Name: Modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a utilizar o modelo de peixe-zebra Danio rerio para estudar reações alérgicas induzidas por biomoléculas da saliva de carrapato. Este método ajuda a elucidar os mecanismos imunológicos da síndrome alfa-Gal.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do grupo SaBio por sua colaboração no projeto experimental e assistência técnica com a instalação experimental de peixes e Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, Espanha) pelo fornecimento de peixe-zebra. Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, Espanha e EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras é financiada pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espanha, bolsa IJC2020-042710-I.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade de Castilla La Mancha sob o estudo "Avaliação da resposta imune à vacina inativada contra M. bovis e desafio com M. marinum no modelo de peixe-zebra número PR-2017-05-12".
Os carrapatos foram obtidos da colônia de laboratório, onde amostras representativas de carrapatos na colônia foram testadas por PCR para patógenos comuns de carrapatos para confirmar a ausência de patógenos, e mantidas no Instituto de Parasitologia, Centro de Biologia da Academia Tcheca de Ciências (IP BC CAS), República Tcheca.Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a Lei de Proteção Animal da República Tcheca nº 246/1992 Sb (aprovação ética nº 34/2018).
1. Tratamento de peixe-zebra
NOTA: O ensaio é projetado para avaliar reações alérgicas e a resposta imune em peixes-zebra tratados com saliva de carrapato em resposta ao consumo de carne de mamíferos.
<ol><li>Tratar os peixes (conforme explicado na secção 4) com saliva de carrapato, comercial Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) (ver Tabela de Materiais), utilizado como controlo positivo, com solução salina tamponada com fosfato (PBS) como controlo negativo. O peixe-zebra adulto é distribuído aleatoriamente em três grupos com equilíbrio entre os sexos (Figura 1). NOTA: Qualquer outro composto desejado relacionado com AGS pode ser avaliado usando este modelo.</li>
</ol>2. Extração de saliva do carrapato Ixodes ricinus 
<ol><li>Use carrapatos fêmeas semi-ingurgitados livres de patógenos alimentados por 6-7 dias em cobaias.</li>
	<li>Tratar o carrapato com 5 μL de uma solução a 2% (m/vol) de cloridrato de pilocarpina em PBS (ver Tabela de Materiais) em pH 7,4 para o hemocoel usando uma seringa de 50 μL com uma agulha de 0,33 mm, como descrito anteriormente28 para induzir a produção de saliva do carrapato. NOTA: Os carrapatos são manipulados usando pinças; Seja cauteloso para não aplicar muita força ao agarrá-los.</li>
	<li>Coletar saliva usando uma ponta de 10 μL montada em uma micropipeta.<ol><li>Introduza a ponta dentro do carrapato com cuidado.</li>
		<li>Manter a saliva em um tubo de 1,5 mL sobre gelo, agrupá-la e armazená-la a -80 °C, conforme descrito anteriormente27.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar a concentração de proteína da saliva, para estabelecer a quantidade de proteína a ser injetada nos peixes, como em estudos anteriores27 usando um Kit de Ensaio de Proteína BCA (ver Tabela de Materiais) seguindo as recomendações do fabricante.</li>
</ol>3. Manutenção do peixe-zebra
<ol><li>Manter o peixe-zebra em um sistema de fluxo através da água a 27 °C com um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (Figura 2).</li>
	<li>Alimentar os peixes duas vezes ao dia, às 9h30 e às 13h30, com ração seca (50-70 μg/peixe) até o dia 2.</li>
	<li>Alimentar os peixes duas vezes ao dia, às 9h30 e às 13h30, com ração seca para cães (50-70 μg/peixe) a partir do dia 2 após a injeção do tratamento até o final do experimento</li>
</ol>4. Injeção de peixe-zebra
<ol><li>Selecionar 10 peixes por grupo com uma proporção semelhante de fêmeas/machos e peso semelhante. NOTA: O grupo 1 contém peixes injetados com PBS, o grupo 2 contém peixes injetados com saliva de carrapato e o grupo 3 contém peixes injetados com α-Gal.</li>
	<li>Anestesiar brevemente os peixes por imersão em metanossulfonato de tricaína a 0,02% (MS-222) (Filme 1). NOTA: Peixes devidamente anestesiados apresentam respiração normal e não nadam, enquanto podem ser colocados no fundo do tanque de água ou flutuando. Cada peixe deve ser anestesiado individualmente para evitar possíveis danos fisiológicos.</li>
	<li>Capturar os peixes anestesiados usando uma rede de pesca.</li>
	<li>Coloque o peixe em sua metade de lado, usando pinça ou mãos, cuidadosamente, sobre uma esponja molhada, com a nadadeira caudal do lado direito para injetar os compostos na mesma direção, a fim de controlar as lesões.</li>
	<li>Injetar grupos de peixes por via intradérmica, como em estudos anteriores26, no músculo a 5 mm da nadadeira caudal e a um ângulo de 45° em relação ao corpo do peixe (Filme 2). Utilizar o tratamento adequado nos dias 0, 3 e 8, conforme descrito anteriormente 27, com uma seringa de 100 μL equipada com uma agulha de 1 cm, 29 G com 1 μL (com 9 μg/μL de proteína) de saliva de I. ricinus em 10 μL de PBS (saliva de carrapato), 5 μg de α-Gal em 10 μL de PBS (α-Gal)27,  e 10 μL de PBS (Figura 3). OBS: O manuseio deve ser feito de forma rápida e cuidadosa para evitar qualquer dano físico ao animal. Outras biomoléculas presentes na saliva do carrapato podem ser avaliadas seguindo este protocolo.</li>
	<li>Coloque os peixes tratados de volta em um tanque de água doce sem anestesia para recuperação. OBS: Todos os peixes do mesmo grupo podem ser colocados no mesmo tanque de água para recuperação.</li>
</ol>5. Alimentação de peixes-zebra
<ol><li>Amasse a ração do cão com uma argamassa e pilão.</li>
	<li>Alimentar 50-70 μg/peixe duas vezes ao dia às 9:30 e 13:30 com ração seca até o dia 2.</li>
	<li>Alimentar 50-70 μg/peixe duas vezes ao dia às 9:30 e 13:30 com ração amassada do dia 2 após a injeção do tratamento até o final do experimento no dia 8. NOTA: Se forem avaliados marcadores de imunidade ou títulos de anticorpos para α-Gal ou IgE em resposta aos tratamentos ou à alimentação ao longo das diferentes inoculações, a alimentação será necessária até ao final da experiência.</li>
</ol>6. Avaliação de reações alérgicas, lesões e comportamento em zebrafish
<ol><li>Examinar o tipo hemorrágico de reações alérgicas (vermelhidão, descoloração e hemorragia da pele) usando uma lupa ou estereomicroscópio para precisão e indicar a localização de seu aparecimento nos peixes seguindo a categorização incluída na Tabela 1 (Figura 4A). OBS: As reações alérgicas apresentadas na Figura 4 surgiram após a injeção de saliva de carrapato e o consumo de ração contendo carne vermelha. Portanto, as reações descritas são do tipo de reações associadas à AGS, uma vez que reações semelhantes aparecem no contexto clínico.<ol><li>Observe se alguma reação aparece após os tratamentos e durante a administração de alimentos duas vezes ao dia enquanto os peixes estão no tanque de água.</li>
	</ol></li>
	<li>Examinar o comportamento dos peixes avaliando as mudanças27 nos padrões de nado (mobilidade, velocidade, ficar imóvel no fundo do tanque de água e nadar em zigue-zague) seguindo a categorização incluída na Tabela 1.</li>
	<li>Avaliar a mortalidade acumulada, informando o número de peixes mortos incluindo a hora/dia da morte (Figura 4B). OBS: Todos os parâmetros são avaliados logo após o tratamento ou após a troca da ração e acompanhados diariamente até o final do experimento no 8º dia categorizando as variáveis qualitativas (Tabela 1). Como recomendação, essa avaliação deve ser conduzida por um profissional com conhecimento sobre peixe-zebra para considerar mudanças comportamentais com base em sua formação e experiência de trabalho com este modelo animal.</li>
	<li>Calcule o número de peixes-zebra por dia com reações alérgicas relatadas, comportamento anormal e mudanças na alimentação em cada grupo e compare entre os grupos por um teste ANOVA unidirecional.</li>
</ol>7. Coleta de amostras
<ol><li>Eutanásia dos peixes por imersão em MS-222 0,04% no 8º dia. NOTA: Coletar também as amostras dos peixes que morrem de reações alérgicas durante o ensaio.</li>
	<li>Fixe o peixe em uma placa de parafina com alfinetes.</li>
	<li>Coletar soro dos vasos sanguíneos das emalhares 29 dos peixes imediatamente após a eutanásia, quando as brânquias ainda estiverem irrigadas com sangue, usando uma seringa de 0,5 mL equipada com uma agulha de 1 cm e29 G. Conservar num tubo de 1,5 ml a -20 °C até à sua utilização (filme 3).</li>
	<li>Cortar o peixe sagitalmente com lâmina de bisturi e avaliar as lesões internas (lesões hemorrágicas ou granulomas)27,30 se elas aparecerem. NOTA: As lesões não aparecem necessariamente, mas devem ser registradas se aparecerem.</li>
	<li>Coletar o intestino (Filme 4) e o rim (Filme 5) de cada peixe em tubos separados vazios de 1,5 mL, conforme descritoanteriormente 31, e armazená-los a -80 C (Figura 4C).</li>
	<li>Extraia o RNA total das amostras de intestino e rim do peixe-zebra usando um kit de purificação de RNA (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Analisar a expressão de genes relacionados à resposta imune conforme descrito anteriormente30,32 (ver Tabela 2 para sequências de primers) em zebrafish, realizando uma reação quantitativa em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-qPCR) usando uma mistura de transcrição reversa para RT-qPCR (ver Tabela de Materiais), de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar os valores de cT de RNAm contra D. rerio GAPDH e comparar entre os grupos (peixes tratados com saliva, α-Gal e os grupos tratados com PBS) usando um teste t de Student com variância desigual.</li>
	<li>Determinar títulos de anticorpos IgM que reconheçam α-Gal em zebrafish em amostras de soro por ELISA, conforme descrito anteriormente27,30. Registrar os títulos de anticorpos como valores de 450 nm, usando um leitor de placas, e comparar entre os grupos (peixes tratados com saliva, α-Gal e os grupos tratados com PBS) usando um teste t de Student com variância desigual. NOTA: A determinação dos títulos de anticorpos IgM e a análise do gene de expressão são opcionais e conduzidas apenas se forem necessárias informações imunológicas. A mistura RT-qPCR é um kit de síntese de cDNA de primeira fita para análise de expressão gênica usando qPCR em tempo real.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O peixe-zebra é um modelo custo-efetivo e de fácil manuseio, que também tem sido uma ferramenta bastante viável para o estudo de mecanismos moleculares da resposta imune, doenças patogênicas, testes de novas drogas e vacinação e proteção contra infecções33,34,35. O estudo sobre o comportamento do peixe-zebra é útil, uma vez que estudos anteriores descobriram que algumas espécies de peixes permanecem imóveis no fundo do tanque qu...

Os carrapatos são vetores de patógenos causadores de doenças e também são causadores de reações alérgicas, afetando a saúde humana e animal em todo omundo1,2. Durante a alimentação do carrapato, biomoléculas presentes na saliva do carrapato, especialmente proteínas e lipídios, facilitam a alimentação desses ectoparasitas, evitando as defesas do hospedeiro3. Algumas biomoléculas salivares com modificações no glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) levam à produção de altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE após a picada do carrapato, apenas em alguns indivíduos, o que é conhecido como Síndrome de α-Gal (AGS)4. Trata-se de uma doença associada à alergia mediada por IgE que pode resultar em anafilaxia a picadas de carrapatos, consumo de carne de mamíferos não primatas e alguns fármacos, como o cetuximabe5. As reações à α-Gal são frequentemente graves e algumas vezes podem ser fatais 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
O α-Gal é encontrado em todos os mamíferos, exceto macacos do Velho Mundo, macacos e humanos que não têm a capacidade de sintetizar α-Gal13. Entretanto, patógenos como bactérias e protozoários expressam esse glicano em sua superfície, o que pode induzir a produção de grandes quantidades de anticorpos IgM/IgG anti-α-Gal e pode ser um mecanismo protetor contra esses patógenos16,17. Entretanto, a produção de anticorpos anti-α-Gal aumenta o risco de desenvolvimento de alergias anti-α-Gal mediadas por IgE 7,13. Anticorpos naturais anti-α-Gal produzidos em humanos, principalmente dos subtipos IgM/IgG, poderiam estar associados a essa modificação presente em bactérias da microbiota intestinal16. A AGS pode ser um diagnóstico clínico desafiador, uma vez que o principal método diagnóstico no momento baseia-se na história clínica de reações alérgicas tardias, especialmente associadas a alergias alimentares (isto é, prurido, urticária localizada ou angioedema recorrente à anafilaxia, urticária e sintomas gastrointestinais) e na dosagem de anticorpos IgE anti-α-Gal9. Os achados atuais sugerem que a picada de carrapato constitui um dos principais riscos no aparecimento da AGS 18,19, um aumento de 20 vezes ou mais nos níveis de IgE para α-Gal após uma picada de carrapato 19, uma história de picada de carrapato em pacientes com AGS20,21,22, a existência de anticorpos reativos a antígenos de carrapatos em pacientes com AGS 19, e que a IgE anti-α-Gal está fortemente relacionada aos níveis de IgE anti-carrapato19,23, mas mais estudos são necessários para avaliar quais biomoléculas estão realmente envolvidas.
Além disso, outro cenário possível são pacientes que apresentam fortes reações alérgicas a picadas de carrapatos e altos níveis de anticorpos anti-α-Gal IgE, mas são tolerantes ao consumo de carne de mamíferos12. Portanto, a alergia à carne de mamíferos pode ser um tipo particular de alergia relacionada à picada de carrapato. As principais espécies de carrapatos associadas à AGS incluem Amblyomma americanum (EUA), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium e Haemaphysalis longicornis (Japão), Ixodes holocyclus (Austrália) e Ixodes ricinus (principal vetor da borreliose de Lyme na Europa)11,24. 
O único modelo que tem sido utilizado para avaliar a produção de IgE relacionada a picadas de carrapatos é o modelo de camundongos geneticamente modificados com o gene para camundongos knocked out de α−1,3-galactosiltransferase (α-Gal KO)25,26, pois, assim como outros mamíferos, camundongos também expressam α-Gal em proteínas e lipídios e não produzem IgE para α-Gal. No entanto, o peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo útil para pesquisas biomédicas aplicadas a mamíferos porque compartilha muitas semelhanças anatômicas com mamíferos e, como os humanos, também é incapaz de sintetizar α-Gal. Como o α-Gal não é produzido naturalmente em peixe-zebra, é um modelo acessível, fácil de manipular e permite um alto tamanho de amostra para o estudo de reações alérgicas relacionadas ao α-Gal.
Neste estudo, o zebrafish é utilizado como organismo modelo para caracterizar e descrever reações alérgicas locais, padrões comportamentais e mecanismos moleculares associados à resposta à sensibilização percutânea à saliva do carrapato26,27 e subsequente consumo de carne de mamíferos. Para este fim, os peixes são expostos à saliva do carrapato por injeção intradérmica e, em seguida, são alimentados com ração para cães, que contém produtos derivados da carne de mamíferos adequados para uso animal que contém α-Gal27, em seguida, possíveis reações alérgicas relacionadas são avaliadas. Este método pode ser aplicado ao estudo de outras biomoléculas relacionadas a processos alérgicos, especialmente aquelas relacionadas à AGS.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>Aquatics facilities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Conjunto de Disection Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-1279</td><td></td></tr><tr><td>Ração para Cães - Vermelho</td> Pratos ELISA Classic <td>Acana-96</td><td></td><td></td></tr><tr><td>well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10547781</td><td></td></tr><tr><td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&alpha;-Gal)&nbsp;</td><td>Seringas de</td><td></td> Microlitro Supermix Supermix NGP0203 <td></td></tr><tr><td>iScript Transcrição Reversa</td><td></td> Dextra <td>1708840</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de pilocarpina&nbsp;</td>Ponta de pipeta <td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>P10&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-0364</td><td></td></tr><tr><td>Ponta de pipeta P1000</td><td>VWR</td><td>613-0359</td><td></td></tr><tr><td>Alimento premium peixe tropical</td><td>DAPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esponja Porta-animais&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Feito de espuma de sucata</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>termociclador PCR em tempo real</td><td>qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanossulfonato de tricaína (MS-222)</td> <td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato

Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

Os carrapatos são artrópodes vetores que causam doenças por transmissão de patógenos e cujas picadas podem estar relacionadas a reações alérgicas que impactam a saúde humana em todo o mundo. Em alguns indivíduos, altos níveis de anticorpos de imunoglobulina E contra o glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) foram induzidos por picadas de carrapatos. As reações anafiláticas mediadas por glicoproteínas e glicolipídios contendo o glicano α-Gal, presentes na saliva do carrapato, estão relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS) ou alergia à carne de mamíferos. O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrado amplamente utilizado para o estudo de diferentes patologias. Neste estudo, o peixe-zebra foi usado como modelo para o estudo de reações alérgicas em resposta ao consumo de carne de α-Gal e mamíferos porque, assim como os humanos, eles não sintetizam esse glicano. Para isso, foram avaliados os padrões comportamentais e as reações alérgicas do tipo anafilático hemorrágico em resposta ao consumo de saliva do carrapato Ixodes ricinus e carne de mamíferos. Esta abordagem experimental permite a obtenção de dados válidos que suportam o modelo animal do peixe-zebra para o estudo de alergias transmitidas por carrapatos, incluindo a AGS.

O protocolo aqui apresentado é baseado em vários aspectos de experimentos previamentepublicados27,30 e resultados realizados em nosso laboratório onde o modelo do zebrafish é estabelecido e validado para o estudo da AGS e da resposta imune ao α-Gal, pois tanto humanos quanto zebrafish não sintetizam essa molécula13. Este modelo permite caracterizar e avaliar uma variedade de reações alérgicas como resultado da resposta do hospedeiro à sali...

Aqui, o peixe-zebra (Danio rerio) é usado como modelo para estudar reações alérgicas e respostas imunes relacionadas à síndrome alfa-Gal (AGS), avaliando reações alérgicas à saliva de carrapatos e ao consumo de carne de mamíferos.

Modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

A questão é por que apenas alguns indivíduos expostos a picadas de carrapatos desenvolvem reações alérgicas. Para nós, elucidar as biomoléculas presentes na saliva do carrapato e os mecanismos imunológicos que envolvem esse processo é fundamental para resolver essa questão. O modelo animal da síndrome alfa-Gal reproduz padrões comportamentais humanos e reações alérgicas em resposta à saliva do carrapato.Esta abordagem experimental avança na compreensão da interação molecular carrapato-hospedeiro na qual temos conflito associado com a síndrome alfa-Gal e cooperação associada com a resposta de anticorpos para alfa-Gal, que são protetores contra a infecção por patógenos. Para tratar os peixes com saliva de carrapato, distribua peixes-zebra adultos em três grupos equilibrados em termos de gênero. Use Gala1-3Gal-BSA 3 ou alfa-Gal comercial como controle positivo e PBS como controle negativo.Para a extração de saliva, utilizar carrapatos fêmeas semi-ingurgitadas, livres de patógenos, alimentadas por seis a sete dias em cobaias. Trate o carrapato com cinco microlitros de uma solução a 2% de cloridrato de pilocarpina em PBS a pH 7,4 no hemocoel usando uma seringa de 50 microlitros com uma agulha de 0,33 milímetros. Coletar saliva do carrapato hipostomo usando uma ponta de 10 microlitros montada em uma micropipeta.Coloque a saliva em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo e armazene-a a 80 graus Celsius negativos. Determinar a concentração de proteína da saliva para estabelecer a quantidade de proteína a ser injetada no peixe usando um kit de ensaio de proteína BCA, seguindo as recomendações do fabricante. Mantenha o peixe-zebra em um sistema de água de fluxo a 27 graus Celsius com um ciclo claro-escuro de 14 a 10 horas.Em seguida, selecione 10 peixes por grupo com uma proporção semelhante de fêmeas para machos e peso semelhante para injeção. Anestesiar brevemente os peixes por imersão em metanossulfonato de tricaína a 0,02%. Colocar o peixe anestesiado em sua metade lateral, utilizando pinça ou mãos, cuidadosamente, sobre uma esponja molhada, com a nadadeira caudal do lado direito para injetar os compostos na mesma direção para controlar as lesões.Injetar grupos de peixes por via intradérmica no músculo com uma seringa de 100 microlitros equipada com uma agulha de um centímetro e calibre 29 a cinco milímetros para a nadadeira caudal e um ângulo de 45 graus para o corpo do peixe. Após a injeção, coloque o peixe tratado de volta em um tanque de água doce sem anestesia para recuperação. Alimente os peixes duas vezes ao dia às 9h30.e 13h30 com 50 a 70 microgramas de ração seca por peixe até o segundo dia. Em seguida, amasse a ração do cão com uma argamassa e pilão para alimentar os peixes do segundo dia após a injeção do tratamento até o final do experimento no oitavo dia.Para a coleta das amostras, fixar os peixes eutanasiados em uma placa de parafina com pinos. Coletar o soro dos vasos sanguíneos branquiais dos peixes quando as brânquias ainda estiverem irrigadas com sangue usando uma seringa de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de um centímetro e calibre 29. Armazenar o soro coletado em um tubo de 1,5 mililitro a 20 graus Celsius até o uso.Cortar o peixe sagitalmente com uma lâmina de bisturi e avaliar as lesões internas. Em seguida, colete o intestino e o rim de cada peixe em tubos separados de 1,5 mililitro. Extraia o RNA total do intestino e do rim usando um kit de purificação de RNA.Analisar a expressão de genes relacionados à resposta imune, realizando transcrição reversa quantitativa - reação em cadeia da polimerase, ou RT-qPCR utilizando uma mistura de transcrição reversa para RT-qPCR, de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar os valores de cT de mRNA contra o GAPDH do peixe-zebra e comparar entre os grupos usando um teste t de Student com variância desigual. Determinar títulos de anticorpos IgM que reconhecem alfa-Gal em amostras de soro por ELISA.Registrar os títulos de anticorpos como valores de densidade óptica de 450 nanômetros usando um leitor de placas e comparar entre os grupos usando um teste t de Student com variância desigual. Este modelo de zebrafish permite a caracterização e avaliação de várias reações alérgicas devido à resposta do hospedeiro à saliva do carrapato e sua implicação na síndrome alfa-Gal, ou AGS. Além disso, em comparação com os peixes controle, alterações em comportamentos como nadar lentamente, deitar no fundo do tanque e não comer, vibrar ou ziguezaguear foram observadas em peixes tratados com saliva de carrapato.Uma incidência significativa de reações alérgicas foi observada em peixes tratados com saliva de carrapato, mostrando rápida dessensibilização e tolerância. A mudança comportamental foi mais pronunciada nos peixes tratados com saliva de carrapato do que apenas com alfa-Gal. Análise adicional da expressão dos marcadores imunes representativos foi realizada por RT-PCR.Os resultados mostraram diferenças entre os grupos de peixe-zebra no rim, onde os marcadores de resposta imune foram regulados negativamente em peixes tratados com saliva e alfa-Gal em comparação com o grupo controle. Além disso, os peixes-zebra tratados com saliva e alfa-Gal desenvolveram anticorpos IgM contra alfa-Gal que mostraram níveis mais altos do que em peixes tratados com PBS. A injeção do tratamento, a avaliação das reações alérgicas e do comportamento e o relato do número de peixes mortos por reações alérgicas são os aspectos mais importantes do protocolo.O uso de tecnologias ômicas nos níveis de mRNA, proteína e também microbioma para caracterizar a resposta à saliva do carrapato permite identificar as principais biomoléculas envolvidas nesse processo.

zebrafish-animal-model-for-study-allergic-reactions-response-to-tick

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A coleta de hemolinfa do carrapato infectado, glândulas salivares e saliva é importante estudar como a transmitida por carrapatos patógenos causam doenças. Neste protocolo, demonstramos como coletar glândulas salivares e hemolinfa de...

A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

A resposta imune inata protege os organismos contra uma infecção patogénica. Um componente crítico da resposta imune inata, a explosão respiratória de fagócitos, gera espécies reativas de oxigênio, que matam microorganismos invasores. Nós descrevemos um ensaio de explosão respiratória que quantifica as espécies reativas de oxigênio produzidas quando a resposta imune inata é induzida quimicamente.

Quantificação da Resposta explosão respiratória como um indicador da imunitário inatas Saúde em Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e imagem de uma infecção bacteriana localizada na vesícula ótica do peixe-zebra.

Imagem não invasivo do imunitário inatas Response em um modelo de peixe-zebra larval de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Aqui descrevemos um protocolo para a imunização do adulto peixe-zebra (Danio rerio) com uma vacina baseada em DNA e demonstrar a validação de um evento de sucesso da vacinação. Este método é adequado para o rastreio pré-clínico de candidatos vacinais em vários modelos de infecção.

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

Este protocolo descreve um modelo de infecção de Aspergillus em larvas de zebrafish. Os esporos de aspergillus são microinjetados na cérebro traseira das larvas, e o tratamento químico é usado para induzir a imunossupressão. A progressão da infecção é monitorada através de uma configuração diária de imagens para monitorar o crescimento fúngico e as respostas imunológicas, bem como a enumeração de esporos vivos por placa de unidade formadora de colônias.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Este artigo apresenta a metodologia para exposição humana a larvas de Ixodes scapularis para pesquisa clínica. A técnica é relativamente simples, tolerável pelos voluntários da pesquisa, podendo ser modificada de acordo com as necessidades experimentais. Essa pesquisa envolvendo seres humanos deve ser conduzida de acordo com protocolos de estudos clínicos aprovados pelas autoridades reguladoras apropriadas.

Um modelo para exposição experimental de humanos a larvas de carrapatos Ixodes scapularis

Aqui, apresentamos um protocolo para coletar saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio, após a dissecção de um carrapato alimentado individualmente, para estudar a localização específica do tecido de patógenos transmitidos por carrapatos para avançar na compreensão da competência do vetor e das interações patógeno-microbioma.

Extração de saliva, hemolinfa, glândulas salivares e intestino médio de carrapatos individuais (Acari: Ixodidae)

Este método descreve o desenvolvimento de um sistema de alimentação sanguínea de carrapatos in vitro , incorporando uma câmara impressa em 3D e uma membrana de silicone fabricada em laboratório. O sistema permite a alimentação artificial de carrapatos, facilitando a amostragem em vários estágios de alimentação e utilizando baixos volumes de sangue, fornecendo uma ferramenta inestimável para estudar carrapatos ixódidas.

Sangue de carrapato se alimentando através de uma membrana artificial em uma câmara impressa em 3D em pesquisa de carrapatos Ixodid

Para modelar como os sinais inflamatórios influenciam o neurodesenvolvimento em organismos geneticamente suscetíveis, apresentamos um protocolo para microinjeção de IL-6 no ducto de Cuvier (veia cardinal comum) das larvas de peixe-zebra, possibilitando indução controlada da inflamação e avaliação de seu impacto no desenvolvimento no contexto do complexo de esclerose tuberosa (TSC).

Microinjeção de Interleucina-6 na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra do TSC para estudar comportamentos semelhantes a transtornos neuropsiquiátricos

Aprenda a utilizar o modelo de peixe-zebra Danio rerio para estudar reações alérgicas induzidas por biomoléculas da saliva de carrapato. Este método ajuda a elucidar os mecanismos imunológicos da síndrome alfa-Gal.

Modelo animal de peixe-zebra para o estudo de reações alérgicas em resposta a biomoléculas de saliva de carrapato

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