Name: Avaliação ex vivo da função biventricular murina em modelo de Langendorff (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprenda a avaliar a função biventricular ex vivo em corações de camundongos após preservação a frio usando o sistema de perfusão de Langendorff. Este método permite quantificar parâmetros cardíacos e comparar o desempenho dos ventrículos esquerdo e direito.

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Todos os experimentos com animais neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan, Ann Arbor. Todos os camundongos foram alojados em um ciclo de luz de 12:12 em salas livres de patógenos. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, animais e equipamentos usados neste protocolo.
1. Construção do cateter-balão de silicone
OBS: O balão de silicone é confeccionado conforme descrito anteriormente13.
<ol><li>Adicionar 9,5 mL de água destilada, 14,2 mL de xarope de milho light e 33,8 g de sacarose a um copo de 100 mL. Aqueça e mexa a solução até que o açúcar esteja completamente dissolvido.</li>
	<li>Prepare a massa misturando 10 g de farinha de trigo e 5 g de água até obter uma consistência uniforme e deixe descansar por 10 min.</li>
	<li>Molde um pequeno pedaço de massa em um oval - a "cabeça" - e prenda-o à extremidade de um fio de espaguete seco. Em seguida, mergulhe esta cabeça na solução de açúcar e remova lentamente da solução, pois a cabeça agora está completamente revestida. OBS: A massa deve ser lisa e de textura uniforme. Os tamanhos de massa podem ser variados para gerar diferentes tamanhos de balões, de 5 mm (diâmetro curto) a 7 mm (diâmetro longo). Tente cobri-los com uma fina película de solução de açúcar.</li>
	<li>Suspenda o fio de espaguete em um bloco de espuma de poliestireno, ou outros suportes, para formar uma cobertura brilhante uniformemente sobre a cabeça e secar durante a noite.</li>
	<li>Mergulhe o molde na dispersão de silicone (elastômero de silicone disperso em xileno). Coloque o fio de espaguete de volta no bloco de espuma de poliestireno a 37 °C por 2 h ou até secar. Repita esta etapa uma vez. OBS: É fundamental evitar que o gel de dispersão de silicone oxide devido à exposição ao ar, pois isso irá gerar uma espessura irregular do balão.</li>
	<li>Coloque o molde na água para separar e recolher o balão. Conservar o balão em azida sódica a 0,02%.</li>
	<li>Corte uma ponta de duas pontas rombas de uma agulha de 22 G; montar uma extremidade romba no balão de silicone e outra extremidade romba na tubulação de polietileno. Use seda 4-0 para amarrar o balão no lugar na agulha. NOTA: Teste a integridade do balão injetando água nele. Uma vez que o balão está cheio, pressione o balão suavemente para testar se o balão mantém a tensão em seu interior. Use um balão novo se ele estiver vazando. Os balões montados podem ser armazenados para uso futuro.</li>
</ol>2. Preparo do sistema de perfusão cardíaca
<ol><li>Fazer 1 L de tampão de perfusão Krebs-Henseleit (KH) e transferi-lo para o reservatório de água do sistema Langendorff.</li>
	<li>Conecte o tubo de ar ao reservatório de água e ligue o fluxo de ar para equilibrar o tampão KH com 5% CO 2 e 95% O2 por pelo menos 30 min.</li>
	<li>Coloque o banho-maria a 41,5 °C e circule a água na camada externa do sistema Langendorff para aquecer o sistema e o tampão KH. NOTA: A temperatura do banho-maria requer otimização para cada sistema. Para este sistema, a temperatura do banho-maria manterá o KH em 37-37,5 °C ao perfundir no coração.</li>
</ol>3. Isolamento, montagem e canulação do coração do rato
<ol><li>Para anticoagulação, administrar 200 unidades de heparina em solução salina por injeção intraperitoneal (i.p.) no quadrante direito do abdome de camundongos C57/B6. Aspirar a seringa antes da injeção para confirmar se o bisel das agulhas não está na bexiga ou no lúmen do trato gastrointestinal. Use pelo menos quatro camundongos em cada condição experimental (mas também considere o tamanho do efeito do tratamento).<ol><li>Após 30 minutos, administrar 80 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina i.p. para anestesiar o camundongo. Verifique se o rato anestesiado está inconsciente, realizando uma pinça do dedo do pé e garantindo que nenhuma resposta seja observada. A acepromazina 2mg/kg pode ser adicionada ao cocktail ket/xyl se a estirpe utilizada de ratinhos não atingir um nível adequado de anestesia apenas com ket/xyl.</li>
		<li>Faça uma incisão logo abaixo do esterno. Use uma tesoura para abrir o peito, cortando o diafragma e as costelas. Dobre a parede torácica anterior para expor totalmente o tórax. Corte na aorta descendente (fechada ao arco da aorta). Transfira o coração, os pulmões e o timo do camundongo para o tampão frio histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK). Isole os órgãos sob tampão HTK gelado. Expor a aorta, removendo quaisquer tecidos conjuntivos. NOTA: Maximizar o comprimento da aorta incluindo a aorta ascendente e a região do arco aórtico na excisão para permitir espaço suficiente para se conectar a uma agulha.</li>
	</ol></li>
	<li>Conecte a extremidade da aorta a uma agulha de 22 G e amarre com uma sutura de seda 6-0. Certifique-se de que a cânula esteja acima da raiz da aorta para não interferir com a válvula aórtica. Perfundir a aorta com 10 mL de tampão HTK frio (4 °C) por aproximadamente 10 min. NOTA: Leva menos de 15 minutos desde a remoção do coração até a canulação da aorta; Entretanto, é importante manter a velocidade de perfusão no nível adequado. Injeções muito rápidas e vigorosas podem gerar altas pressões e causar danos vasculares/cardíacos.</li>
	<li>Armazenar o coração em um tubo de 50 mL com HTK gelado por 8 h ou realizar imediatamente a perfusão (não armazenar o controle) e evitar o contato direto com gelo. NOTA: O contato direto do tecido cardíaco com gelo pode levar à lesão pelo frio.</li>
	<li>Conecte o coração montado na agulha à cânula no aparelho de Langendorff e amarre-o com uma sutura de seda. OBS: Para padronizar o procedimento, aguardar um total de 3 min para o processo de canulação antes da perfusão.</li>
	<li>Iniciar a perfusão com fluxo constante a 3 mL/min; em seguida, mude para o modo de pressão constante em 70-80 mmHg e ajuste o coração para ~6 mL/min. NOTA: Palpar o coração suavemente pode ajudar a acelerar a reanimação cardíaca. Se o fluxo de perfusão for muito maior que 6 mL/min no modo de pressão constante, pode haver um vazamento na canulação ou a válvula aorta pode não estar funcionando adequadamente. Ajuste as conexões para corrigir o vazamento. O modo de fluxo constante substitui a auto-regulação do tônus vascular do coração. O modo de pressão constante permite que o coração regule seu fluxo de perfusão coronariana. Portanto, o modo de pressão constante medirá precisamente a função cardíaca e a qualidade de preservação do coração.</li>
	<li>Conecte um balão desinsuflado e cheio de água a um transdutor de pressão e a uma seringa cheia de água com uma torneira de três vias. Após um período de equilíbrio de 15-20 min, cortar o átrio direito (AD) e inserir o balão no VD através do AD. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do VD. Minimize a área aberta do AR para ajudar a restringir o balão no ventrículo (consulte a Figura 1 para a configuração). NOTA: Um período de equilíbrio é necessário, pois a contração e o relaxamento cardíacos não são estáveis no início, e a medida é menos precisa e representativa. Se o nó AV for danificado durante a abertura do AR, o coração exibirá arritmias frequentes.</li>
	<li>Após 20 min da coleta dos dados funcionais do VD, cortar o átrio esquerdo (AE) e inserir um balão desinsuflado cheio de água no VE através do AE. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do LV. OBS: O coração deve manter hemodinâmica estável por mais de 1,5 h.</li>
</ol>4. Registro de dados funcionais
<ol><li>Calibração do transdutor de pressão<ol><li>Encha uma seringa de 10 mL com soro fisiológico morno e conecte a seringa à cúpula através de uma torneira de três vias. Abra a torneira e encha lentamente a cúpula com soro fisiológico e, em seguida, feche todas as torneiras e remova a seringa. Fixar a cúpula preenchida ao transdutor; Conecte o manômetro à terceira extremidade do torneiro de três vias.</li>
		<li>No software de gravação, selecione o Bridge Amp no menu suspenso do canal que se conecta ao transdutor. Renomeie o canal como Pressão perfundida. Clique em Zero para zerar o transdutor.</li>
		<li>Inicie a gravação clicando em Iniciar para que o transdutor esteja agora lendo 0 mmHg. Após vários segundos de gravação, empurre lentamente a seringa e aumente a pressão para 100. Clique em parar para interromper a gravação.</li>
		<li>Na caixa de diálogo Conversão de unidades, selecione uma área de gravação para 0 mmHg e clique na seta para Ponto 1 e digite 0 mmHg. Selecione a área de gravação para 100 mmHg, clique na seta para o Ponto 2 e digite 100 mmHg. Clique em OK para calibrar o transdutor.</li>
	</ol></li>
	<li>Renomeie o canal correspondente ao transdutor de pressão com o balão como pressão ventricular. Inicie a gravação quando o coração estiver conectado ao sistema. Após a inserção do balão no ventrículo, ajuste o volume de água no balão usando uma seringa micrométrica através da torneira de três vias para manter a pressão diastólica final em 5-10 mmHg. OBS: A medida diastólica final pode diminuir durante a medida, preferencialmente iniciando em torno de 10 mmHg.</li>
	<li>Renomeie um canal vazio como dP/dt. No menu suspenso, selecione Derivada | canal de origem como Pressão do ventrículo. O canal registrará a relação de mudança de pressão na cavidade ventricular durante o período de contração.</li>
	<li>Selecione um período estável de medida e clique em Configuração no módulo Pressão arterial.<ol><li>Selecione a pressão ventricular como canal de entrada e clique na seleção para um período de cálculo | Está bem.</li>
		<li>Clique em Modo de exibição do classificador para remover o ciclo cardíaco atípico (por exemplo, tempo ou pressão de ciclo anormal).</li>
		<li>Clique em modo de exibição de tabela para gerar as tabelas da média de max dP/dt (contração) e min dP/dt (relaxamento) para o período selecionado. NOTA: Armazene o arquivo de gravação para cada amostra e salve a tabela de função cardíaca média para análise estatística.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li>
<li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+%26%2334%3Bhigh-risk%26%2334%3B+donor+hearts%3A+Implications+for+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of &#34;high-risk&#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li>
<li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matching+the+market+for+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679(2016).</li>
<li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li>
<li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li>
<li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation%3A+a+thorn+amongst+the+roses%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury%3A+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li>
<li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997(2021).</li>
<li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated%2C+Langendorff-perfused+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li>
<li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li>
<li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004(2021).</li>
<li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology+%26+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology & Biomaterials. 1 (101), (2011).</li>
<li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li>
<li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+function+and+failure%3A+report+of+a+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este protocolo descreve o método de Langendorff de perfusão retrógrada via canulação aórtica. Essa técnica pode ser utilizada para avaliar a função do VE e VD de corações murinos após armazenamento refrigerado. Os resultados mostram que o armazenamento refrigerado prolongado dos corações doados leva à redução da função cardíaca tanto no VE quanto no VD por meio desse protocolo. 
Os estudos de rejeição aguda e crônica após transplante cardíaco enfocam amplamente aimunobiologia14. Os efeitos das células nativas sobre o PGD durante o armazenamento refrigerado são menos bem examinados. A DPE ocorre em ~10%-20% dos transplantes cardíacos e é responsável por 66% da morte precoce dentro de 30 dias após o transplante. Em particular, a incidência de DPE afetando o VE versus o VD difere após o transplante11. Sem a contribuição das respostas celulares receptoras, este método ex vivo concentra-se nas contribuições das células cardíacas nativas para a DPE após a preservação fria dos corações doados. Estudos futuros podem incorporar respostas do receptor em um modelo de transplante cardíaco murino. 
Nesse protocolo, a perfusão de Langendorff de corações doadores preservados a frio enfocou as respostas cardíacas nativas à perfusão de cristaloides quentes, sem infiltração da imunidade celular. Para alcançar resultados reprodutíveis, várias etapas críticas foram padronizadas. Os corações de camundongos foram parados com solução HTK e armazenados em HTK gelado, semelhante à prática clínica. O volume de perfusão e o tempo de infusão da solução HTK para cada coração foram monitorados de perto com um temporizador. O coração doador foi mantido em tubos pré-resfriados sobre gelo contendo HTK em uma sala de 4 °C. O tempo de canulação foi padronizado para ~3 min antes da perfusão. Todos esses passos garantiram que o tempo de preservação do frio fosse a principal variável do estudo. 
Um período de contratilidade cardíaca irregular por ~20 min foi comumente observado no início da perfusão. Esse período de equilíbrio e recuperação foi facilitado pelo aquecimento gradual e oxigenação dos tecidos cardíacos. Um período relativamente estável era esperado após os 20 min iniciais. O balão foi inserido na cavidade ventricular ~18 min após o período de equilíbrio inicial. Iniciamos o registro hemodinâmico após o coração estar estável por ~25 min, uma vez que o balão foi inserido. A perfusão com tampão KH manteve o desempenho cardíaco estável por ~1,5-2 h. Optou-se, portanto, por registrar hemodinâmica por 20 min em cada um dos ventrículos esquerdo e direito.
Existem várias limitações da perfusão retrógrada para o estudo da DPE dos corações após armazenamento refrigerado. Primeiro, devido ao tamanho do balão e à falta de espaço em cada cavidade ventricular (em particular, o VD), a inserção simultânea de dois balões no VE e VD é muito desafiadora. Assim, medimos a função do VD e do VE sequencialmente. É importante ressaltar que o septo interventricular contribui significativamente para a função ventricular esquerda e direita. O septo contribui com ~50% da função ventricular direita, havendo dependência interventricular15. Também é importante notar que, enquanto os procedimentos para reperfusão do coração murino no dispositivo de Langendorff levam ~3 min, o implante cirúrgico do coração humano no campo cirúrgico relativamente quente leva ~45 min. Em comparação, o coração murino neste sistema de Langendorff incorre em menor tempo isquêmico. Isso deve ser levado em conta ao considerar a tradução clínica.
Como usamos tampão KH para perfundir o coração sem sangue, isso também pode ter menos eficiência na entrega de oxigênio. Entretanto, a função cardíaca é relativamente estável através das 1,5-2 h iniciais de perfusão, permitindo medidas hemodinâmicas confiáveis. Infelizmente, atualmente não existem modelos viáveis de perfusão cardíaca para esses corações murinos menores, e o efeito da carga ventricular não pode ser avaliado nesse sistema. Apesar disso, o sistema de perfusão é altamente reprodutível, menos trabalhoso e demorado do que os modelos de transplante. Também é menos dispendioso do que os estudos de transplante, o que pode torná-lo mais adequado para o rastreamento de diferentes opções terapêuticas e várias vias moleculares. Com modificações nas soluções de preservação pela adição de fármacos candidatos, essa plataforma pode ser utilizada para avaliar os efeitos de agentes farmacológicos na redução da DPE tanto no VE quanto no VD.

O transplante cardíaco melhora a sobrevida e a qualidade de vida em pacientes com insuficiência cardíaca terminal1. Infelizmente, a escassez de doadores cardíacos limita o número de pacientes que poderiam se beneficiar dessa terapia e limita a capacidade dos clínicos de combinar de forma ideal doadores com receptores 2,3,4. Além disso, o novo sistema de alocação contribuiu para tempos isquêmicos mais longos e aumentou significativamente o uso de doadores marginais desde 20185. Consequentemente, a idade média dos doadores cardíacos e o tempo de isquemia estão aumentando ao longo do tempo, levando a uma maior taxa de disfunção primária do enxerto (DPE), apesar de melhorias significativas nas estratégias de preservação do coração6.
A DPE pode afetar os ventrículos esquerdo, direito ou ambos e continua sendo uma complicação com risco de vida que representa a principal causa de morte precoce após o transplante cardíaco. A investigação dos mecanismos da PDG e o desenvolvimento de estratégias para melhor preservação do coração são considerações importantes, dado o potencial impacto salvador de vidas em receptores cardíacos. Portanto, modelos experimentais que permitam uma avaliação robusta e confiável da função cardíaca do doador após um tempo prolongado de armazenamento são essenciais para aumentar nossa compreensão da DPE e facilitar o desenvolvimento de novas terapias. A capacidade de avaliar com precisão a função cardíaca no coração de camundongos permite o acesso a um vasto repertório de modelos murinos transgênicos que podem identificar com precisão os mecanismos de PGD.
Em estudos fisiológicos e farmacológicos, o modelo de perfusão retrógrada de Langendorff é amplamente utilizado para avaliar a função cardíaca7. Especificamente, o desempenho cardíaco é detectado por um balão de silicone conectado a um transdutor de pressão dentro da cavidade do ventrículo esquerdo (VE). Uma característica fundamental da DPE é a contração e relaxamento inadequados do músculo ventricular. Estudos prévios de Langendorff enfocaram o uso do balão do VE para produzir resultados confiáveis e reprodutíveis na avaliação funcional do VE 8,9,10. Entretanto, o uso do balão intracavitário para avaliar a função do ventrículo direito (VD) utilizando o sistema de balões é menos reconhecido.
Dada uma taxa significativa de DPE envolvendo o VD após otransplante11, métodos experimentais para estudar a função do VE e do VD ajudariam a determinar os mecanismos moleculares e fisiológicos que contribuem para a DPE do VD. Esse protocolo mostra que o balão de silicone intracavitário pode fornecer avaliações confiáveis da função do VE e do VD no mesmo coração murino12. Para avaliar o potencial uso do sistema de Langendorff no estudo PGD, examinamos as funções cardíacas com diferentes períodos de armazenamento e encontramos diminuição da função cardíaca em contração e relaxamento com o armazenamento refrigerado prolongado de corações murinos. Curiosamente, o VE apresenta maior redução funcional que o VD. Em resumo, o protocolo aqui descrito pode ser usado para avaliar o efeito de uma droga candidata e de vias moleculares na função do VE e do VD. A capacidade de utilizar este método em corações murinos facilitará a realização de estudos mecanísticos detalhados.

<table><tbody><tr><td>Sutura de seda 4-0</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS108</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Sutura de seda</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS104</td><td></td></tr><tr><td>Farinha multiuso</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Uso geral e precisãoAgulhas hipodérmicas Glide 22 G</td><td>Seringa Fisher scientific</td><td>14-826-5A</td><td></td></tr><tr><td>BD com pontas Luer-Lok (sem agulha)</td> <td>Fisher scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Xarope de Milho</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK Solution</td><td>Essential Pharmaceuticals LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação&nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisão Mundial</td><td>14393/14394</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubos cônicos</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódio sal de mucosa intestinal suína&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Henseleit buffer</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Nusil dispersões de silicone</td> Sistema de perfusão <td>Avantor</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Radnoti</td><td>130101BEZ</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação ex vivo da função biventricular murina em modelo de langendorff

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

A disfunção primária do enxerto (DPE) continua sendo a principal causa de morte precoce após o transplante cardíaco. O tempo de isquemia prolongado durante a preservação do frio é um importante fator de risco para a DPE, e a avaliação confiável da função cardíaca é essencial para estudar as respostas funcionais do coração doador após a preservação pelo frio. O vídeo que acompanha descreve uma técnica para avaliar a função ventricular direita e esquerda murina usando perfusão ex vivo baseada em um modelo de Langendorff após preservação a frio por diferentes durações. Em resumo, o coração é isolado e armazenado em uma solução fria de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK). Em seguida, o coração é perfundido com tampão de Kreb em modelo Langendorff por 60 min. Um balão de silicone é inserido nos ventrículos esquerdo e direito, e os parâmetros funcionais cardíacos são registrados (dP/dt, relações pressão-volume). Esse protocolo permite a avaliação confiável da função cardíaca após diferentes protocolos de preservação cardíaca. É importante ressaltar que essa técnica permite o estudo de respostas de preservação cardíaca especificamente em células cardíacas nativas. O uso de corações murinos muito pequenos permite o acesso a uma enorme variedade de camundongos transgênicos para investigar os mecanismos da PGD.

Corações adultos de camundongos C57Bl/6, com 3 meses de idade, foram colhidos e montados no sistema Langendorff. O coração doador foi armazenado em HTK por 0 e 8 h e, em seguida, perfundido com tampão KH oxigenado. Um balão de silicone conectado a um transdutor de pressão foi usado para medir a contração e o relaxamento da função do VE e VD.
As pressões aórticas foram mantidas na faixa de 70-80 mmHg. A frequência cardíaca foi comparável em corações de camundongos com 0 e 8 h de armazenamento. As funções do VE e VD foram examinadas medindo-se as pressões sistólica e diastólica. dP/dt, uma derivada para calcular a razão de variação de pressão, foi calculada para determinar a dinâmica da pressão. O número absoluto de dP/dt máx e dP/dt min poderia representar o nível de contração e relaxamento muscular. Em 0 h de armazenamento, o VE apresentava maior pressão sistólica em relação ao VD (Figura 2C e Figura 3A). O VE apresentou maior contração e relaxamento muscular que o VD após perfusão de 0 h de armazenamento (Figura 2C e Figura 3B,C). Entretanto, após 8 h de armazenamento refrigerado, tanto o VE quanto o VD apresentaram redução funcional significativa em relação a 0 h basal (Figura 2A-D e Figura 3B,C). As quedas da contração cardíaca foram mais acentuadas no VE. Após 8 h de armazenamento, a contração e relaxamento do VE foi de 25,1% e 30,7% do valor basal de 0 h, enquanto o VD apresentou 32,5% e 29,1% de função em relação ao basal de 0 h (Figura 3B,C). Esses resultados mostraram que a DPE do VE após armazenamento prolongado teve uma redução da contração cardíaca mais significativa do que o VD.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figura 1: Montagem e canulação do coração do camundongo . (A) Configuração geral do setup de perfusão. 1. Reservatório de perfusão. 2. Câmara de oxigenação. 3. Câmara de armadilha de ar. 4. Câmara cardíaca. 5. Interruptor de valor para fluxo e pressão constantes. 6 e 7. Entrada de oxigênio. (B) Corações canulados com o VD à frente. (C) Posição do VD a cortar para abertura de sua cavidade. (D) Bata o tubo do balão com a cânula. Abreviação: VD = ventrículo direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figura 2: Comparando a função do VE versus VD. (A) Registro do traçado de dP/dt máx e mínima no VD e VE no coração doador com 0 h de armazenamento. (B) O registro de dP/dt máx e mínima no VD e VE no coração doador com 8 h de armazenamento. (C,D) Detalhes de dP/dt, pressão do VE, frequência cardíaca e pressão de perfusão no VE e VD em 0 h e 8 h. Abreviações: VD = ventrículo direito; VE = ventrículo esquerdo; dP/dt = relação pressão-tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figura 3: Comparação da função do VE versus VD após armazenamento e perfusão. (A) Pressão sistólica e diastólica do VE e VD após 0 h e 8 h de armazenamento. (B) dP/dt máx e (C) dP/dt mínima do VE e VD após perfusão com 0 h e 8 h de armazenamento. Esse dado é de Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para quantificar de forma confiável a função ventricular direita e esquerda de corações doados após preservação a frio usando um sistema de perfusão ex vivo .

Avaliação ex vivo da função biventricular murina em modelo de Langendorff

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Com o protocolo descrito, podemos comparar o coração doador, o ventrículo esquerdo e a função ventricular após a preservação, e podemos examinar a diferença da biologia da preservação em ambos os ventrículos durante esse processo de preservação. Esta técnica utiliza sistema de perfusão ex vivo para examinar as funções cardíacas após preservação. Ele fornece ferramentas robustas e confiáveis para rastrear novos tratamentos para melhorar as funções cardíacas do doador após a preservação.Comece com a preparação da massa conforme descrito no texto e modele um pequeno pedaço da massa em uma forma oval para obter a cabeça. Fixe-o na extremidade de um fio de espaguete seco. Mergulhe a cabeça na solução de açúcar já preparada e remova-a lentamente quando estiver bem revestida com uma fina película da solução.Em seguida, suspenda o fio de espaguete em um bloco de espuma de poliestireno ou outros suportes para permitir a formação de uma cobertura uniforme e brilhante sobre a cabeça e seque-o durante a noite. No dia seguinte, mergulhe o molde em elastômero de silicone disperso em xileno e coloque o fio de espaguete de volta no bloco de espuma de poliestireno a 37 graus Celsius por duas horas ou até secar. Repita esta etapa mais uma vez.Em seguida, coloque o molde na água para separar e recolher o balão. Conservar o balão em azida sódica a 0,02%. Agora, corte uma ponta romba de uma agulha de calibre 22 e monte uma extremidade romba no balão de silicone enquanto a outra extremidade romba em um tubo de PE.Use uma sutura de seda 4-0 para amarrar o balão no lugar na agulha. Pegue o camundongo C57Black/6 e injete intraperitonealmente 200 unidades de heparina no abdômen do animal para anticoagulação. Depois de confirmar a anestesia adequada com uma pinça no dedo do pé, faça uma incisão logo abaixo do esterno.E usando tesoura, abra o peito cortando o diafragma nas costelas. Em seguida, dobrar a parede torácica anterior para expor completamente o tórax antes de fazer um corte na aorta descendente próximo ao arco da aorta. Agora, transfira o coração, os pulmões e o timo do camundongo para histidina-triptofano-cetoglutarato gelado, ou tampão HTK, para isolar os órgãos.Expor a aorta removendo qualquer tecido conjuntivo. Conecte a extremidade da aorta a uma agulha de calibre 22 e amarre-a com uma sutura de seda 6-0. Certifique-se de que a cânula esteja acima da raiz da aorta, para não interferir com a valva aórtica.Perfundir a aorta por aproximadamente 10 minutos com 10 mililitros de tampão HTK, pré-resfriado a quatro graus Celsius. Dependendo do tipo de experimento, armazene o coração em um tubo de 50 mililitros com HTK gelado por oito horas ou realize imediatamente a profusão. Para realizar a profusão, conecte o coração montado na agulha à cânula no aparelho de Langendorff e amarre-o com uma sutura de seda.Iniciar a profusão em modo de fluxo constante a três mililitros por minuto e, depois de mudar para um modo de pressão constante a 70 a 80 milímetros de mercúrio, ajustar a taxa de perfusão para aproximadamente seis mililitros por minuto. Em seguida, conecte um balão de silicone desinsuflado cheio de água a um transdutor de pressão e uma seringa cheia de água usando uma torneira de três vias. Após 15 a 20 minutos de um período de equilíbrio após a perfusão anterior, cortar o átrio direito, ou AD, e inserir o balão no ventrículo direito, ou VD, através do AD. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do VD e minimize a área aberta do AD para ajudar a restringir o balão no ventrículo.Após 20 minutos da coleta de dados funcionais do VD, corte o átrio esquerdo, ou AE, e insira um balão desinsuflado cheio de água no ventrículo esquerdo, ou VE, através do AE. Use fita adesiva para segurar o balão dentro do LV.To calibre o transdutor de pressão, primeiro encha uma seringa de 10 mililitros com soro fisiológico morno e conecte a seringa à cúpula através de uma torneira de três vias. Abra a torneira e encha lentamente a cúpula com soro fisiológico antes de fechar todas as torneiras e remover a seringa. Em seguida, conecte a cúpula preenchida ao transdutor conectando o manômetro à terceira extremidade do tap de três vias.No software de gravação, no menu suspenso do canal que se conecta ao transdutor, selecione a opção de Bridge Amp. Clique em 0 antes de iniciar a gravação para definir a leitura do transdutor para zero milímetros de mercúrio. Após vários segundos de gravação, empurre lentamente a seringa e aumente a pressão para 100.Clique em Parar para encerrar a gravação. Na caixa de diálogo Conversão de unidades, selecione a área de gravação de zero milímetros de mercúrio e clique na seta para 1 antes de digitar zero milímetros de mercúrio. Da mesma forma, selecione a área de gravação para 100 milímetros de mercúrio.Clique na seta para 2 e digite 100 milímetros de mercúrio. Agora, clique em OK para calibrar o transdutor. Após a calibração, renomeie o canal correspondente ao transdutor de pressão com o balão como Pressão Ventrículo, ou Pressão do VE, e comece a registrar quando o coração estiver conectado ao sistema.Depois de inserir o balão no ventrículo, ajuste o volume de água no balão usando uma seringa micrométrica através da torneira de três vias para manter a pressão diastólica final em cinco a 10 milímetros de mercúrio. Em seguida, renomeie um canal vazio como dP/dt e mantenha o canal fonte derivado como pressão ventricular. Esse canal registra a razão da mudança de pressão na cavidade ventricular durante a contração.Selecione o período estável de medida antes de ir para a configuração no módulo de pressão arterial. Em seguida, selecione a pressão LV como o canal de entrada e clique em seleção antes de pressionar OK. Agora, clique em Exibição do Classificador para remover qualquer ciclo cardíaco discrepante e em Exibição de Tabela para gerar as tabelas para a média de dP/dt máximo e dP/dt mínimo para o período selecionado. Quando o coração de camundongo foi armazenado em tampão HTK por zero horas antes da perfusão, a pressão sistólica mais alta foi registrada para o VE em comparação com o VD. Além disso, comparado ao VD, o VE também apresentou significativamente mais contração muscular, bem como relaxamento.No entanto, quando a perfusão foi realizada no coração após submetê-lo a oito horas de armazenamento refrigerado, tanto o VE quanto o VD apresentaram redução funcional significativa em relação ao estágio de zero hora. Observou-se que as reduções foram mais acentuadas no VE em relação ao VD. A contração e o relaxamento do VE após oito horas de armazenamento foram de 25,1% e 30,7% da função correspondente ao armazenamento de zero-hora, enquanto o VD apresentou 32,5% e 29,1% de função, em comparação com o basal de zero-hora. A indicação de disfunção primária do enxerto de VE após armazenamento prolongado foi mais significativa do que a de VD. A qualidade da preservação depende em grande parte da perfusão da HTK.É importante certificar-se de que a perfusão é consistente para comparar com precisão os diferentes tratamentos. Com a medição precisa da preservação da função cardíaca de um doador, esse método pode ser facilmente adaptado para rastrear drogas que podem melhorar a função cardíaca do doador e, em seguida, validar ainda mais usando um modelo de transplante heterotópico.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O objectivo é para monitorar o estado redox mitocondrial de corações isolados dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Um modelo de coração biventricular trabalhando coelho é apresentado. Alta resolução espaço-temporal de imagens de fluorescência de NADH é usado para monitorar o estado redox mitocondrial do tecido epicárdico.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Neste vídeo, realizamos a perfusão retrógrada de Langendorff de um coração de camundongo isolado. Durante o procedimento, a atividade cardíaca do coração é mantida perfundindo-o retrógradamente com uma solução de perfusão através das artérias coronárias usando uma cânula inserida na aorta ascendente. O modelo é usado para estudar a fisiopatologia cardíaca do coração.

Perfusão cardíaca retrógrada de Langendorff: uma técnica ex vivo para perfundir coração de camundongo isolado

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .

Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de investigação da dinâmica cardíaca por meio de um modelo animal translacional. A abordagem experimental descrita incorpora optocardiografia de dupla emissão em conjunto com um estudo eletrofisiológico para avaliar a atividade elétrica em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto.

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Apresentamos um protocolo para avaliar a função cardíaca biventricular em camundongos por meio da geração de alças pressão-volume (VP) do ventrículo direito e esquerdo no mesmo animal por meio de cateterismo torácico fechado. O foco está no aspecto técnico da cirurgia e na aquisição de dados.

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A aterosclerose é um processo inflamatório crônico. Este manuscrito ilustra um fácil de usar modelo ex vivo para investigar carótida fresco ou placas nas artérias coronárias. O modelo ex vivo permite a investigação de substâncias potenciais sobre o meio inflamatório nas lesões ateroscleróticas humanas e os resultados podem ser analisados ​​através de vários métodos.

A Human<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudar Lesão Biologia

Aprenda a avaliar a função biventricular ex vivo em corações de camundongos após preservação a frio usando o sistema de perfusão de Langendorff. Este método permite quantificar parâmetros cardíacos e comparar o desempenho dos ventrículos esquerdo e direito.

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