Determinação da Cinética de Ativação In Vitro e Celular para Aptamers de RNA Fluorogênico

O estudo da cinética do aptâmero fluorogênico in vitro e celular permite ao usuário avaliar se as interações do corante aptâmero são rápidas o suficiente para estudar um processo de interesse em tempo real. As técnicas apresentadas permitem medições cinéticas quantitativas dentro e fora da célula, qualquer uma das quais pode ser relevante dependendo da aplicação do aptâmero. Os métodos apresentados podem ser aplicados a qualquer sistema de RNA fluorogênico, incluindo aptâmeros alternativos e biossensores baseados em RNA para pequenas moléculas.

Para começar, configure o programa de renaturação de RNA a partir do termociclador. Crie o programa selecionando criar novo programa"adicionar nova fase"e adicionar nova etapa"várias vezes para adicionar etapas específicas de temperatura antes de pressionar salvar"Ajustar configurações adicionais de acordo com o programa. Para renaturalizar os RNAs de espinafre dois e brócolis, prepare dois caules micromolares de cada RNA em água destilada dupla em um tubo de PCR de parede fina de 0,5 mililitro.

Em seguida, adicione volumes iguais de tampão de renaturação de dois x para fazer uma solução de RNA micromolar. Coloque os tubos no termociclador. Abra o programa de renaturação salvo e pressione "Em seguida, configure o programa injetor leitor de placas.

No leitor de placas de fluorescência, selecione temperatura" e defina-a para 37 graus Celsius. Antes de iniciar a cinética, certifique-se de que a temperatura se equilibrou a esse valor. Abra o software leitor de placas.

Selecione configurações"e, em seguida, a visualização de aquisição"para inserir o programa para medições cinéticas, selecione loop"para cada poço. Em seguida, defina a configuração de linha de base para 60 leituras de linha de base e configurações de injeção inteligente para injeção de 10 microlitros. Defina a fluorescência lê o comprimento de onda de excitação para 448 nanômetros, o comprimento de onda de emissão para 506 nanômetros e o cartucho para mono.

Defina o tempo total de leitura para 10 minutos com intervalo de leitura de 0,5 segundos. Defina PMT e óptica para seis flashes por leitura. Em seguida, loop de entrada para o próximo poço.

Para preparar o injetor leitor de placas, selecione injetar "no leitor de placas e forneça uma placa de coleta de resíduos quando solicitado. Em seguida, selecione "lavar" e limpe o tubo de injeção seguindo as instruções no leitor de placas com um mililitro de volumes de água destilada dupla, etanol a 75% e, em seguida, água destilada. Em seguida, selecione aspirar"permitindo que o injetor ejete o excesso de líquido.

Em seguida, selecione prime"para preparar o injetor com dois 260 microlitros de 100 micromolares D F H B I.To realizar um experimento de cinética adicione 80 microlitros de mistura mestre de buffer de ligação a um poço de uma placa inferior bem clara de 96. Em seguida, adicione 10 microlitros de RNA renaturado. Deixe a placa e a solução D F H B I no injetor, para equilibrar a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, selecione o poço a ser analisado nas configurações do software na área de leitura. Em seguida, na guia inicial, selecione "executar" para executar o programa de cinética descrito anteriormente. Repita esse processo até que todos os experimentos estejam completos.

Após a corrida, lave o injetor para remover a solução D F H B I restante do tubo de injeção, conforme demonstrado anteriormente. Para configurar os arquivos experimentais, ligue o citômetro de fluxo e o computador. Crie um novo arquivo na guia do explorador de experimentos clicando com o botão direito do mouse no nome de usuário do citômetro de fluxo.

Em seguida, selecione novo experimento"na janela suspensa e quando uma nova janela na tela do computador aparecer, selecione o tipo de experimento como tubos"e, em seguida, selecione ok"No novo arquivo de experimento, clique com o botão direito do mouse na pasta do grupo e selecione adicionar novo tubo de amostra"Rotule os tubos de amostra para cada ponto de tempo específico e replique clicando com o botão direito do mouse na amostra" e selecionando renomear" no menu suspenso. Em seguida, prepare uma solução de célula diluída adicionando 1,5 mililitros de um X P B S e três microlitros de células induzidas em meios de IA em um tubo de cultura. Antes de adicionar corante, meça a fluorescência de fundo das células para observar a dobra se ligar ao longo do tempo.

Uma vez que o corante é adicionado, coloque o tubo de cultura contendo células em P B S no elevador do tubo de amostra e levante o elevador para a agulha de injeção de amostra. Em seguida, selecione o arquivo de amostra adequado na guia do painel de coleta e clique em gravar"Uma vez que a execução esteja completa, abaixe o elevador do tubo de amostra com o tubo de cultura à mão. Para iniciar uma etapa de enxágue, para lavar o sistema fluídico e minimizar o transporte entre cada amostra biológica replicada.

Para mover para o exemplo a seguir, selecione o próximo arquivo de exemplo clicando no ícone de seta para a direita próximo ao nome do tubo de amostra sob o ícone de registro. Para medir a fluorescência de células com corante adicione 1,4 microlitros de corante concentrado em um X P B S com células, para dar uma concentração final de 50 micromolares D F H B I um T.Fixe a tampa do tubo de cultura e inverta três a cinco vezes para misturar a solução uniformemente. Em seguida, remova a tampa e coloque o tubo de cultura no elevador do tubo de amostra.

Depois de elevar o suporte para a agulha de injeção de amostra, clique no ícone "record" sob o arquivo de amostra apropriado. Em seguida, inicie um temporizador pressionando start"Cinética in vitro de aptâmeros fluorogênicos espinafre dois e brócolis, exibiu cinética de associação bifásica para ligação ao corante D F H B I. Para ambos os aptâmeros, os dados cinéticos foram melhor ajustados por associação bifásica do que por uma fase em longos tempos de medição.

A melhor curva de ajuste determinou as constantes de taxa e os valores de meia-vida para as associações rápidas e lentas. O espinafre dois, no estado de competência de ligação, mostrou um ligamento mais rápido do que o brócolis. A cinética da segunda fase para ambos os aptâmeros é semelhante e pode corresponder a um passo comum de limitação da taxa.

As curvas cinéticas dos aptâmeros são compostas por um grau semelhante de RNAs associados rápidos. Para as células que expressam espinafre dois RNA T, a intensidade média de fluorescência ou M F I aumenta imediatamente no ponto de tempo zero. Além disso, a fluorescência celular atingiu seu valor máximo equilibrado de M F I em cinco minutos.

Em contraste, as células de controle mostraram baixa fluorescência de fundo e nenhuma alteração nos valores de M F I com adição de D M S O Os métodos apresentados permitem que os pesquisadores determinem como podem fazer sensores baseados em RNA em aptâmeros fluorogênicos mais rapidamente.