Name: Um Modelo de Rato de Intubação Orotraqueal e Cirurgia de Reperfusão de Isquemia Pulmonar Ventilada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a técnica de intubação orotraqueal e cirurgia de reperfusão de isquemia pulmonar ventilada em ratos. Este modelo minimiza a inflamação por atelectasia e hipóxia, mantendo o sistema imune circulatório intacto para estudos de patofisiologia pulmonar.

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Este trabalho foi financiado pelo apoio departamental do Departamento de Anestesia e Cuidados Perioperatórios, Universidade da Califórnia em São Francisco e San Francisco General Hospital, bem como por um prêmio NIH R01 (para AP): 1R01HL146753.

Todos os procedimentos e etapas descritos abaixo foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade da Califórnia em São Francisco. Qualquer cepa de camundongo pode ser usada, embora algumas cepas tenham uma resposta inflamatória IR pulmonar mais robusta em comparação comoutras 12. Ratos que são aproximadamente 12-15 semanas de idade (30-40 g) ou mais velhos toleram e sobrevivem à cirurgia de IR pulmonar melhor do que os ratos mais jovens. Camundongos machos e fêmeas podem ser usados para essas cirurgias.
1. Protocolo de Intubação do Rato
<ol><li>Anestesia e preparação para intubação<ol><li>Limpe o abdômen do rato com um cotonete de etanol. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol (250-400 mg/kg). Avaliar a profundidade adequada da anestesia pela falta de reflexo de retirada do pedal. Coloque a pomada lubrificante para os olhos agora ou mais tarde (passo 2.1.4). NOTA: Para este procedimento, o tribromoetanol (e o etomidato como opção alternativa) fornece um plano anestésico estável sem afetar as condições hemodinâmicas necessárias para esta cirurgia. Este anestésico é usado apenas uma vez para evitar o risco de aderências peritoneais. O isoflurano também pode ser usado, mas não o usamos aqui. O praticante é livre para usar qualquer receita anestésica que achar melhor.</li>
		<li>Coloque o rato anestesiado em um suporte de intubação ou suporte de plástico em decúbito dorsal, suspenso por seus incisivos superiores em suturas 4-0 em loop (seda ou outra) em duas âncoras de suporte.</li>
		<li>Para manter o rato imobilizado durante o procedimento de intubação, tape frouxamente a parte inferior do tórax (ou ambos os membros superiores) na plataforma.</li>
		<li>Coloque a luz flexível de fibra óptica suavemente na traqueia do rato, ligeiramente abaixo das cordas vocais. Ajuste o nível de iluminação para que apenas um campo escuro seja visível ao olhar para a orofaringe do rato, exceto a luz vermelha que emana de baixo das cordas vocais, demonstrando o alvo para a eventual colocação do tubo endotraqueal. Observe que os movimentos das cordas vocais devem ser visíveis a olho nu ou, se necessário, sob ampliação.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento de intubação<ol><li>Segure as pinças com a mão dominante e use-as para segurar suavemente e tirar a língua da cavidade oral.</li>
		<li>Abra a mandíbula inferior usando fórceps segurado pela mão não dominante e, em seguida, empurre a pinça para a laringe para levantar suavemente a epiglote. Neste momento, solte a língua das pinças.</li>
		<li>Procure as cordas vocais. Eles devem abrir e fechar de acordo com cada respiração. Segurando a cânula com o fio-guia pré-carregado, insira a ponta do fio através das cordas vocais.</li>
		<li>Tendo muito cuidado para não mover o fio, segurando uma parte dele que está fora da cânula, mas logo acima das cordas vocais, retire a cânula, deixando apenas o fio no lugar com sua extremidade distal dentro da traqueia.</li>
		<li>Neste ponto, realize uma segunda visualização das cordas vocais para confirmar que a ponta distal do fio permanece passada através das cordas vocais iluminadas e na traqueia, e não está no esôfago não iluminado.</li>
		<li>Segure o fio fora da boca com a pinça curva na mão esquerda, estabilizada contra uma superfície dura, e avance cuidadosamente o cateter 20G com asas de fita sobre o fio.</li>
		<li>Uma vez que a extremidade distal do fio emerge da extremidade traseira do cateter 20G ou tubo endotraqueal, segure essa extremidade com a pinça curva e avance suavemente o cateter 20G para a traqueia.</li>
		<li>Retire cuidadosamente o fio da extremidade distal do cateter 20G com a pinça curva sem desalojar a colocação do cateter.</li>
		<li>Conecte brevemente o cateter ao ventilador antes de prendê-lo para confirmar a colocação adequada na traqueia e não no esôfago. Confirmar a colocação traqueal pela observação de movimentos bilaterais da parede torácica dependentes da ventilação mecânica e da ausência de insuflação do estômago.</li>
	</ol></li>
	<li>Pós-intubação<ol><li>Desconecte o cateter do ventilador. Fixe as asas da fita (presas ao cateter) através do lábio inferior do rato usando uma sutura de vicril 4-0 para fixar firmemente o tubo endotraqueal (TET) ao rato durante todos os procedimentos/manipulações subsequentes. NOTA: Alternativamente, fita de seda ou outra fita pode ser usada para fixar o ETT, no entanto, deve-se tomar cuidado para evitar o deslocamento do ETT durante o movimento do animal do trenó de intubação para a superfície cirúrgica.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o rato do trenó de intubação. Conecte brevemente o cateter ao ventilador com um volume corrente de 0,2-0,225 mL e uma frequência respiratória de 120-150 respirações por minuto para confirmar a colocação traqueal correta do tubo orotraqueal e, em seguida, desconecte-se com o camundongo respirando espontaneamente através do tubo orotraqueal.</li>
		<li>Não deixe o animal desacompanhado a partir deste ponto em diante até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal no final do procedimento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protocolo cirúrgico de isquemia e reperfusão pulmonar (RI)
<ol><li>Analgesia e preparo do sítio cirúrgico<ol><li>Limpe o abdômen do rato com um cotonete de etanol e injete buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via intraperitoneal.</li>
		<li>Raspe o cabelo sobre a área do tórax esquerdo até a escápula esquerda. Remova o excesso de cabelo raspado usando cotonetes com álcool. NOTA: As etapas 2.1.1 e 2.1.2 também podem ser executadas antes da intubação se houver preocupação com o deslocamento do ETT quando fixado com fita de seda.</li>
		<li>Coloque o rato numa almofada de aquecimento numa posição lateral esquerda ou 3/4 virada e ligue o tubo traqueal no ventilador com um volume corrente de 0,2-0,225 ml (~8 mg/kg) e uma frequência respiratória de 120-150 respirações por minuto. Não use oxigênio suplementar para este procedimento.</li>
		<li>Aplique lubrificante ocular com um cotonete estéril de ponta de algodão. Vire o rato para 3/4 do lado esquerdo para cima e imobilize todos os quatro membros e a cauda com fita adesiva de laboratório.</li>
		<li>Desinfete a área da pele raspada e a pele circundante com iodopovidona e espere a solução secar. Em seguida, cubra o campo cirúrgico com uma cortina estéril ou filme plástico transparente e crie uma abertura retangular na cortina ou filme plástico para o campo cirúrgico.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento cirúrgico<ol><li>Confirme o nível apropriado de anestesia (fornecido pela administração de tribromoetanol e buprenorfina, conforme descrito anteriormente) testando a resposta à beliscão do dedo do pé.</li>
		<li>Usando um par de tesouras afiadas e um par de pinças maiores (pinça de padrão estreito ou similar), faça uma incisão cutânea transversal de 2 cm abaixo do ângulo inferior da escápula no tórax lateral esquerdo. Use a tesoura e um par mais fino de fórceps (pinça de graefe extra fina ou similar) para cortar a camada muscular e dissecar até as costelas.</li>
		<li>Identifique o segundo espaço intercostal e segure a segunda costela com a pinça extra fina. Puxando a costela para cima, use uma lâmina de bisturi estéril #11 ou #12 (curva) (sem alça necessária) para entrar no espaço pleural, separando e cortando os músculos intercostais do2º-3º espaço. Considere pausar a ventilação para reduzir a lesão no ápice do pulmão esquerdo.</li>
		<li>Inserir três afastadores esterilizados. Use o retrator cefálico menor/mais estreito ao longo da orientação das costelas, o afastador de tamanho médio à esquerda ao longo da 2ª costela e o maior afastador à direita ao longo da superfície da3ª costela.</li>
		<li>Abra o tórax com retração lenta e progressiva usando os cabos elásticos do afastador. Expor e identificar a artéria pulmonar esquerda (AP) movendo o ápice do pulmão esquerdo para longe com um cotonete estéril de ponta de algodão.</li>
		<li>Use a pinça micro, pinça ultrafina na mão direita e PA ou pinça dilatadora do vaso na mão esquerda, para expor suavemente e criar o campo no qual a AP esquerda e o brônquio são visíveis.</li>
		<li>Usando a pinça PA, pegue a PA esquerda e puxe suavemente, mas firmemente para cima e cefálico para visualizar o brônquio transparente abaixo. Aumente a ampliação no microscópio de dissecção (consulte a lista de equipamentos para obter mais detalhes) neste ponto até o máximo (2x). NOTA: Esterilize todos os equipamentos antes de usar. Além disso, para manter a esterilidade, apenas as pontas dos instrumentos cirúrgicos devem entrar no campo cirúrgico estéril.</li>
		<li>Ao retrair o PA para longe do brônquio, passe cuidadosamente a pinça ultrafina fechada através do espaço entre o PA esquerdo e o brônquio. Em seguida, use essas pinças para segurar e puxar um 7-0 ou 8-0 sutura de proleno através do espaço entre a artéria pulmonar esquerda (acima) e brônquio (abaixo).</li>
		<li>Circunde o PA esquerdo amarrando um nó deslizante para criar uma oclusão no PA. A interrupção do fluxo sanguíneo é facilmente visualizada ao microscópio. Isso marca o início do período isquêmico.</li>
		<li>Exteriorizar a extremidade livre do nó através de um ponto de entrada diferente no tórax anterior esquerdo usando uma agulha 24G-28G e fixar a extremidade da sutura com um pequeno pedaço de fita adesiva para facilitar a identificação posterior.</li>
		<li>Reinflar o pulmão para expelir o máximo de ar possível para fora da cavidade torácica usando uma válvula PEEP / tubulação no ventilador do roedor. Em seguida, feche a caixa torácica com duas suturas de nylon 4-0 interrompidas.</li>
		<li>Feche o músculo e a camada subcutânea com uma sutura de nylon 4-0 corrida. Em seguida, aplique duas ou três gotas de bupivacaína tópica (0,5%) na incisão. Use uma sutura de nylon 4-0 para fechar a camada de pele com uma sutura em execução.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuidados pós-operatórios<ol><li>Quando a ventilação espontânea for retomada, desconecte o tubo endotraqueal do ventilador e extube o rato.</li>
		<li>Coloque o rato na almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante a recuperação pós-anestésica precoce.</li>
		<li>Monitore cuidadosamente o rato enquanto se recupera da anestesia geral. Puxe o nó externo suavemente no final do período isquêmico (30 min ou 1 h).</li>
		<li>Mova o rato da almofada de aquecimento para uma gaiola assim que tiver apresentado sinais de recuperação: auto-endireitamento e/ou movimento.</li>
		<li>Após o período de reperfusão (1 h ou 3 h), eutanasiar o animal e coletar sangue por punção cardíaca e tecido pulmonar para posterior análise. Para reperfusão de 1 h, coletar plasma para ELISA, tecido para RNA e análise de proteínas; para reperfusão de 3 h, coletar adicionalmente tecido para histologia.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis+mediates+inflammation+in+lung+ischemia-reperfusion+%28IR%29+sterile+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+mediates+dormant+neutrophil+recruitment+following+sterile+lung+injury+and+protects+against+subsequent+bacterial+pneumonia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1337(2017).</li>
<li>Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+gut+microbiome-derived+propionate+levels+are+associated+with+reduced+sterile+lung+inflammation+and+bacterial+immunity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 159(2019).</li>
<li>Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+immune+tone+via+gut-lung+axis%3A+Gut-derived+LPS+and+short-chain+fatty+acids%27+immunometabolic+regulation+of+lung+IL-1%CE%B2%2C+FFAR2%2C+and+FFAR3+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este manuscrito detalha as etapas envolvidas na realização do modelo de RI pulmonar ventilada desenvolvido por Dodd-o et al.9. Esse modelo ajudou a identificar as vias moleculares envolvidas na geração e resolução da inflamação da RI pulmonar isoladamente 14,15,16,17, da RI pulmonar em combinação com a infecção coexistente 18 e da RI pulmonar em relação ao eixo intestino-pulmão e à contribuição do microbioma intestinal13,18,19<s...

A lesão por isquemia reperfusão (RI) pode ocorrer quando o fluxo sanguíneo é restaurado para um leito de órgão ou tecido após algum período de interrupção. No pulmão, a RI pode ocorrer isoladamente ou em associação com outros processos prejudiciais, como infecção, hipóxia, atelectasia, volutrauma (de volumes correntes elevados durante a ventilação mecânica), barotrauma (alto pico ou pressões sustentadas durante a ventilação mecânica) ou lesão por contusão pulmonar contusa contundente (não penetrante) 1,2,3 . Ainda existem várias lacunas em nosso conhecimento sobre os mecanismos do LIRI e o impacto dos processos simultâneos (por exemplo, infecção) nos desfechos do LIRI, e também as opções de tratamento para o LIRI são limitadas. Um modelo in vivo de LIRI puro é necessário para identificar a fisiopatologia da lesão da RI pulmonar isoladamente e para estudar sua contribuição para qualquer processo multi-hit do qual a lesão pulmonar seja um componente.
Modelos de RI pulmonar murina podem ser usados para estudar a fisiopatologia pulmonar específica de múltiplos processos, incluindo transplante pulmonar3, embolia pulmonar4 e lesão pulmonar após trauma hemorrágico com ressuscitação5. Os modelos atualmente utilizados incluem transplante pulmonar cirúrgico6, pinçamento hilar7, perfusão pulmonar ex vivo 8 e RI pulmonar ventilada9. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de RI pulmonar ventilada murina de lesão pulmonar estéril. Existem múltiplos benefícios dessa abordagem (Figura 2), incluindo que ela induz hipóxia mínima e atelectasia mínima, e é um modelo de cirurgia de sobrevida que permite estudos de longo prazo.
As razões para escolher este modelo de LIRI em detrimento de outros modelos, como os modelos de pinçamento hilar e perfusão ex vivo , são as seguintes: este modelo minimiza as contribuições inflamatórias da atelectasia, ventilação mecânica e hipóxia; preserva a ventilação cíclica; mantém um sistema imunológico circulatório in vivo intacto que pode responder à lesão por RI; e, finalmente, como procedimento de sobrevida, permite a análise a longo prazo dos mecanismos de geração de lesão secundária (modelos 2-hit) e resolução da lesão. No geral, acreditamos que este modelo de IR pulmonar ventilado fornece a forma "mais pura" de lesão de IR que pode ser estudada experimentalmente.
Outras publicações descreveram o uso da intubação orotraqueal de camundongos para a realização de injeções ou instalações de TI10,11, mas não como ponto de partida para uma cirurgia de sobrevida como neste modelo. A colocação de um tubo orotraqueal permite a realização de cirurgia pulmonar, permitindo o colapso do pulmão operatório. Também permite a reinsuflação do pulmão no final do procedimento, o que é crítico para o pneumotórax e para a capacidade do rato de retornar à ventilação espontânea na conclusão dos procedimentos. Finalmente, a remoção do tubo orotraqueal seguro é um procedimento simples que, ao contrário de uma traqueostomia invasiva, é compatível com uma cirurgia de sobrevivência. Isso permite estudos de pesquisa de longo prazo focados na compreensão da progressão e resolução do LIRI e distúrbios associados, bem como a criação de modelos de lesões crônicas.

<table><tbody><tr><td>EquipmentTubo de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>luz de fibra óptica</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-41720-65</td><td>Tubo de luz</td></tr> de <tr><td>fibra óptica Fonte de luz de fibra óptica</td><td>AmScope</td><td>SKU: CL-HL250-B Fonte de</td><td>luz para luzes de fibra óptica</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Cell Point Scientific, Inc.</td><td>No.5-1450</td> Almofada de aquecimento do <td>esterilizador de contas</td></tr><tr><td></td><td>AIMS</td><td>14-370-223</td><td>Opção alternativa</td></tr><tr><td>Kits de preparação de lítio.íon (máquina de cortar cabelo)</td> <td>WAHL produtos domésticos</td><td>SKU 09854-600B</td><td>Para remover pêlos de rato no local cirúrgico</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10</td><td>Outras opções mais recentes disponíveis no site da empresa</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator Havard</td><td>Apparatus</td><td>Model 845</td><td>Ventilador de mouse</td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08895-05</td><td>Ferramentas limpas que foram usadas na operação</td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>Kent Scientific</td><td>RT-0501</td><td>Para manter o mouse aquecido enquanto se recupera da cirurgia</td></tr><tr><td>Balança</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-11003-41</td><td>Balança</td></tr><tr><td>Ferramentas de cirurgia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura de Seda</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td>Para fechar a camada muscular</td></tr><tr><td>7-0 Sutura de Prolene</td><td>Indústria de Ethicon</td><td>EP8734H</td><td>Uso para fazer um nó deslizante da artéria pulmonar esquerda</td></tr><tr><td>Bard-Parker (11) Bisturi (Lâmina Cirúrgica de Aço Carbono Costela, estéril, uso único)</td> <td>372611 Cirúrgica Aspen</td><td></td><td>Para entrar na cavidade torácica (opção 1)</td></tr> <tr><td>Bard-Parker (12) Bisturi</td><td>Aspen Cirúrgico</td><td>372612</td><td>Para entrar na cavidade torácica (opção 2)</td></tr><tr><td>Pinça Graefe Extra Fina</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>Pinça de retenção muscular/costela</td></tr><tr><td>Sistema de Retração do Fixador Magnético</td><td>FST</td><td>1. Placa de base (N.º 18200-03) 2. Fixadores (Nº 18200-01) 3. Afastadores (Nºs 18200-05 a 18200-12) 4. Elastômero (Nos.18200-07) 5. Retrator (No.18200-08)</td><td>Sistema de Retração de Pequenos</td></tr><tr><td>Animais Monojeto Agulha Hipodérmica Padrão</td><td>COVIDIEN</td><td>05-561-20</td><td>Para administração de medicamentos Pinça de</td></tr><tr><td>padrão estreito</td> IP <td>FST</td><td>11002-12</td><td>Pinça de nível de pele</td></tr><tr><td>Porta-agulhas / Chave de agulha</td><td>FST</td><td>12565-14</td><td>para segurar agulhas</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>BD</td><td>305110</td><td>agulha de calibre 26 para externalizar o nó corrediço (agulha de calibre 24 ou 26 também está bem)</td></tr> <tr><td>PA / pinça de dilatação de vasos</td><td>FST</td><td>00125-11</td><td>Para segurar PA; pinça não prejudicial</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Usado para incisão e corte na camada muscular durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Micro pinça Dumont ultrafina</td><td>FST</td><td>11295-10 (pinça Dumont # 5, ponta de biologia, dimensão da ponta: 0,05 * 0,02 mm, 11 cm)</td><td>Para passar pelo espaço entre a artéria pulmonar esquerda e o brônquio</td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% Bupivacaína</td><td>Hospira, Inc.</td><td>0409-1159-02</td><td>Analgésico tópico usado durante o fechamento da ferida cirúrgica</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromoetanol)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td>Anestésico, usando para anestesiar o camundongo para cirurgia de IR, a concentração usada na cirurgia de IR é de 250-400 mg / kg.</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Covetrus América do Norte</td><td>59122</td><td>Analgésico: a concentração usada para cirurgia é de 0,05-0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Lubrificante para os Olhos</td><td>BAUSCH+LOMB</td><td>Pomada Lubrificante para os Olhos</td><td>Alivia a secura do olho</td></tr><tr><td>Solução de Iodo-Povidona 10%</td><td>MEDLINE INDUSTRIES INC</td><td>SKU MDS093944H (2 FL OZ, antisséptico tópico)</td><td>Líquido tópico aplicado para um antisséptico de primeiros socorros eficaz no início da cirurgia</td></tr><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonete com Álcool</td><td>Marca BD</td><td>&nbsp; BD 326895</td><td>para esterilização da área de injeção e cirurgia</td></tr><tr><td>Filme plástico</td><td>KIRKLAND</td><td>Stretch-Tite premium Alternativa</td><td>para cobrir o campo cirúrgico esterilizado (mais econômico)</td></tr><tr><td>Campos cirúrgicos para roedores</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td>Campo estéril ou campo cirúrgico</td></tr><tr><td>Aplicação com ponta de algodão estéril</td><td>Pwi-Wnaps</td><td>703033</td><td>usado para aplicar lubrificante ocular</td></tr><tr><td>Top Sponges</td><td>Dukal Corporaton</td><td>Reorder # 5360</td><td>Parando o sangramento da pele / músculo</td></tr></tbody></table>

um modelo de rato de intubação orotraqueal e cirurgia de reperfusão de isquemia pulmonar ventilada

A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery

A lesão por isquemia reperfusão (RI) frequentemente resulta de processos que envolvem um período transitório de fluxo sanguíneo interrompido. No pulmão, a RI isolada permite o estudo experimental desse processo específico com ventilação alveolar continuada, evitando, assim, os processos agravantes prejudiciais de hipóxia e atelectasia. No contexto clínico, a lesão de reperfusão por isquemia pulmonar (também conhecida como IRI pulmonar ou LIRI) é causada por inúmeros processos, incluindo, entre outros, embolia pulmonar, trauma hemorrágico ressuscitado e transplante pulmonar. Atualmente, existem opções de tratamento eficazes limitadas para o LIRI. Aqui, apresentamos um modelo cirúrgico reversível de RI pulmonar envolvendo a primeira intubação orotraqueal seguida de isquemia pulmonar esquerda unilateral e reperfusão com ventilação alveolar preservada ou troca gasosa. Os camundongos são submetidos a uma toracotomia esquerda, através da qual a artéria pulmonar esquerda é exposta, visualizada, isolada e comprimida usando um nó escorregadio reversível. A incisão cirúrgica é então fechada durante o período isquêmico, e o animal é despertado e extubado . Com o rato respirando espontaneamente, a reperfusão é estabelecida liberando o nó deslizante ao redor da artéria pulmonar. Este modelo de sobrevida clinicamente relevante permite a avaliação da lesão da RI pulmonar, da fase de resolução, dos efeitos a jusante sobre a função pulmonar, bem como de modelos de dois acertos envolvendo pneumonia experimental. Embora tecnicamente desafiador, esse modelo pode ser dominado ao longo de algumas semanas a meses com uma eventual taxa de sobrevivência ou sucesso de 80% a 90%.

Inflamação gerada pela lesão unilateral de reperfusão de isquemia pulmonar estéril ventilada (RI): Após 1 h de isquemia, observamos níveis aumentados de citocinas no soro e no tecido pulmonar por ELISA e qRT-PCR que atingiram o pico em 1 h após a reperfusão e rapidamente retornaram à linha de base dentro de 12-24 h após a reperfusão13. Para as amostras coletadas às 3 h após a reperfusão, observamos intensa infiltração de neutrófilos no interior do tecido pulmonar esquerdo e observamos que a intens...

Um modelo cirúrgico de camundongo para criar lesão de reperfusão (RI) de isquemia pulmonar esquerda, mantendo a ventilação e evitando a hipóxia.

Um Modelo de Rato de Intubação Orotraqueal e Cirurgia de Reperfusão de Isquemia Pulmonar Ventilada

Ischemia reperfusion (IR) injury frequently results from processes that involve a transient period of interrupted blood flow. In the lung, isolated IR ...

A cirurgia ventilada de isquemia-reperfusão pulmonar pode ser usada para estudar a fisiopatologia pulmonar específica de múltiplos processos, incluindo transplante pulmonar, embolia pulmonar e lesão pulmonar após trauma hemorrágico com ressuscitação. Esse modelo minimiza as contribuições inflamatórias da atelectasia, ventilação mecânica e hipóxia. Mantém um sistema imunitário circulatório in vivo intacto e permite estudos a longo prazo.Este modelo poderia fornecer informações sobre como a inflamação estéril é controlada e regulada dentro do pulmão. A técnica microcirúrgica requer primeiro horas de prática. A organização e o planejamento cuidadosos são importantes antes de começar.Além disso, pode ser inicialmente praticado pelo rato eutanasiado sem a distração da atividade cardíaca e do movimento que ela causa. A estase sanguínea no PA esquerdo permite que ele seja mais facilmente visualizado e manipulado. Para começar, coloque suavemente a luz flexível de fibra óptica na traqueia de um rato anestesiado, ligeiramente abaixo das cordas vocais.Ajuste os níveis de iluminação de modo que apenas um campo escuro seja visível ao olhar para a faringe oral do rato, exceto para a luz vermelha que emana de baixo das cordas vocais. Para a intubação, segure a pinça com a mão dominante e use-as para segurar suavemente e tirar a língua da cavidade oral. Abra a mandíbula inferior usando pinça segurada pela mão não dominante e empurre a pinça para a laringe para levantar a epiglote.Neste ponto, solte a língua das pinças. Observe as cordas vocais. Eles devem abrir e fechar de acordo com cada respiração.Segurando a cânula com o fio-guia pré-carregado, insira a ponta do fio através das cordas vocais. Em seguida, tomando muito cuidado para não mover o fio, segurando uma parte dele que está fora da cânula, mas logo acima das cordas vocais, retire a cânula, deixando apenas o fio no lugar com sua extremidade distal dentro da traqueia. Neste ponto, realize uma segunda visualização das cordas vocais para confirmar que a ponta distal do fio permanece passada através das cordas vocais iluminadas e na traqueia, e não está no esôfago não iluminado.Em seguida, segure o fio fora da boca com a pinça curva na mão esquerda estabilizada contra uma superfície dura e avance cuidadosamente o cateter de calibre 20 com asas de fita sobre o fio. Uma vez que a extremidade distal do fio emerge da extremidade traseira do cateter ou tubo endotraqueal, segure essa extremidade com a pinça curva e avance suavemente o cateter para a traqueia. Em seguida, remova cuidadosamente o fio da extremidade distal do cateter com a pinça curva sem desalojar a colocação do cateter.Em seguida, conecte brevemente o cateter ao ventilador antes de prendê-lo para confirmar a colocação adequada na traqueia e não no esôfago. Confirmar a colocação traqueal pela observação de movimentos bilaterais da parede torácica dependentes da ventilação mecânica e da ausência de insuflação do estômago. Após a intubação, conecte o cateter ao ventilador ajustado no volume título de 0,2 a 0,225 mililitro e frequência respiratória de 120 a 150 respirações por minuto para confirmar o posicionamento traqueal correto do tubo orotraqueal.Em seguida, desconecte-se com o rato respirando espontaneamente através do tubo orotraqueal. Raspe o pelo do rato sobre a área do tórax esquerdo até a escápula esquerda. Remova o excesso de cabelo raspado usando cotonetes com álcool e desinfete a área cirúrgica.Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma posição lateral esquerda ou três quartos virados. Conecte o tubo traqueal ao ventilador. Depois de fazer a incisão da pele, insira três afastadores esterilizados sob a camada muscular.Em seguida, identifique o segundo espaço intercostal e segure a segunda costela com a pinça extra fina. Em seguida, puxando a costela para cima, use uma lâmina de bisturi curva de número 12 estéril para entrar no espaço plural, separando e cortando os músculos intercostais do segundo ao terceiro espaços. Considere pausar a ventilação para reduzir a lesão no ápice do pulmão esquerdo.Use o retrator menor e mais estreito cefálade ao longo da orientação das costelas, e o afastador de tamanho médio à esquerda ao longo da terceira costela e o maior afastador à direita ao longo da superfície da segunda costela. Abra o tórax com retração lenta e progressiva usando os cabos elásticos do afastador. Exponha e identifique a artéria pulmonar esquerda, ou PA, movendo o ápice do pulmão esquerdo para longe com um cotonete estéril ou uma esponja cirúrgica.Use o fórceps micro fórceps ultrafino na mão direita e PA ou pinça dilatadora do vaso na mão esquerda para expor suavemente e criar o campo no qual o PA esquerdo e o brônquio são visíveis. Usando a pinça PA, pegue a PA esquerda e puxe suavemente, mas firmemente para cima e cefálico para visualizar o brônquio transparente abaixo. Aumente a ampliação no microscópio de dissecção para quatro X.Enquanto retrai o PA para longe do brônquio, passe cuidadosamente a pinça ultrafina fechada através do espaço entre o PA esquerdo e o brônquio.Em seguida, use essas pinças para segurar e puxar um 7-0 ou 8-0 sutura de proleno através do espaço entre a artéria pulmonar esquerda acima e o brônquio abaixo. Em seguida, cerque o PA esquerdo amarrando um nó deslizante para criar uma oclusão no PA. A interrupção do fluxo sanguíneo é facilmente visualizada neste ponto, marcando o início do período isquêmico. Exteriorizar a extremidade livre do nó através de um ponto de entrada diferente no tórax anterior esquerdo usando uma agulha de calibre 24 a 28 e fixar a extremidade da sutura com um pequeno pedaço de fita adesiva para facilitar a identificação posterior.Em seguida, usando uma válvula de pressão positiva e expiratória ou tubulação no ventilador do roedor, reinflar o pulmão para expelir o máximo de ar possível para fora da cavidade torácica. Em seguida, feche a caixa torácica com duas suturas de nylon 4-0 interrompidas, seguidas de fechamento da camada muscular e cutânea e aplicação de anestesia local. Desconecte o mouse do ventilador e coloque-o cuidadosamente na almofada de aquecimento para cuidados pós-operatórios para manter a temperatura corporal durante a recuperação.Certifique-se de que o nó de deslizamento externalizado seja controlado e visualizado claramente durante o movimento do mouse. Puxe o nó de deslizamento exteriorizado suavemente no final do período isquêmico. A histologia de cortes pulmonares em camundongos do tipo selvagem das cepas C3H e C57 black six é mostrada aqui.Após uma hora de isquemia e três horas de reperfusão, intensa infiltração neutrofílica dentro do tecido pulmonar esquerdo foi observada em ambas as cepas. No entanto, a cepa C3H mostrou níveis marcadamente maiores de inflamação em comparação com o C57 black six. Erros durante a passagem do monofilamento entre o PA esquerdo e o brônquio esquerdo podem levar a cirurgia não recuperada com sangramento catastrófico do PA esquerdo ou lesão irreversível do brônquio esquerdo.Este é o passo que é mais tecnicamente desafiador e requer a prática repetida ao aprender este procedimento pela primeira vez. Após a recuperação do camundongo da cirurgia de isquemia-reperfusão pulmonar cerca de uma hora ou menos após a reperfusão, uma instilação intratraqueal de bactérias vivas pode ser administrada em três horas ou 24 a 48 horas depois para simular uma infecção que segue lesão pulmonar estéril causada por isquemia-reperfusão. A instalação intratraqueal de outros agentes que podem modular a inflamação estéril também pode ser feita após isquemia-reperfusão de maneira semelhante.Esta técnica ajudou a descobrir e confirmar o tráfico e a ativação gradual de neutrófilos em resposta a lesões estéreis e infecções no pulmão.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um modelo murino para o ventilador lesão pulmonar induzida é uma ferramenta importante para estudar uma lesão pulmonar...

Ventilação a pressão controlada para induzir lesão pulmonar aguda em ratos

Um modelo poderoso para perioperatório e crítica lesão renal aguda relacionada com o cuidado é apresentado. Usando hipoperfusão corpo inteiro induzida por parada cardíaca é possível a quase replicar as alterações histológicas e funcionais do AKI clínico.

Cardiac Arrest normotérmica e Ressuscitação Cardiopulmonar: um modelo do rato de isquemia-reperfusão

O trauma cirúrgico induz uma resposta inflamatória. As citocinas e ligandos endógenos são conhecidos para modular o tamanho do enfarte do miocárdio após isquemia e reperfusão. Apresentamos um modelo modificado fechado de tórax murino de isquemia e reperfusão utilizando pesos pendurados para minimizar os efeitos de toracotomia.

Um modelo fechado de tórax murino de isquemia do miocárdio e reperfusão

Nós introduzimos um método cirúrgico para induzir experimental de isquemia / reperfusão (I / R) prejuízo para simular o infarto do miocárdio (MI) em modelos de mouse que permite uma maior clareza no posicionamento da ligadura na artéria descendente anterior esquerda (LAD) para aumentar a reprodutibilidade de experimentos MI em camundongos.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

A pneumonectomia de camundongos é um modelo comumente empregado de crescimento pulmonar compensatório. Este procedimento pode ser usado em conjunto com o rastreamento de linhagem ou modelos de camundongos transgênicos para elucidar os mecanismos subjacentes.

Rato Pneumonectomia modelo de crescimento compensatório pulmonar

Aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de isquemia e reperfusão em ratos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o campo. Este modelo de lesão por isquemia-reperfusão intestinal pode ser utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Descrevemos um método simples e reprodutível que pode induzir infarto do miocárdio ou lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em camundongos por ligadura precisa da artéria coronária descendente anterior esquerda através de micromanipulação.

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Este protocolo demonstra um modelo único de parada cardíaca por asfixia em camundongos que não requer compressão torácica para ressuscitação. Esse modelo é útil para monitorar e obter imagens da dinâmica da fisiologia cerebral durante a parada cardíaca e a ressuscitação.

Modelo de Parada Cardíaca em Camundongos para Monitoramento por Imagem e Fisiologia Cerebral durante Isquemia e Ressuscitação

O modelo de transplante traqueal intrapulmonar murino (TTPI) é valioso para o estudo da doença obliterativa das vias aéreas (DAO) após o transplante pulmonar. Oferece informações sobre o comportamento imunológico e angiogênico pulmão-específico na obliteração das vias aéreas após alotransplante com alta reprodutibilidade. Descrevemos aqui o procedimento do IPTT e seus resultados esperados.

Transplante de Traqueia Intrapulmonar Purino: Modelo para Investigação de Doença Obliterativa das Vias Aéreas Após Transplante Pulmonar

O protocolo descreve um método viável, confiável e reprodutível de pinçamento hilar pulmonar esquerdo que pode ser usado para estudar a lesão de isquemia-reperfusão pulmonar em modelos de camundongos.

Modelo de grampo hilar pulmonar esquerdo murino de lesão de isquemia pulmonar e reperfusão

Aprenda a técnica de intubação orotraqueal e cirurgia de reperfusão de isquemia pulmonar ventilada em ratos. Este modelo minimiza a inflamação por atelectasia e hipóxia, mantendo o sistema imune circulatório intacto para estudos de patofisiologia pulmonar.

Um Modelo de Rato de Intubação Orotraqueal e Cirurgia de Reperfusão de Isquemia Pulmonar Ventilada

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