específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando os parâmetros de classificação por citometria de fluxo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter populações representativas de pequenas vesículas extracelulares usando apenas dispersão direta versus dispersão de tamanho. Comece executando o procedimento de inicialização padrão do classificador de células de fluxo.

Ligue a máquina pressionando o botão de inicialização e clique no botão liga/desliga do laser no painel de controle do laser. Pressione o botão de troca de tanques no submenu Smart Sampler para pressurizar os fluidos. Use um jato e um bico de ar de 50 micrômetros limpos ultrassonicamente e instale-o até o conjunto do bico.

Ajuste a pressão para 80 SI para o fluido da bainha e 80,3 SI para o fluxo da amostra no console de pressão. Pressione o botão de fluxo da bainha inicial para iniciar o fluxo da bainha. Clique no botão de bolha no submenu Smart Sampler para desborbulhar automaticamente por 10 minutos e, em seguida, desativá-lo.

Para alinhar o fluxo e determinar o ponto laser, ligue a luz da câmara de iluminação para visualizar o fluxo sobre os orifícios. Ajuste os micrômetros para cima e para baixo, esquerdo e direito, e dianteiro e traseiro para centralizar o fluxo no orifício e focalizar o fluxo. Abra todos os obturadores a laser, selecione a guia de interceptação de laser e fluxo e, em seguida, pressione o botão de seta verde continuamente conforme solicitado para concluir o processo de calibração de interceptação a laser e alinhamento do bico.

Acesse a tela de alinhamento a laser fino. Selecione o laser de 640 nanômetros e o canal passa-banda 772 bar 44 como parâmetro do eixo x e o laser de 405 nanômetros e o canal passa-banda de 448 bar 59 como parâmetro do eixo y. Pressione o seletor de parâmetros de gatilho e escolha o parâmetro de dispersão direta do laser de 488 nanômetros.

Em seguida, dilua as partículas fluorescentes do arco-íris adicionando uma gota em um mililitro de água destilada dupla para uma concentração final de uma vez 10 até o sexto grânulo por mililitro. Abra a porta da câmara de amostra e carregue um tubo de partículas fluorescentes do arco-íris preparadas. Pressione o botão de início da amostra e ajuste os micrômetros para cima e para baixo para otimizar a intensidade da fluorescência, tornando cada sinal o mais intenso possível.

Pressione o botão Start Quality Control ou QC no painel de controle touchscreen para executar o QC automaticamente. Em seguida, pressione o botão de inicialização IntelliSort. O instrumento ajusta automaticamente a frequência e a amplitude de oscilação da gota para obter o atraso da queda de aproximadamente 25 e ser capaz de visualizar o ponto de ruptura da queda claramente.

Em seguida, pressione o botão drop delay e o botão manter. Selecione tubo como o tipo de saída de classificação. Coloque um suporte de tubo de 15 mililitros na câmara de classificação.

Ligue a tensão da placa e ajuste a tensão da placa para aproximadamente 4.000 volts. Em seguida, ative o padrão de teste selecionando o botão de configuração de fluxo. Ajuste o controle deslizante da fase de carga e o controle deslizante de deflexão para garantir que a imagem do fluxo esteja alinhada com o tubo de coleta.

Em seguida, selecione o botão de marca de seleção. Faça login na estação de trabalho do Summit no computador. Crie um novo protocolo no menu principal do arquivo.

Em seguida, crie um gráfico de pontos selecionando a guia histograma no painel de controle do Summit Software. Escolha a dispersão para frente como o parâmetro do eixo x e a dispersão lateral como o parâmetro do eixo y. Em seguida, clique com o botão direito do mouse no eixo do novo gráfico de pontos na área de trabalho e apresente a dispersão direta e lateral na forma logarítmica.

Selecione a guia de aquisição e localize o painel de parâmetros de aquisição. Habilite todos os sinais no submenu de parâmetros de ativação. Escolha a dispersão direta como o parâmetro de gatilho e defina o limite de 0,01.

Ajuste a tensão e o ganho de dispersão direta e dispersão lateral em 250 e 0,6 para garantir que os eventos dentro do gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral e as populações sejam separados. Diluir as microesferas de poliestireno fluorescente em suspensões de 100, 200 e 300 nanômetros adicionando um microlitro de microesferas a um mililitro de água destilada dupla. Em seguida, carregue a suspensão da microesfera sucessivamente.

Selecione Iniciar no menu de aquisição do Summit Software para gravar 20.000 eventos e clique em Parar após gravar os eventos. Clique com o botão direito do mouse no gráfico de pontos de dispersão frontal versus dispersão lateral para criar retângulos e arraste para redimensionar. Reposicione as regiões de ruído eletrônico e população de microesferas de 100 nanômetros clicando com o botão direito do mouse nas regiões para renomeá-las como R7 e R4, respectivamente.

Repita os passos para enquadrar as microesferas de 200 e 300 nanômetros com retângulos sucessivamente e renomeie-as como R5 e R6, respectivamente. Finalmente, determine a região de classificação de 50 a 200 nanômetros com base no ruído eletrônico e na posição das partículas de 200 nanômetros para defini-la como R8. Edite as decisões de classificação no painel de lógica de classificação e estatísticas clicando duas vezes no campo em branco do fluxo esquerdo ou L1 e selecionando a região chamada R8 para criar a lógica de classificação. Escolha o modo de interrupção de pureza e selecione um envelope de gota acima de uma gota para o fluxo L1.

Carregar amostra de 500 microlitros de vesículas extracelulares previamente preparadas ou mistura de EVs. Pressione o botão Iniciar no menu de aquisição no Summit para adquirir os dados e clique em Parar. Em seguida, pressione Iniciar no menu de classificação para coletar pequenas vesículas extracelulares de 50 a 200 nanômetros ou sEV em um tubo centrífugo de 15 mililitros.

A análise por citometria de fluxo de microesferas de poliestireno de tamanho padrão para localizar a faixa de tamanho de 50 a 200 nanômetros no gráfico de dispersão direta versus dispersão lateral revelou sinais de partículas distinguíveis. R4, R5 e R6 referem-se às posições de partículas de 100, 200 e 300 nanômetros, respectivamente. R7 é o ruído eletrônico como limite de detecção para partículas de 50 nanômetros e R8 representa a faixa de posição de partículas de 50 a 200 nanômetros.

A distribuição granulométrica da mistura de EVs derivada de células pancreáticas por nanopartículas, ou NTA, estava na ampla faixa de 40 a 400 nanômetros após ultracentrifugação. A classificação por citometria de fluxo foi realizada para isolar e purificar o sEV de 50 a 200 nanômetros dentro da região R8. A qualidade do isolamento foi verificada por NTA e verificou-se que a faixa de tamanho de partícula de sEV após a classificação estava entre 50 e 200 nanômetros.

A presença de sEV foi ainda observada por TEM e os sEVs isolados foram confirmados como contendo marcadores de CD6, CD63 e CD81 pela Análise de Western Blot. Este método permite a separação de pequenas vesículas extracelulares e a classificação ou análise da expressão genética de pequenas vesículas extracelulares, abrindo inúmeras aplicações de investigação a jusante.