Name: A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a caracterizar a mecânica de géis de actomiosina poroelásticos como modelo do citoesqueleto celular. Este método in vitro revela como a contratilidade da miosina gera fluxo de fluido e correlaciona velocidades da rede e do citosol.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gostaríamos de agradecer a Dina Aranovich pela purificação e rotulagem das proteínas. G.L. é grato ao Ministério da Ciência, Tecnologia e Espaço de Israel pela Bolsa de Doutorado Jabotinsky. A.B.G. agradece à Israel Science Foundation (processo 2101/20) e ao Ministério da Ciência e Tecnologia - Estado de Israel (grant 3-17491) pelo apoio financeiro.

1. Tratamento da superfície do vidro e passivação:
NOTA: Esta seção inclui três etapas principais (consulte a Figura 1): (i) limpeza e hidrofilização, (ii) silanização e (iii) passivação superficial.
<ol><li>Limpeza e hidrofilização<ol><li>Use solução de Piranha para limpeza de superfícies de vidro. OBS: Solução de piranha é uma mistura de 30% H 2 O 2 e 70% H2SO4 (Tabela de Materiais). Seu principal objetivo é remover contaminações orgânicas de superfícies de deslizamento de cobertura e expor os grupos OH na superfície de vidro. Desta forma, a superfície de vidro torna-se hidrofílica.</li>
		<li>Coloque 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) tampas de vidro (Tabela de Materiais) em um suporte de politetrafluoretileno caseiro (área da base: 5,5 cm x 5,5 cm). Transferir o suporte de politetrafluoretileno para um copo de 400 mL (Tabela de Materiais) e incubá-lo com 300 mL de solução de Piranha por 2 h. Faça este passo no gelo e em uma capa química. NOTA: O polo de politetrafluoretileno parafusado à base do suporte tem 12 cm de comprimento, mais longo que o copo (11 cm), o que permite a transferência/arrancamento seguro do suporte de/para a solução de Piranha. Como a solução de piranha ainda pode ser altamente reativa e muito quente, é imperativo parar a reação. A maneira mais fácil de parar a reação é despejar a solução de piranha em água (torneira) para obter uma diluição de 50x (pelo menos). A solução pode então ser descartada com segurança. Nunca guarde a solução de piranha usada em uma garrafa de vidro fechada – isso pode terminar em uma explosão de garrafa.</li>
		<li>Transfira o suporte de politetrafluoretileno para um copo limpo preenchido com água fresca bidestilada (DDW) para lavar o excesso de piranha das lamínulas.</li>
		<li>Transfira o copo para um banho de sonicação (Tabela de Materiais) e sonice a 80 Hz na potência máxima por 10 min a 25 °C. Repita esta etapa mais duas vezes com DDW novo. Use DDW fresco a cada vez.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanização<ol><li>Transfira o suporte para um copo limpo (400 mL) preenchido com 300 mL de metanol puro (Tabela de Materiais) e, em seguida, para um banho de sonicação (Tabela de Materiais). Sonicate a 80 Hz na potência máxima durante 30 min a 25 °C.</li>
		<li>Após a sonicação, transferir o suporte para uma solução de silano preparada com 15 mL de DDW, 3,1 mL de ácido acético (Tabela de Materiais), 340 mL de metanol e 7,6 mL de silano ((3-Mercaptopropil) trimetoxissilano) (Tabela de Materiais). Sele o copo com parafilme e mantenha-o no frigorífico a 4 °C durante a noite. NOTA: A preparação e o manuseamento da solução de silano devem ser efectuados numa capela química. Após a etapa de silanização, coloque a solução de silano usada (resíduo) em uma garrafa de vidro dedicada dentro da coifa química.</li>
		<li>No dia seguinte, transfira o suporte para um copo limpo preenchido com 300 mL de metanol puro por 15 s. Em seguida, transfira o suporte para um copo limpo, não antes de secar o fundo do suporte de politetrafluoretileno para remover o excesso de metanol. Transfira o copo para o forno (Tabela de Materiais) para secar as lamínulas de vidro por 5 min a 120 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Passivação superficial com polímero inerte<ol><li>Consiga a passivação da superfície incubando as lamínulas de vidro com um polímero inerte (Tabela de Materiais). Para cada experimento, pegue duas lamínulas e coloque-as em uma placa de Petri revestida com uma camada de parafilme inicialmente limpa com etanol (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Incubar cada lamínula com 1 ml de uma maleimida de metoxi-polietilenoglicol de peso molecular de 4 mg·mL−1 5 kDa (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Tabela de Materiais) por 1 h a 22 °C. NOTA: A colocação das lamínulas sobre uma camada de parafilme hidrofóbico confina a solução de polímero de PEG hidrofílico à superfície de lamínula de vidro. O tempo de incubação é crítico para alcançar a passivação ideal. Use tempos de incubação que variam entre 45 min e 2 h. Acima desse tempo de incubação, a superfície da tampa de vidro pode se deteriorar, levando à adesão de proteínas e à perda de transparência.</li>
		<li>Ao final do processo de incubação, enxaguar cada lamínula com 5 mL de DDW e secar com fluxo de N2 (gás). Não seque as lamínulas sob vácuo. Como as lamínulas devem ser mantidas molhadas após a passivação, coloque imediatamente 1 mL de Tris 10 mM nas superfícies peguiladas. Use as tampas dentro de 2 h. NOTA: As várias etapas devem ser executadas em uma câmara de fluxo laminar para evitar a contaminação da superfície do vidro.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Purificação de proteínas
<ol><li>Purificar a G-actina do pó de acetona do músculo esquelético de coelhos utilizando o método de filtração em gel24.<ol><li>A purificação da actina leva 1 semana. Manter a G-actina purificada em tampão G (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP e 1 mM TDT) e armazená-la no gelo. Use a solução dentro de 2 semanas. NOTA: Substitua o gelo a cada dois dias.</li>
		<li>Rotular a actina com um corante fluorescente modificado por maleimida16 (Tabela de Materiais). Purificar o GST-fascin com base no método de Ono et al.25. Congelar ambas as proteínas em N líquido2 e armazenar a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizar um protocolo padrão para purificar a miosina II do músculo esquelético decoelhos 26. O tampão de estoque de miosina II purificada (dímeros) inclui 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl e 35% p/v de sacarose. Congelar a miosina em N líquido2 e armazenar a -80 °C. NOTA: A alta concentração de KCl mantém os motores de miosina em uma forma dimérica, enquanto a alta porcentagem de sacarose garante que a atividade dos motores não seja prejudicada após o congelamento. Use uma pipeta dedicada para manuseio de fluidos viscosos ao trabalhar com soluções estoque de miosina II (Tabela de Materiais).<ol><li>Marcar os dímeros de miosina II com um corante fluorescente (Tabela de Materiais) em pares de resíduos de cisteína projetados19,27. Use uma moela de frango RLC mutante A para esse fim26. Congelar a miosina II marcada em N líquido2 e armazenar a -80 °C. NOTA: Este procedimento de marcação garante que a miosina marcada é ativa como a proteína nativa da miosina II.</li>
	</ol></li>
	<li>Use um espectrofotômetro UV-Vis (Tabela de Materiais) para medir a absorbância das soluções proteicas estoque e deduzir as concentrações de proteínas com a lei de Beer-Lambert usando os seguintes coeficientes de extinção: G-actina (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), dímero de miosina II (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), e o mutante RLC A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.</li>
</ol>3. Preparo da amostra
OBS: Polimerizar os monômeros de actina na presença de grandes agregados de motores de miosina II e a forte fascina passiva reticulante para produzir macroscopicamente redes de actomiosina elásticacontráteis 19,23. A adição de esferas fluorescentes à solução permite rastrear o fluxo de solvente durante a contração do gel.
<ol><li>Solução proteica ("actomiosina")<ol><li>Com exceção da G-actina, mantenha as proteínas a -80°C em pequenas alíquotas e descongele-as a 37 °C antes do uso. O volume total da solução de actomiosina é de 40 μL.</li>
		<li>Preparar a solução misturando 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, um sistema regenerador de ATP (0,5 mg·mL−1 creatina quinase e 5 mM creatina fosfato), 200 μM EGTA (quelatos Ca2+ íons), uma solução antibranqueadora (0,1 mg·mL−1 glicose oxidase, 0,018 mg·mL−1 catalase e 5 mg·mL−1 glicose), 5 μM G-actina, 280 nM GST-facina e 1,67 nM miosina II. A porcentagem de G-actina marcada é de 5% (porcentagem molar). NOTA: Use uma baixa porcentagem de G-actina marcada para evitar a saturação do sinal fluorescente nos estágios avançados de contração do gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparo de agregados motores de miosina II<ol><li>Adicione os motores de miosina à solução proteica sob a forma de agregados. Para formar grandes agregados de miosina (150 dímeros de miosina/agregado), diluir a solução estoque de miosina com Tris 10 mM pH 7,4 para atingir uma concentração final de 25 mM KCl.</li>
		<li>Manter a solução de miosina diluída durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR) e, em seguida, transferi-la para o gelo até à utilização. Os motores ficam totalmente ativos por até 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição do fluxo de solventes<ol><li>Para rastrear o fluxo de solvente através dos poros do gel, adicione as esferas fluorescentes à solução de actomiosina. Reduza a interação entre as contas e a rede de actomiosina, passivando as contas. Praticamente, incubar 1 μL de contas (Tabela de Materiais) com 5 μM de G-actina por 20 min no TR e, em seguida, remover o excesso de G-actina por centrifugação (Tabela de Materiais) (condições: 6.000 x g por 5 min a 4 °C).</li>
		<li>Repita esta etapa com 10 mg·mL−1 de albumina de soro bovino (BSA) (Tabela de Materiais) para bloquear (possivelmente) a superfície restante não revestida. Utilizar as esferas em uma diluição final de 1:10.000 vol/vol nos experimentos. NOTA: É importante adaptar o diâmetro das contas ao tamanho dos poros do gel de modo que a relação entre o tamanho do talão e dos poros seja de <1 em todas as fases.</li>
	</ol></li>
	<li>Efeito da viscosidade da solução<ol><li>Controle a viscosidade da solução adicionando glicerol (Tabela de Materiais) à solução de actomiosina. A adição de glicerol a uma percentagem ponderal que varia entre 0% e 34% induz um aumento correspondente na viscosidade da solução de η ω para 2,76 η ω, onde η ω é a viscosidade da água a 20 °C28. NOTA: É essencial usar uma pipeta dedicada para o manuseio de fluidos viscosos ao trabalhar com glicerol (Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Executando um experimento
<ol><li>Manuseio caseiro do porta-amostras<ol><li>Pegue uma das lamínulas passivadas por PEG, coloque um espaçador de parafilme untado sobre ela e coloque-a no suporte da amostra. NOTA: Pode-se substituir o espaçador de parafilme por qualquer espaçador.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução de actomiosina<ol><li>Preparar a solução de actomiosina sobre gelo em um tubo de microcentrífuga incorporando os vários constituintes microscópicos, adicionando os agregados motores de miosina II e adicionando EGTA por último. Misture bem a solução. A adição de EGTA inicia a polimerização da rede de actomiosina, que define o tempo de início do experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar 1,1 μL dessa solução na lamínula montada no suporte e colocar a segunda lamínula por cima. Rosqueie o suporte para selar a amostra. Esse processo aperta levemente a gota, que adota uma forma de disco. Os diâmetros de queda variam entre 2.800-3.000 μm.</li>
	<li>Coloque o porta-amostras no microscópio e inicie a aquisição. Preparar o microscópio com antecedência para reduzir o tempo de aquisição inicial. Normalmente, leva 1-2 minutos após a mistura para iniciar a imagem da amostra.</li>
</ol>5. Técnicas de microscopia
<ol><li>Imageie as amostras usando um microscópio fluorescente invertido (Tabela de Materiais) controlado por software dedicado (Tabela de Materiais).<ol><li>Utilizar aumentos baixos de 2,5x/0,075 objetiva Plan-NEOFLUAR (Tabela de Materiais) para visualizar toda a área do gel e acompanhar sua contração macroscópica com o tempo.</li>
		<li>Use uma objetiva UPlanFL de 10x/0,3 Ph1 (Tabela de Materiais) para caracterizar a porosidade e a estrutura da rede e acompanhar a auto-organização e contração da rede com o tempo. NOTA: Este objetivo também é útil para localizar os agregados motores de miosina II dentro da rede e acompanhar o movimento de esferas fluorescentes através dos poros do gel. Ampliações mais altas podem ser usadas às custas de um campo de visão reduzido, o que é ainda mais significativo no modo de imagem de duas cores (Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Excitar as amostras a 488 nm (actina/esferas fluorescentes) e 561 nm (agregados motores de miosina/esferas fluorescentes). Adquira as imagens a 100 ms por quadro com software dedicado (Tabela de Materiais) no modo de streaming com uma câmera EMCCD (Dispositivo de Carga Acoplada à Multiplicação de Elétrons) (Tabela de Materiais). NOTA: A intensidade da lâmpada fluorescente (Tabela de Materiais) deve ser mantida no menor valor possível para evitar a saturação do sinal durante a contração da rede.</li>
	<li>Imagem bicolor simultânea<ol><li>Use este modo para dois propósitos: (i) detectar a localização dos agregados motores de miosina dentro da rede de actina e (i) caracterizar o fluxo de solvente para fora dentro e fora durante a contração da rede.</li>
		<li>Excitar os motores de actina e miosina II a 488 nm e 561 nm, respectivamente, e gravar as imagens simultaneamente em uma câmera EMCCD (Tabela de Materiais) usando um aparelho de dupla emissão (Tabela de Materiais). Use o mesmo sistema de imagem para obter imagens simultâneas do gel de actina (488 nm) e das esferas fluorescentes (561 nm).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Genesis%2C+Modulation%2C+and+Regeneration+of+Skeletal+Muscle+In+Molecular+Biology+of+the+Cell.+4th+edition%22">Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition</a>. , Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+J+%22Mechanics+of+Motor+Proteins+and+the+Cytoskeleton%22">Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton</a>. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).</li>
<li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+mechanics%3A+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li>
<li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li>
<li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li>
<li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+cell+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li>
<li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li>
<li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li>
<li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li>
<li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li>
<li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+or+myosin+contraction%3A+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).</li>
<li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).</li>
<li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413(2019).</li>
<li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2%2F3+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li>
<li>Pontani, L. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li>
<li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+does+it+all%3A+Assembly%2C+remodeling%2C+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li>
<li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+gels%3A+Dynamics+of+patterning+and+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264(2006).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).</li>
<li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction%3A+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li>
<li>Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMargossian%2C+SS+%22In+Methods+in+Enzymology%22">In Methods in Enzymology</a>. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).</li>
<li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li>
<li>Cheng, N. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol%E2%88%92water+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+Physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li>
<li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).</li>
<li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).</li>
<li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).</li>
<li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, uma abordagem in vitro é empregada para caracterizar a mecânica dos géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo do citoesqueleto celular e, mais geralmente, do citoplasma celular, que tem demonstrado se comportar como um material poroelástico 3,5. A reologia do citoesqueleto celular (citoplasma) tem sido caracterizada por uma constante de difusão poroelástica, que determina quanto tempo leva para o líquido citosólico intracelular se re...

As células vivas têm propriedades mecânicas únicas. Além da capacidade de reagir passivamente às forças aplicadas, elas também são capazes de gerar ativamente forças em resposta a estímulos externos1. Essas características, essenciais para uma variedade de processos celulares, notadamente durante a motilidade celular, são primariamente atribuídas às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, especialmente do citoesqueleto de actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina e proteínas acessórias. Essas redes de actomiosinas exibem propriedades intrínsecas de auto-organização e contração impulsionadas pelas proteínas motoras da miosina, que reticulam os filamentos de actina e geram ativamente tensões mecânicas na rede alimentada pela hidrólise de ATP2.
Inúmeros estudos experimentais e teóricos têm sido realizados para estudar as propriedades materiais do citoesqueleto3. A visão comumente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico4. Isso significa que, em escalas de tempo curtas, o citoesqueleto se comporta como um material elástico e, em longas escalas de tempo, comporta-se como um fluido viscoso devido às proteínas de reticulação e ao descolamento motor (e religação) da miosina, o que permite que a rede se transforme dinamicamente. Em muitas situações, entretanto, o modelo viscoelástico não consegue descrever os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto e, de modo mais geral, o citoplasma da célula sendo descrito como um material ativo poroelástico 5,6. Duas características principais caracterizam esses tipos de materiais. (i) A primeira característica principal é a geração de um fluxo do citosol penetrante (o "solvente") através dos poros do gel por gradientes de contratilidade impulsionados pelos motores da miosina, que está subjacente a processos como o blebbing celular7, a motilidade8 e as oscilações da forma celular9. O surgimento desses fluxos citosólicos pode ser local, por blebbing, ou global, como na motilidade celular. Neste último caso, as tensões contráteis aplicadas na parte traseira da célula direcionam o fluxo do fluido citosólico em direção à frente celular, o que repõe o pool proteico necessário para a montagem dos lamelípodes8. (ii) A segunda característica principal é que a relaxação das tensões é difusiva e é caracterizada por uma constante de difusão efetiva, que depende do módulo elástico do gel, da porosidade do gel e da viscosidade do solvente5. A constante de difusão poroelástica determina a rapidez com que o sistema responde a uma tensão aplicada. Constantes de maior difusão correspondem a uma redistribuição mais rápida das tensões. Isso, por sua vez, determina quanto tempo leva para que o líquido citosólico intracelular seja redistribuído dentro da célula após o estresse mecânico aplicado, seja ele externo ou interno, como os estresses contráteis ativos gerados pelos motores da miosina. Esses exemplos, portanto, demonstram que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados e não podem ser tratados separadamente3.
Como as células podem regular suas propriedades mecânicas de várias maneiras, a interação entre a mecânica da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos permanece pouco compreendida. Uma abordagem alternativa poderosa é a utilização de sistemas reconstituídos in vitro que permitam o controle total dos vários constituintes microscópicos e dos parâmetros do sistema, o que torna esses sistemas-modelo ótimos para análises físicas10,11. Esta abordagem tem sido empregada com sucesso para estudar o impacto da composição proteica e da geometria do sistema na motilidade baseada em actina 12,13,14,15,16,17,18, na padronização 2D de redes de actomiosinas 19,20,21,22, e a interação entre a contratilidade da rede e a dinâmica do fluxo de fluidos de géis de actomiosina poroelásticos, que é o foco deste artigo23.
Neste manuscrito, a preparação de redes de actomiosina elástica contrátil de dimensões controláveis e propriedades do material é discutida com base no trabalho de Ideses et al.23. A dinâmica do gel de contração e do solvente drenado é analisada e quantificada, através da qual é demonstrado que estes géis de actomiosina podem ser descritos como um material ativo poroelástico. O estudo do efeito da viscosidade do solvente na difusividade de tensões confirma ainda mais a natureza poroelástica dessas redes. As várias relações de dimensionamento usadas para quantificação de dados são fornecidas. Finalmente, os desafios experimentais, as armadilhas comuns e a relevância dos resultados experimentais para o citoesqueleto celular também são discutidos.

<table><tbody><tr><td>(3-Mercaptopropil)trimetoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>175617</td><td>Armazenado sob atmosfera de argônio a 4 &graus; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>Diluído com DMSO, armazenado sob atmosfera de argônio a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogene</td><td>A20347</td><td>Diluído com DMSO, armazenado sob atmosfera de argônio a -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>A3059</td><td>Armazenado em 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>C9322</td><td>O frasco de estoque é mantido em atmosfera seca (gel de sílica) a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Mezel-glaser</td><td>CG2222-1.5</td><td>Mantido em milliQ-água após o tratamento com Piranha e usado dentro de 3 semanas</td></tr><tr><td>Creatina quinase</td><td>Roche Life Science Products</td><td>10736988001</td><td>Preparado fresco em tampão glicina, mantido no gelo e usado dentro de 3 dias.&nbsp; O frasco de estoque é mantido em atmosfera seca (gel de sílica) a 4 & C</td></tr><tr><td>Fosfato de creatina</td><td>Produtos para ciências da vida da Roche</td><td>10621714001</td><td>Quando dissolvido deve ser mantido a -20 & C e usado dentro de 3 meses. A garrafa de estoque é mantida sob atmosfera de argônio e armazenada a 4 graus; C</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Produtos para ciências da vida da Roche</td><td>10708984001</td><td>Quando dissolvido deve ser mantido a -20 > C e usado dentro de 3 meses</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem Simultânea de Visualização Dupla&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Câmera</td><td>Andor Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Câmera</td><td>Photometrics</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de Fluorescência</td><td>Rapp Fluoresbrite Optoeletrônica</td><td></td><td></td></tr><tr><td> YG Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>200 nm de diâmetro</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>Quando dissolvido deve ser mantido a -20 &deg; C e usado dentro de 3 meses.</td></tr><tr><td>Glicose oxidase</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>G7141</td><td>Mantido em -20 &deg; C e usado dentro de 3 meses. O pó de estoque é mantido sob atmosfera de argônio e mantido a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>216763</td><td>Armazenado em 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>Methanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1368052100</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>442615</tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&nbsp;</td><td>Mw = 5000 Da. Dividido em pequenos lotes em peso. Armazenado sob atmosfera de argônio a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Microesferas vermelhas do Nilo</td><td>Spherotech</td><td>FP-2056-2&nbsp;</td><td>2300 nm de diâmetro</td></tr><tr><td>Objetiva (10x)</td><td>Leica Alemanha</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL Abertura numérica = 0.3</td></tr><tr><td>Objetiva (2.5x)</td><td>Leica Alemanha</td><td>506304</td><td>&nbsp; Plan-NEOFLUAR Abertura numérica = 0.075</td></tr><tr><td>Forno</td><td>WTC Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Driver do obturador</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílica</td><td>Merck</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elma</td><td>Elmasonic P</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de ácido sulfúrico</td><td>Carlo Erba</td><td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 Sistema de Imagem Simultânea de Canal Duplo</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-VIS</td><td></td> TRIS MP Biomedicals 819620 <td>Pharmacia Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> MICROMAN E Gilson FD10001 1&ndash;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 10 uL</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Quantificação de dados&nbsp;</td></tr><tr><td>Metamorfose</td><td>Software</td><td></td><td>de controle do sistema de imagem óptica; quantificação de dados (análise de rastreamento de partículas, tamanho da malha da rede)</td></tr></tbody></table>

a mecânica das redes de actomiosinas (poro-)contráteis elásticas como sistema modelo do citoesqueleto celular

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

As células podem mudar ativamente suas formas e se tornar móveis, uma propriedade que depende de sua capacidade de reorganizar ativamente sua estrutura interna. Essa característica é atribuída às propriedades mecânicas e dinâmicas do citoesqueleto celular, notadamente o citoesqueleto da actomiosina, que é um gel ativo de filamentos de actina polar, motores de miosina e proteínas acessórias que exibem propriedades de contração intrínsecas. A visão usualmente aceita é que o citoesqueleto se comporta como um material viscoelástico. No entanto, esse modelo nem sempre pode explicar os resultados experimentais, que são mais consistentes com um quadro que descreve o citoesqueleto como um material ativo poroelástico - uma rede elástica embebida com citosol. Gradientes de contratilidade gerados pelos motores da miosina conduzem o fluxo do citosol através dos poros do gel, o que infere que a mecânica do citoesqueleto e do citosol estão firmemente acoplados. Uma das principais características da poroelasticidade é a relaxação difusiva das tensões na rede, caracterizada por uma constante de difusão efetiva que depende do módulo elástico do gel, porosidade e viscosidade do citosol (solvente). Como as células têm muitas maneiras de regular sua estrutura e propriedades materiais, nossa compreensão atual de como a mecânica do citoesqueleto e a dinâmica do fluxo citosol são acopladas permanece pouco compreendida. Aqui, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para caracterizar as propriedades materiais de géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo para o citoesqueleto celular. A contração do gel é impulsionada pela contratilidade motora da miosina, que leva ao surgimento de um fluxo do solvente penetrante. O artigo descreve como preparar esses géis e executar experimentos. Também discutimos como medir e analisar o fluxo de solvente e a contração do gel em escala local e global. As várias relações de escala usadas para quantificação de dados são dadas. Finalmente, os desafios experimentais e as armadilhas comuns são discutidos, incluindo sua relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

Duas lamínulas de vidro são usadas por experimento. As lamínulas de vidro são limpas e passivadas com polímeros PEG. A passivação é essencial para impedir que as proteínas solubilizadas aderam às superfícies de vidro nos estágios experimentais iniciais e para minimizar a interação da rede de contração com as paredes de vidro. A falha em alcançar uma boa passivação pode levar a uma contração ineficiente e, em casos extremos, pode até inibir a formação da rede de actina.
A F...

Neste trabalho, uma abordagem de reconstituição in vitro é empregada para estudar a poroelasticidade de géis de actomiosina sob condições controladas. A dinâmica do gel de actomiosina e do solvente incorporado é quantificada, através da qual a poroelasticidade da rede é demonstrada. Também discutimos os desafios experimentais, armadilhas comuns e relevância para a mecânica do citoesqueleto celular.

A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Desenvolvemos uma abordagem in vitro para caracterizar a mecânica dos géis de actomiosina poroelásticos como um sistema modelo do citoesqueleto celular e, mais geralmente, do citoplasma, que tem demonstrado se comportar como um material ativo poroelástico. Este método fornece informações sobre como a contratilidade da miosina contribui para o surgimento de um fluxo de fluido e como as velocidades da rede e do citosol estão correlacionadas no tempo e no espaço. Esta abordagem simples nos permite extrair as propriedades mecânicas de sistemas em evolução dinâmica sem usar nenhum equipamento ou técnica sofisticada onde ferramentas convencionais como AFIM não podem ser empregadas.Este método pode fornecer informações sobre a reologia de materiais ativos poroelásticos, independentemente da especificidade do gel ativo e do fluido incorporado. Para começar, coloque de 10 a 12 tampas de vidro número 1.5 em um suporte caseiro de politetrafluoretileno e prepare a solução de Piranha em um copo de 400 mililitros. Prepare a solução no gelo em uma capa química.Transfira o suporte para o copo recheado de Piranha. Após três horas, transfira o suporte para um copo limpo cheio de água fresca bidestil

the-mechanics-poro-elastic-contractile-actomyosin-networks-as-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

A microscopia dinâmica diferencial (DDM) combina características de dispersão dinâmica de luz e microscopia. Aqui, é apresentado o processo de utilização do DDM para caracterizar redes de citoesqueleto reconstituídas quantificando a dinâmica subdiffusiva e enjaulada de partículas em redes de vimentina e o movimento balístico de compostos ativos de actin-microtubulos movidos a miose.

Quantificando a Dinâmica do Citoesqueleto usando microscopia dinâmica diferencial

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Este trabalho apresenta protocolos para engenharia e caracterização de redes compostas tridimensionais sintonizáveis de filamentos de actina co-emaranhados e microtúbulos. Os compósitos sofrem reestruturação ativa e movimento balístico, impulsionados pelos motores de miosina II e cinesina, e são sintonizados pelas concentrações relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes passivos.

Reconstituindo e caracterizando compósitos de actina-microtúbulo com dinâmica e mecânica sintonizáveis acionadas por motor

A contratilidade da actomiosina desempenha um papel importante na morfogênese celular e tecidual. No entanto, é um desafio manipular agudamente a contratilidade da actomiosina in vivo . Este protocolo descreve um sistema optogenético que inibe rapidamente a contratilidade da actomiosina mediada por Rho1 em embriões de Drosophila , revelando a perda imediata da tensão epitelial após a inativação da actomiosina in vivo.

Inibição Optogenética da Contratilidade da Actomiosina Mediada por Rho1 Juntamente com a Medida da Tensão Epitelial em Embriões de Drosophila

Aqui, apresentamos métodos para preparar conjuntos de actina emaranhados, reticulados e de cristal líquido quase bidimensionais (2D) a partir de proteínas purificadas.

Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

Este protocolo descreve um ensaio de motilidade de grânulos com cauda de cometa de actina ajustável para investigar quantitativamente como a atividade do motor de miosina influencia a montagem da actina ramificada e a arquitetura da rede em uma interface semelhante à membrana.

Reconstituindo a Montagem de Actina Ramificada Mediada por Miosina-I em um Ensaio de Motilidade de Caudas de Cometa de Actina Baseado em Esferas

Tradicionais, duas técnicas de cultura de células dimensional muitas vezes resultam em características alteradas com relação a marcadores de diferenciação, citocinas e fatores de crescimento. Tridimensional de cultura de células no sistema de rotação de cultura de células (CCRs) restabelece a expressão de muitos destes fatores, como mostrado aqui com uma linha extravilosas trofoblasto celular.

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

Nós otimizamos uma técnica de microencapsulação como uma plataforma eficaz para a propagação 3D e diferenciação de células-tronco embrionárias a endoderme e (DA) dopaminérgicos neurônios. Ele também fornece uma oportunidade para imuno-isolamento de células do hospedeiro durante o transplante. Esta plataforma pode ser adaptado para outros tipos de células.

Microcápsulas de alginato como uma plataforma 3D para Propagação e Diferenciação de Células-Tronco Embrionárias (hESC) para diferentes linhagens

Aprenda a caracterizar a mecânica de géis de actomiosina poroelásticos como modelo do citoesqueleto celular. Este método in vitro revela como a contratilidade da miosina gera fluxo de fluido e correlaciona velocidades da rede e do citosol.

A Mecânica das Redes de Actomiosinas (Poro-)Contráteis Elásticas como Sistema Modelo do Citoesqueleto Celular

Explorar mais vídeos