Name: Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a isolar progenitores eritróides BFU-e e CFU-e de tecido de camundongo por citometria de fluxo. Esta técnica de alta pureza permite estudos avançados de doenças eritróides em modelos animais.

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Este trabalho é apoiado pelos subsídios do NIH R01DK130498, R01DK120639 e R01HL141402

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com os protocolos animais A-1586 e 202200017 aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Massachusetts Chan Medical School.
NOTA: Dois protocolos são detalhados aqui: primeiro, análise citométrica de fluxo (seção 1), seguida por ajustes de protocolo para classificação de citometria de fluxo (seção 2). O protocolo abaixo usa um citômetro/classificador de fluxo com 10 canais. Um exemplo de configuração é fornecido na Tabela 1, referida na etapa 1.14.5. Também é possível executar este protocolo com apenas nove canais; veja a legenda na Tabela 2.
1. Análise citométrica de fluxo
<ol><li>Eutanasie camundongos adultos (>6 semanas de idade) Balb/C ou C57BL6 usando um método apropriado aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (por exemplo, inalação de CO2 seguida de luxação cervical). Para a análise citométrica de fluxo, a medula óssea (BM) de um único camundongo será suficiente. Para a classificação, o número de mouses depende das aplicações a jusante. O rendimento celular para cada população é dado a seguir (etapa 2.3.3).</li>
	<li>Colheita de tecidos:<ol><li>Preparar 5 mL de tubos de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) contendo 3 mL de tampão de coloração frio (4 °C) ("SB5": solução salina tamponada com fosfato (PBS), albumina sérica bovina a 0,2% (BSA), glicose a 0,08%, EDTA a 5 mM) sobre gelo. Use isso para colocar tecidos colhidos.</li>
		<li>Prepare tubos separados para cada tecido dissecado de cada rato. Não agrupe tecidos de vários camundongos.</li>
		<li>Colha ambos os fêmures e ambas as tíbias. Remova todos os músculos dos ossos antes de colocá-los no tubo com SB5.</li>
		<li>Dissecar o baço através de uma incisão no lado esquerdo do abdômen.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de células da medula óssea:<ol><li>Coloque os fêmures e tíbias recém-dissecados diretamente no tampão de coloração a frio (SB5) e mantenha os tubos no gelo até que estejam prontos para extrair a medula óssea (BM). Coloque uma argamassa esterilizada limpa no gelo em um balde. Transfira os ossos para a argamassa juntamente com o SB5 do tubo.</li>
		<li>Recorte aproximadamente 1 mm das extremidades de cada osso com uma tesoura de dissecação para que o orifício do osso se torne apenas visível.</li>
		<li>Use uma agulha de 26 G e uma seringa de 3 mL cheia de SB5 para liberar a medula dos ossos e coletá-la na argamassa. Repita o processo 3-5 vezes usando buffer fresco de cada vez até que os ossos pareçam incolores.</li>
		<li>Filtre a medula lavada através de um filtro de malha de 100μm e colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mL colocado no gelo.</li>
		<li>Use a argamassa e o pilão para esmagar os ossos lavados em 5-10 mL de SB5. Filtrar a mistura de ossos triturados e tampão através do filtro celular de 100 μm e agrupar com células recolhidas no passo 1.3.4.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de células do baço:<ol><li>Configure um filtro de malha de 100 μm em um tubo de centrífuga vazio de 50 mL colocado no gelo. Coloque um único baço no filtro de malha.</li>
		<li>Adicione 0,5-1 mL de SB5 ao baço para garantir que ele não seque.</li>
		<li>Usando o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 3 mL ou 5 mL, amasse o baço através da malha. Adicione mais SB5, 5 mL de cada vez, e continue a amassar até que todas as células tenham sido coletadas no tubo.</li>
	</ol></li>
	<li>A partir deste ponto, a medula óssea e as células esplênicas são tratadas da mesma maneira.</li>
	<li>Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante usando uma configuração de aspiração a vácuo.</li>
	<li>Para fazer uma suspensão de célula única, ressuspeite as células em 2 mL de SB5 e pipete para cima e para baixo 50 vezes usando um P1000 com uma grande ponta de orifício (ver Tabela de Materiais). Estes têm amplas aberturas de ponta para ajudar a evitar danos às células frágeis.</li>
	<li>Para contar as células, ressuspenda pipetando para cima e para baixo 20 vezes. Diluir as células na proporção de 1:100 em SB5. Misture 10 μL das células diluídas com 10 μL de azul de tripano e conte com um hemocitômetro e/ou contador celular.</li>
	<li>Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células a 33 x 106 células vivas/ml em SB5.</li>
	<li>Preparar o cocktail Lin-FITC misturando volumes iguais de cada anticorpo na Tabela 3.</li>
	<li>Prepare as células para controles de cor única e controles de "Fluorescência menos um" (FMO). Realizar as etapas 1.11-1.12 em paralelo com a preparação e coloração das células da amostra na etapa 1.14 (amostras para análise citométrica de fluxo) e/ou na etapa 2.1 (classificação citométrica de fluxo).<ol><li>Preparar as células para um controlo celular não corado transferindo 50 μL (1,6 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS no gelo. Prepare as células para cada controle de cor única (11 tubos) transferindo 50 μL (1,6 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS no gelo.</li>
		<li>Prepare os controles FMO para as seguintes cores (Kit, CD41, CD150, CD49f [quatro tubos]) transferindo 300 μL (10 x 106 células) da suspensão celular para um tubo FACS separado no gelo.</li>
		<li>Girar as células a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração de anticorpos de FMOs e controles de cor única<ol><li>Coloração dos FMOs a 33 x 106 células/mL (em um volume total de 300 μL) em tubos FACS. Para cada controle, adicione todos os anticorpos, exceto o anticorpo homônimo do FMO. Por exemplo, para o Kit FMO, deixe de fora o anticorpo do Kit. Para cada anticorpo, utilizar a diluição e a concentração final como indicado no quadro 2.</li>
		<li>Coloração dos controles de cor única a 20 x 106 células/mL (em um volume total de 50 μL) em tubos FACS; para cada controlo, adicionar um único anticorpo à concentração indicada no quadro 2.</li>
		<li>Vórtice cada tubo de controle por 2-3 s a 3.000 rpm (rotações por minuto) e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz. Agite os tubos com um eixo de rotação paralelo ao comprimento do tubo, entre aproximadamente um ângulo de 10° e um ângulo de 60° da horizontal, de modo que o conteúdo não toque na tampa.</li>
		<li>Lave as células com SB5: Completar o volume da suspensão celular para 4 ml com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Ressuspensão:<ol><li>Ressuspeite os controles não corados e todos os controles de cor única (exceto o controle DAPI) em 300 μL de SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS.</li>
		<li>Fazer uma solução de DAPI/SB5 diluindo o estoque de DAPI (1 mg/mL em etanol a 100%) a 1:10.000 em SB5.</li>
		<li>Ressuspeite os FMOs em 1,8 mL de DAPI/SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS</li>
		<li>Ressuscite o controle de cor única DAPI em 300 μL de DAPI/SB5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 μm em um novo tubo FACS de 4 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da amostra: Se as células estiverem a ser preparadas para a análise citométrica de fluxo, avance para o passo 1.14. Se preparar as células para classificação, avance para o passo 2.1.</li>
	<li>Coloração das amostras de análise citométrica de fluxo a 33 x 10 6 células/mL em um volume total de 300 μL (10 x 106 células) em tubos FACS:<ol><li>Prepare a mistura mestre de anticorpos. Determinar o volume da mistura principal pelo número de amostras, com 300 μL por amostra. Efectuar a mistura principal diluindo todos os anticorpos enumerados na Tabela 2 à diluição indicada em SB5. O Rabbit IgG no master mix serve como um bloco Fc.</li>
		<li>Vórtice cada tubo por 2-3 s a 3.000 rpm e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz.</li>
		<li>Lave as células com SB5: Completar o volume da suspensão celular para 4 ml com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as amostras para análise citométrica de fluxo em 1,8 mL de DAPI/SB5, conforme preparado na etapa 1.12.5.2, e filtrar através de uma malha filtrante de 40 μm para um tubo FACS.</li>
		<li>Analisar as amostras em um citômetro com 10 canais para acomodar os conjugados de anticorpos na Tabela 2 e o corante de viabilidade DAPI. Um exemplo de configuração de canal é fornecido na Tabela 1. Também é possível usar apenas nove canais; veja a legenda da Tabela 2 .</li>
		<li>Durante a análise dos dados de citometria de fluxo, use abordagens de compensação espectral padrão com a ajuda dos controles de cor única e controles FMO, conforme detalhado na etapa 2.4.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ajustes de protocolo para classificação citométrica de fluxo
<ol><li>Preparação de Lin-<ol><li>Agrupe todas as células extraídas do mesmo tecido (BM ou baço) de 10 camundongos em um tubo de 50 mL. Ressuspenda cada amostra agrupada por pipetagem usando um P1000 com uma grande ponta de orifício.</li>
		<li>Girar as células a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Preparar controles de cor única e FMO, conforme descrito na seção 1, usando células não enriquecidas.</li>
		<li>Enriqueça células Lin para classificação usando enriquecimento de grânulos magnéticos de células Lin:</li>
		<li>Ressuspeite as células em 1 x 108 células/mL com SB5 e transfira-as para um tubo de 15 mL. Adicionar soro normal de rato e os anticorpos biotinilados enumerados no quadro 4 e incubar com balanço a 4 °C durante 1 h.</li>
		<li>Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 15 mL de SB5 frio.</li>
		<li>Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspeite as células em 1 x 108 células/mL no SB5 frio e mantenha-as no gelo.</li>
		<li>Vórtice as nanoesferas magnéticas a 3.000 rpm por 5-10 s. Tome 1 mL de nanoesferas magnéticas para cada 10 mL de células.</li>
		<li>Lave as nanoesferas em um tubo FACS de 5 mL. Perfazer o volume até 4 mL com SB5, girar a 900 x g, 4 °C por 5 min e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as nanoesferas em 500 μL de SB5 e misturar com as células preparadas na etapa 2.1.7. Incubar a 4 °C com balanço durante 15 min.</li>
		<li>Girar as células para baixo a 900 x g, 4 °C durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 x 108 células/mL com SB5.</li>
		<li>Coloque o tubo num íman a 4 °C durante 5 minutos.</li>
		<li>Despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.</li>
		<li>Colocar o tubo que contém o sobrenadante da etapa 2.1.13 num íman a 4 °C durante 5 minutos. Despeje cuidadosamente o sobrenadante em um novo tubo de 15 mL.</li>
		<li>Girar as células do sobrenadante na etapa 2.1.14 a 900 x g, 4 °C durante 10 minutos e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células enriquecidas com Lin em 1 mL de SB5.</li>
		<li>Diluir 10 μL das células a 1:100 em SB5. Misture 10 μL das células diluídas com 10 μL de azul de tripano e conte com um hemocitômetro e/ou contador celular.</li>
		<li>Com base na contagem de células na etapa 2.1.17, ressuspeite as células enriquecidas com Lin em 33 x 106 células/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração de células enriquecidas:<ol><li>Coloração das amostras de células enriquecidas a 33 x 106 células/mL em tubos FACS adicionando todos os anticorpos listados na Tabela 2. Vórtice cada tubo por 2-3 s a 3.000 rpm e, em seguida, incubar a 4 °C, balançando por 2,5 h no escuro, protegido da luz.</li>
		<li>Lave as células com SB5: Completar o volume dos tubos FACS para 4 mL com SB5. Gire as células para baixo a 900 x g, 4 °C por 10 minutos e remova o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as amostras para análise citométrica de fluxo em 4-6 mL de DAPI/SB5 conforme preparado na etapa 1.12.5.2 e filtrar através de uma malha filtrante de 40 μm em um novo tubo FACS de 4 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Classificação de amostras:<ol><li>Separe as amostras com um bocal grande e baixa pressão para maximizar o rendimento de UFC-e, uma vez que as células de UFC-e são facilmente danificadas sob alta pressão. Para o citômetro de fluxo utilizado neste estudo, utilizar 14 psi e um bocal de 100 μm ou 12 psi com bico de 130 μm. Configure as portas de classificação conforme descrito na etapa 2.4 abaixo.</li>
		<li>Prepare o tampão de coleta: Adicione 20% de soro fetal bovino ao PBS.</li>
		<li>Para verificar as purezas das populações classificadas, execute novamente uma pequena alíquota de cada população classificada em um buffer que contenha DAPI, conforme descrito na etapa 1.12.5.2. NOTA: Normalmente, o BM de um total de 10 camundongos (aproximadamente 1 x 109 células) produz pelo menos 50.000-100.000 células para cada uma das populações P1-hi, P1-low e P2 com uma viabilidade de aproximadamente 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Use a estratégia de bloqueio mostrada na Figura 3 para análise ou configuração das portas de classificação.<ol><li>Use o parâmetro FSC (forward-scatter) para remover os detritos com base no tamanho. Use o histograma FSC-height versus FSC-area para excluir agregados de células e selecionar células únicas; repetir com o histograma de altura de dispersão lateral (SSC) versus área de SSC.</li>
		<li>Exclua as células mortas eliminando as células que são positivas para o corante de DNA DAPI, ao qual as células viáveis são impermeáveis.</li>
		<li>Selecione células Lin-Ter119-Kit+ e, a partir delas, selecione uma subpopulação que expresse CD55.</li>
		<li>Subdivida as células Lin-Ter119-Kit+CD55+ em duas populações principais, P6 e P7, com base na expressão de CD49f e CD105.</li>
		<li>Com base na expressão de CD150 e CD41, subdivida P6 ainda mais em P3 (progenitores basófilos ou mastócitos), P4 (progenitores megacariocíticos) e P5 (EBMP e MPP com viés eritróide).</li>
		<li>Com base na expressão de CD150 e CD71, subdivida P7 ainda mais em P2 (BFU-e), UFC-e precoce (P1-baixo) e UFC-e tardia (P1-hi).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tusi, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+snapshots+predict+early+haematopoietic+and+erythroid+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies.</a> Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).</li>
<li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specialized+cell+cycles+during+erythroid+lineage+development%3A+Insights+from+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing.</a> International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).</li>
<li>Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shifting+shape+and+functional+specializations+of+the+cell+cycle+during+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).</li>
<li>Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Cells+that+Produce+Erythrocytic+Colonies+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hemopoiesis+in+Culture%22%5BJournal%5D)">Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro.</a> Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).</li>
<li>Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+the+erythropoietin-responsive+progenitors+BFU-E+and+CFU-E+in+mouse+bone+marrow+by+unit+gravity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation.</a> Blood. 47 (5), 777-792 (1976).</li>
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<li>Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietic+progenitors+capable+of+colony+formation+in+culture%3A+Response+of+normal+and+genetically+anemic+W-W-V+mice+to+manipulations+of+the+erythron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron.</a> Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).</li>
<li>Gregory, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+sensitivity+as+a+differentiation+marker+in+the+hemopoietic+system%3A+studies+of+three+erythropoietic+colony+responses+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture.</a> Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).</li>
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<li>Koulnis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+dynamic+responses+in+vivo+of+the+Bcl-xL+and+Bim+erythropoietic+survival+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways.</a> Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A capacidade de isolar prospectivamente progenitores BFU-e e CFU-e diretamente de tecido fresco com alta pureza já havia escapado aos pesquisadores. Nossa nova abordagem, validada usando scRNAseq e ensaios de destino celular 1,27, agora oferece as ferramentas para fazer isso.
Há uma série de pontos-chave para executar com sucesso os protocolos de classificação e analíticos. Primeiro, as células precisam ser giradas a 900 x g p...

A eritropoiese pode ser dividida em duas fases principais: eritropoiese precoce e diferenciação terminal eritróide (Figura 1)1,2,3. Na eritropoiese precoce, as células-tronco hematopoiéticas se comprometem com a linhagem eritróide e dão origem a progenitores eritróides precoces, que foram identificados pela primeira vez na década de 1970 com base em seu potencial de formação de colônias em meio semissólido 4,5,6,7,8,9 . Em termos gerais, os progenitores eritróides são divididos em duas categorias: progenitores anteriores que dão origem a uma "explosão" (um grande agregado de aglomerados de células eritróides menores), denominada "unidade formadora de explosão eritróide" ou BFU-e 4,5,6; e sua progênie, que forma um único e pequeno aglomerado ou colônia de células eritróides, denominado "unidade formadora de colônias eritróide" ou UFC-e 7,8,9. BFU-e e UFC-e ainda não expressam genes eritróides terminais e não são morfologicamente reconhecíveis. Após uma série de divisões celulares de auto-renovação ou expansão, a UFC-e sofre uma troca transcricional na qual genes eritróides, como as globinas, são induzidos, fazendo a transição para a diferenciação terminal eritróide (ETD)1,10. Durante a ETD, os eritroblastos sofrem de três a cinco divisões celulares maturacionais antes de se enuclearem para formar reticulócitos, que amadurecem em glóbulos vermelhos.
Os eritroblastos durante a diferenciação terminal foram originalmente classificados com base em sua morfologia em proeritroblastos, basofílicos, policromáticos e ortocromáticos. O advento da citometria de fluxo permitiu sua classificação prospectiva e isolamento com base no tamanho celular (medido por espalhamento para frente, FSC) e dois marcadores de superfície celular, CD71 e Ter119 11,12,13 (Figura 1). Essa e outras abordagens citométricas de fluxo similares 14 revolucionaram a investigação dos aspectos moleculares e celulares da DTE, permitindo a análise específica do estágio de desenvolvimento de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. A abordagem CD71/Ter119 é agora utilizada rotineiramente na análise de precursores eritróides.
Até recentemente, uma abordagem citométrica de fluxo semelhante e acessível para o isolamento prospectivo direto e de alta pureza da UFC-e e da BFU-e do tecido do rato tem escapado aos investigadores. Em vez disso, os pesquisadores têm utilizado estratégias citométricas de fluxo que isolam apenas uma fração desses progenitores, muitas vezes na presença de células não eritróides que copurificam dentro dos mesmos subconjuntos citométricos de fluxo21. Consequentemente, a investigação de BFU-e e CFU-e limitou-se a sistemas de diferenciação in vitro que derivam e amplificam BFU-e e CFU-e de progenitores anteriores da medula óssea. É possível, então, aplicar estratégias citométricas de fluxo que distinguem a UFC-e da UFC-e nessas culturas enriquecidas com progenitores eritróides22,23. Uma abordagem alternativa faz uso da UFC-e fetal e da UPB-e, que são altamente enriquecidas na fração Ter119-negativa do fígado fetal do rato no meio da gestação 10,24,25. Nenhuma dessas abordagens, no entanto, permite a investigação de BFU-e e UFC-e adultas em seu estado fisiológico in vivo. A magnitude do desafio pode ser apreciada quando se lembra que, com base em ensaios de formação de colônias, essas células estão presentes na medula óssea adulta em uma frequência de apenas 0,025% e 0,3%, respectivamente6.
O protocolo aqui descrito é uma nova abordagem citométrica de fluxo baseada na análise transcriptômica de células da medula óssea de camundongos Kit+ recém-colhidas (o Kit é expresso por todas as populações progenitoras iniciais da medula óssea)1. Nossa abordagem contém alguns marcadores de superfície celular que já estavam em uso por Pronk et al.21,26. Transcriptomas unicelulares foram utilizados para determinar combinações de marcadores de superfície celular que identificam eritróides e outros progenitores hematopoiéticos precoces (Figura 2). Especificamente, a fração CD55+ de células Kit+ de linhagem negativa (Lin-) pode ser subdividida em cinco populações, três das quais produzem segmentos contíguos da trajetória eritróide (Figura 2). As identidades transcriptômicas de cada uma dessas populações foram confirmadas por classificação, seguida de scRNAseq e projeção dos transcriptomas de célula única classificados de volta ao mapa transcriptômico original (a expressão gênica em cada uma das cinco populações e todo o conjunto de dados da medula óssea podem ser explorados em https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . O potencial de destino celular de cada uma das populações foi confirmado usando ensaios tradicionais de formação de colônias (Figura 2), bem como um novo ensaio de destino unicelular de alto rendimento 1,27. Essas análises mostram que a nova abordagem citométrica de fluxo resulta no isolamento de alta pureza de todos os progenitores de BFU-e e UFC-e da medula óssea adulta fresca e do baço. Especificamente, a população 1 (P1) contém apenas UFC-e e nenhum outro progenitor hematopoiético, e a população 2 (P2) contém todos os progenitores BFU-e da medula óssea e um pequeno número de UFC-e, mas nenhum outro progenitor1. O protocolo detalhado abaixo é ainda ilustrado com um experimento de exemplo em camundongos que foram injetados com solução salina ou com o hormônio eritropoiese-estimulante eritropoietina (Epo).

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L pontas de orifício grande</td><td>EUA sceintific</td><td>1011-9000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>131806</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>557395</td><td>M1/70 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td>1D3 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB553045</td><td>RM4-5 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB553029</td><td>53-6.7 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>BM8 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-Ly-6G e Ly-6C</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>RB6-8C5 (clone)</td></tr><tr><td>Biotina-TER-119</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>TER-119 (clone)</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma aldritch</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Violeta brilhante 421 anti-humano / camundongo CD49f Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>313624</td><td></td></tr><tr><td>Violeta brilhante 605 anti-camundongo CD41</td><td>BioLegend</td><td>133921</td><td></td></tr><tr><td>Violeta brilhante 650 anti-camundongo CD150 (SLAM) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>115931</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 Rato anti-rato TER-119 / eritróide Células</td><td>BD Biosciences</td><td>563827</td><td></td></tr><tr><td>ChromPure Rabbit IgG, molécula inteira</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Digital DIVA hardware e software para LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse F4/80 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>557396</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553785</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G e LY-6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>553127</tr><tr><td>software FlowJo</td>Software de <td>análise de citômetro de fluxo</td>LSR II <td>da versão 10</td> da <td>FlowJo</td></tr> analisador <tr><td>de citômetro de fluxo digital multiparâmetro</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citômetro de fluxo&nbsp;</td></tr><tr><td>NewlineNY Aço Inoxidável Hand Masher & Conjunto de Tigela, Almofariz e Pilão</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal soro de rato</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-camundongo CD105 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>120408</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-camundongo CD71 Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td> Nanoesferas</td><td>BioLegend</td><td>480016</td><td>Contas magnéticas</td></tr></tbody></table>

identificação e isolamento de progenitores eritróides da unidade formadora de explosão e da unidade formadora de colônias de tecido de camundongo por citometria de fluxo

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Os primeiros progenitores eritróides foram originalmente definidos por seu potencial de formação de colônias in vitro e classificados em "unidades" formadoras de explosões e formadoras de colônias conhecidas como BFU-e e UFC-e. Até recentemente, métodos para o isolamento prospectivo direto e completo de progenitores puros de BFU-e e CFU-e da medula óssea adulta recém-isolada não estavam disponíveis. Para resolver essa lacuna, um conjunto de dados de RNA-seq de célula única (scRNAseq) da medula óssea de camundongos foi analisado para a expressão de genes que codificam marcadores de superfície celular. Esta análise foi combinada com ensaios de destino celular, permitindo o desenvolvimento de uma nova abordagem citométrica de fluxo que identifica e permite o isolamento de subconjuntos completos e puros de progenitores BFU-e e CFU-e na medula óssea ou baço de camundongos. Esta abordagem também identifica outros subconjuntos progenitores, incluindo subconjuntos enriquecidos para basófilos/mastócitos e potenciais megacariocíticos. O método consiste em marcar células frescas da medula óssea ou do baço com anticorpos direcionados a Kit e CD55. Os progenitores que expressam ambos os marcadores são então subdivididos em cinco populações principais. A população 1 (P1 ou UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/baixo CD105 med/alto CD71 med/alto) contém todos os progenitores da UFC-e e pode ser subdividida em P1-low (CD71med CD150 high) e P1-hi (CD71high CD150low), correspondendo a UFC-e precoce e tardia, respectivamente; A população 2 (P2 ou BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71low CD150high) contém todos os progenitores BFU-e; A população P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150 low CD41low) é enriquecida para progenitores de basófilos/mastócitos; A população 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) é enriquecida para progenitores megacariocíticos; e a População 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105 med/low CD150high CD41-) contém progenitores com eritróides, basófilos/mastócitos e potencial megacariocítico (EBMP) e progenitores multipotenciais (MPPs) eritróides/megacariocíticos/basófilos. Esta nova abordagem permite maior precisão na análise de progenitores eritróides e outros progenitores hematopoiéticos e também permite a referência à informação do transcriptoma para cada população de fluxo citometricamente definida.

O protocolo descreve uma abordagem citométrica de fluxo para identificar BFU-es e UFC-es em células recém-colhidas da medula óssea e do baço. Começa com a colheita de BM fresco e baço de ratos e imediatamente colocando o tecido no gelo. Todos os procedimentos são realizados a frio para preservar a viabilidade celular. As células são marcadas com um coquetel de anticorpos de "linhagem" que permite a exclusão de todas as células que expressam marcadores de linhagens sanguíneas diferenciadas (o coquetel FITC-Lin, Tabela <st...

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Este protocolo permite a identificação e o isolamento de progenitores eritróides BFU-E e CFU-E diretamente de tecido de camundongo recém-colhido, como medula óssea e baço. Usando esta técnica, podemos isolar populações puras de progenitores eritróides, o que não foi possível com os protocolos de fluxo anteriores. Este método aumenta muito a nossa capacidade de estudar modelos de ratos com doenças eritróides, permitindo o isolamento de progenitores para muitos experimentos a jusante.Para começar, coloque os fêmures e tíbias recém-dissecados diretamente no tampão de coloração a frio ou SB-5 e mantenha os tubos no gelo até que estejam prontos para extrair a medula óssea. Coloque uma argamassa esterilizada limpa no gelo em um balde e transfira os ossos para a argamassa. Usando a tesoura de dissecção, corte aproximadamente 1 milímetro de cada osso.Use uma seringa de 3 mililitros equipada com uma agulha de calibre 26 contendo SB-5 para liberar a medula dos ossos e coletá-la na argamassa e repetir o processo de 3 a 5 vezes usando tampão fresco de cada vez até que os ossos pareçam incolores. Filtre a medula lavada através de uma malha de 100 micrômetros e colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mililitros colocado no gelo. Em seguida, use a argamassa e o pilão para esmagar os ossos lavados em 5 a 10 mililitros de SB-5.Filtre a mistura de ossos esmagados e tampão através do filtro celular de 100 micrômetros para se agrupar com as células coletadas anteriormente. Configure um filtro de malha de 100 micrômetros em um tubo de centrífuga vazio de 50 mililitros colocado no gelo. Coloque um único baço no filtro de malha e adicione 0,5 a 1 mililitro de SB-5 ao baço para garantir que ele não seque.Usando o lado de borracha de um êmbolo de seringa de 3 ou 5 mililitros, amasse o baço através da malha. Adicione mais SB-5, 5 mililitros de cada vez, e continue a amassar até que todas as células tenham sido coletadas no tubo. Prepare uma suspensão de célula única pipetando para cima e para baixo as células coletadas com 2 mililitros de SB-5 usando uma grande ponta de orifício.Coloração da fluorescência menos um ou controles FMO adicionando todos os anticorpos, exceto o anticorpo homônimo do FMO à suspensão celular no tubo FACS. Para manchar os controles de cor única, adicione um único anticorpo à suspensão celular no tubo FACS. Vórtice cada tubo de controle por 2 a 3 segundos a 3000 RPM e depois incube a 4 graus Celsius balançando por 2,5 horas no escuro.Após a incubação, lave as células com SB-5 e compense o volume da suspensão celular em 4 mililitros com SB-5. Gire as células a 900 g por 10 minutos a 4 graus Celsius e aspirar o sobrenadante. Ressuspeite os controles não corados e todos os controles de cor única em 300 microlitros de SB-5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 micrômetros em novos tubos FACS.Fazer uma solução de DAPI SB-5 diluindo o estoque de DAPI em uma proporção de 1 a 10.000 em SB-5. Ressuscite o FMOS em 1,8 mililitros de DAPI SB-5 e o controle de cor única DAPI em 300 microlitros de DAPI SB-5 e, em seguida, filtre-os através de uma malha de filtro de 40 micrômetros em novos tubos FACS. Depois de adicionar a mistura mestre de anticorpos a cada amostra, vórtice os tubos por 2 a 3 segundos a 3000 rpm, seguido de incubação a 4 graus Celsius no escuro por 2,5 horas na condição de balanço.Depois de lavar as células, como demonstrado anteriormente, ressuspeite as amostras em 1,8 mililitros de DAPI SB-5 e filtre através de uma malha de filtro de 40 micrômetros em um novo tubo FACS e analise as amostras usando um cistometer. Use a dispersão para a frente para remover os detritos com base no tamanho e, em seguida, use o histograma de altura de dispersão para frente versus histograma de área de dispersão para frente para excluir agregados de células e selecionar células únicas. Repita a exclusão com o histograma de altura de dispersão lateral versus área de dispersão lateral.Exclua as células mortas eliminando as células positivas para DAPI. Selecione a linhagem negativa TUR uma 19 células positivas kit negativo. E destes seleciona-se uma subpopulação que expressa o CD 55.Subdivida a linhagem negativa TUR um 19, kit negativo, positivo, CD 55 células positivas em 2 populações principais, P seis e P sete com base na expressão de CD 49 F e CD 1 0 5. Agora com base na expressão do CD 150 e CD 41, subdivida P 6 em P 3, P 4 e P 5. Da mesma forma, com base na expressão do CD 150 e do CD 71, subdivida P 7 ainda mais em BFUE, CFUE inicial e CFUE tardia.No presente estudo, foram identificadas unidades de ruptura e formação de colônias a partir das células recém-colhidas da medula óssea e do baço. Após 72 horas de eritropoietina, ou injeção de veículo nos camundongos, a estimulação da eritropoietina mostrou expansão das populações de unidades de colônia precoce e tardia P 1 baixa e P 1 alta na medula óssea e células do baço colhidas. A resposta dos progenitores da medula óssea e do baço à eritropoietina in vivo também mostrou um maior número de células nas populações de unidades de formação de colônias precoces e tardias P 1 baixas e P 1 altas, em comparação com o controle do veículo.É mais importante gerar uma única suspensão celular antes de rotular as células com anticorpos. Isso pode ser conseguido pipetando para cima e para baixo repetidamente e incluindo EDTA no buffer. Os progenitores purificados podem ser usados para qualquer análise celular e molecular a jusante.Por exemplo, transcriptômica de célula única, atesco, ensaios de colônias e bioquímica. Essa técnica nos ajudou a testar as previsões de experimentos de RNA-seq de célula única.

identification-isolation-burst-forming-unit-colony-forming-unit

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

RNA-de sequenciamento e bioinformática análises foram utilizados para identificar fatores de transcrição significativamente e diferencialmente expressos em subpopulações Lin-CD34 + e Lin-CD34 @ de EMLcells do mouse. Estes fatores de transcrição pode desempenhar um papel importante na determinação da chave entre as células Lin-CD34 @ auto-renovação Lin-CD34 + e parcialmente diferenciados.

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.

Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Este artigo descreve a metodologia in vivo e in vitro para caracterizar os progenitores de decantação tímica pela análise da cinética de geração, fenótipo e número de suas progênies de células T.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Aprenda a isolar progenitores eritróides BFU-e e CFU-e de tecido de camundongo por citometria de fluxo. Esta técnica de alta pureza permite estudos avançados de doenças eritróides em modelos animais.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

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