Avaliação ex vivo da função biventricular murina em modelo de Langendorff

Com o protocolo descrito, podemos comparar o coração doador, o ventrículo esquerdo e a função ventricular após a preservação, e podemos examinar a diferença da biologia da preservação em ambos os ventrículos durante esse processo de preservação. Esta técnica utiliza sistema de perfusão ex vivo para examinar as funções cardíacas após preservação. Ele fornece ferramentas robustas e confiáveis para rastrear novos tratamentos para melhorar as funções cardíacas do doador após a preservação.

Comece com a preparação da massa conforme descrito no texto e modele um pequeno pedaço da massa em uma forma oval para obter a cabeça. Fixe-o na extremidade de um fio de espaguete seco. Mergulhe a cabeça na solução de açúcar já preparada e remova-a lentamente quando estiver bem revestida com uma fina película da solução.

Em seguida, suspenda o fio de espaguete em um bloco de espuma de poliestireno ou outros suportes para permitir a formação de uma cobertura uniforme e brilhante sobre a cabeça e seque-o durante a noite. No dia seguinte, mergulhe o molde em elastômero de silicone disperso em xileno e coloque o fio de espaguete de volta no bloco de espuma de poliestireno a 37 graus Celsius por duas horas ou até secar. Repita esta etapa mais uma vez.

Em seguida, coloque o molde na água para separar e recolher o balão. Conservar o balão em azida sódica a 0,02%. Agora, corte uma ponta romba de uma agulha de calibre 22 e monte uma extremidade romba no balão de silicone enquanto a outra extremidade romba em um tubo de PE.

Use uma sutura de seda 4-0 para amarrar o balão no lugar na agulha. Pegue o camundongo C57Black/6 e injete intraperitonealmente 200 unidades de heparina no abdômen do animal para anticoagulação. Depois de confirmar a anestesia adequada com uma pinça no dedo do pé, faça uma incisão logo abaixo do esterno.

E usando tesoura, abra o peito cortando o diafragma nas costelas. Em seguida, dobrar a parede torácica anterior para expor completamente o tórax antes de fazer um corte na aorta descendente próximo ao arco da aorta. Agora, transfira o coração, os pulmões e o timo do camundongo para histidina-triptofano-cetoglutarato gelado, ou tampão HTK, para isolar os órgãos.

Expor a aorta removendo qualquer tecido conjuntivo. Conecte a extremidade da aorta a uma agulha de calibre 22 e amarre-a com uma sutura de seda 6-0. Certifique-se de que a cânula esteja acima da raiz da aorta, para não interferir com a valva aórtica.

Perfundir a aorta por aproximadamente 10 minutos com 10 mililitros de tampão HTK, pré-resfriado a quatro graus Celsius. Dependendo do tipo de experimento, armazene o coração em um tubo de 50 mililitros com HTK gelado por oito horas ou realize imediatamente a profusão. Para realizar a profusão, conecte o coração montado na agulha à cânula no aparelho de Langendorff e amarre-o com uma sutura de seda.

Iniciar a profusão em modo de fluxo constante a três mililitros por minuto e, depois de mudar para um modo de pressão constante a 70 a 80 milímetros de mercúrio, ajustar a taxa de perfusão para aproximadamente seis mililitros por minuto. Em seguida, conecte um balão de silicone desinsuflado cheio de água a um transdutor de pressão e uma seringa cheia de água usando uma torneira de três vias. Após 15 a 20 minutos de um período de equilíbrio após a perfusão anterior, cortar o átrio direito, ou AD, e inserir o balão no ventrículo direito, ou VD, através do AD. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do VD e minimize a área aberta do AD para ajudar a restringir o balão no ventrículo.

Após 20 minutos da coleta de dados funcionais do VD, corte o átrio esquerdo, ou AE, e insira um balão desinsuflado cheio de água no ventrículo esquerdo, ou VE, através do AE. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do LV.To calibre o transdutor de pressão, primeiro encha uma seringa de 10 mililitros com soro fisiológico morno e conecte a seringa à cúpula através de uma torneira de três vias. Abra a torneira e encha lentamente a cúpula com soro fisiológico antes de fechar todas as torneiras e remover a seringa. Em seguida, conecte a cúpula preenchida ao transdutor conectando o manômetro à terceira extremidade do tap de três vias.

No software de gravação, no menu suspenso do canal que se conecta ao transdutor, selecione a opção de Bridge Amp. Clique em 0 antes de iniciar a gravação para definir a leitura do transdutor para zero milímetros de mercúrio. Após vários segundos de gravação, empurre lentamente a seringa e aumente a pressão para 100.

Clique em Parar para encerrar a gravação. Na caixa de diálogo Conversão de unidades, selecione a área de gravação de zero milímetros de mercúrio e clique na seta para 1 antes de digitar zero milímetros de mercúrio. Da mesma forma, selecione a área de gravação para 100 milímetros de mercúrio.

Clique na seta para 2 e digite 100 milímetros de mercúrio. Agora, clique em OK para calibrar o transdutor. Após a calibração, renomeie o canal correspondente ao transdutor de pressão com o balão como Pressão Ventrículo, ou Pressão do VE, e comece a registrar quando o coração estiver conectado ao sistema.

Depois de inserir o balão no ventrículo, ajuste o volume de água no balão usando uma seringa micrométrica através da torneira de três vias para manter a pressão diastólica final em cinco a 10 milímetros de mercúrio. Em seguida, renomeie um canal vazio como dP/dt e mantenha o canal fonte derivado como pressão ventricular. Esse canal registra a razão da mudança de pressão na cavidade ventricular durante a contração.

Selecione o período estável de medida antes de ir para a configuração no módulo de pressão arterial. Em seguida, selecione a pressão LV como o canal de entrada e clique em seleção antes de pressionar OK. Agora, clique em Exibição do Classificador para remover qualquer ciclo cardíaco discrepante e em Exibição de Tabela para gerar as tabelas para a média de dP/dt máximo e dP/dt mínimo para o período selecionado. Quando o coração de camundongo foi armazenado em tampão HTK por zero horas antes da perfusão, a pressão sistólica mais alta foi registrada para o VE em comparação com o VD. Além disso, comparado ao VD, o VE também apresentou significativamente mais contração muscular, bem como relaxamento.

No entanto, quando a perfusão foi realizada no coração após submetê-lo a oito horas de armazenamento refrigerado, tanto o VE quanto o VD apresentaram redução funcional significativa em relação ao estágio de zero hora. Observou-se que as reduções foram mais acentuadas no VE em relação ao VD. A contração e o relaxamento do VE após oito horas de armazenamento foram de 25,1% e 30,7% da função correspondente ao armazenamento de zero-hora, enquanto o VD apresentou 32,5% e 29,1% de função, em comparação com o basal de zero-hora. A indicação de disfunção primária do enxerto de VE após armazenamento prolongado foi mais significativa do que a de VD. A qualidade da preservação depende em grande parte da perfusão da HTK.

É importante certificar-se de que a perfusão é consistente para comparar com precisão os diferentes tratamentos. Com a medição precisa da preservação da função cardíaca de um doador, esse método pode ser facilmente adaptado para rastrear drogas que podem melhorar a função cardíaca do doador e, em seguida, validar ainda mais usando um modelo de transplante heterotópico.