Name: In vitro Ensaios de Clivagem usando Caspases de Drosophila Recombinante Purificada para Triagem de Substrato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda ensaios de clivagem in vitro para triagem de substratos usando caspases Dronc e Drice de Drosophila recombinantes purificadas. Este método permite identificar substratos potenciais em biologia celular e neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer à Dra. Elif Kamber-Kaya por sua ajuda para estabelecer o protocolo no laboratório. O Dr. Guy Salvesen gentilmente forneceu o mutante DriceC211A 9. Este trabalho foi financiado por um prêmio MIRA do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de concessão 2R35GM118330. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

1. Expressão de caspase recombinante em bactérias
<ol><li>Clone o gene de interesse (Caspase ou substrato putativo) em um vetor de expressão bacteriana com tag(s) N- e/ou C-terminal(is) usando protocolos padrão23. NOTA: As etiquetas podem aumentar a solubilidade das proteínas recombinantes e são usadas para purificação das proteínas recombinantes. Aqui, Dronc, Drice e seus mutantes catalíticos são clonados no vetor pET28a, que fornece uma tag N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (para informações sobre a cartilha, ver Quadro Suplementar 1).</li>
	<li>Transformar os vetores com os genes de interesse em células BL21 (DE3) pLysS E. coli competentes utilizando procedimentos padrão23,24. Chapear a mistura de transformação em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado (canamicina no caso de pET28a) para selecionar bactérias transformadas. (Consulte a Tabela Suplementar 2.)</li>
	<li>Colher uma colónia da placa e inocular em 5 ml de meio LB contendo o antibiótico adequado para crescer durante a noite a 37 °C a 220 rpm numa plataforma de agitação.</li>
	<li>No dia seguinte, prepare 30-50 mL (por amostra) de meio LB com antibiótico e adicione 1 mL da cultura cultivada durante a noite. A densidade óptica a 600 nm (OD600) utilizando um biofotómetro/espectrofotómetro deve situar-se entre 0,1 e 0,2.</li>
	<li>Aumente a cultura a 37 °C a 220 rpm em uma plataforma de agitação até que o OD600 atinja 0,6. Verifique o OD600 a cada hora até atingir 0,6. Isso leva cerca de 2 a 3 h.</li>
	<li>Para induzir a expressão de proteína (caspase), adicione IPTG a uma concentração final de 0,1-0,2 mM (diluir 1:1.000-1:500 do estoque de IPTG, ver Tabela Suplementar 2).</li>
	<li>Cultivar as culturas durante 3 h a 30 °C a 220 rpm. NOTA: O tempo e a temperatura dependem do tipo de proteína que está sendo expressa e de sua solubilidade. Essas condições podem precisar ser ajustadas se diferentes caspases ou substratos forem expressos.</li>
	<li>Após 3 h, girar as culturas em tubos de centrífuga de 50 mL por 20 min a 4 °C a 2.000 x g. Descarte o sobrenadante e prossiga com o pellet. Observação : O protocolo pode ser interrompido neste ponto e continuado mais tarde. Os pellets bacterianos podem ser congelados a -80 °C.</li>
</ol>2. Extração de caspases recombinantes em pequena escala
<ol><li>Remova os tubos congelados com as culturas peletizadas do armazenamento de -80 °C e mantenha-os no gelo por 10 minutos para suavizar o pellet.</li>
	<li>Após 10 min, adicionar 0,6 mL de tampão de lise celular bacteriana (Tabela Suplementar 2) suplementado com inibidores de protease recém-adicionados, 10 mg/mL de lisozima e 50 U/mL de benzonase nos tubos contendo pellets usando um controlador de pipeta com uma pipeta sorológica de 1 mL.</li>
	<li>Com a mesma ponta da pipeta, dissolva o pellet pipetando para cima e para baixo até que uma solução amarelo-pálida clara sem quaisquer partículas de pellet seja visível. Incubar por 30 min no gelo.</li>
	<li>Transferir o lisado para tubos de centrifugação apropriados e centrifugar os lisados a 17.000 x g durante 40 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfira os sobrenadantes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Este é o extrato bruto que contém as caspases.</li>
	<li>Mantenha os tubos no gelo e prossiga para a purificação com agarose Ni-NTA.</li>
</ol>3. Purificação de caspases em pequena escala
<ol><li>Adicionar 0,2 ml da pasta a 50% de agarose Ni-NTA a cada tubo dos extractos de caspase do passo 2.5. Girar os tubos sobre um rotador de ponta a ponta durante 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Após 1 h, adicionar o extracto com a agarose Ni-NTA a colunas de polipropileno de 1 ml com a ponta intacta, colocadas num rack. Deixe repousar por 5 min.</li>
	<li>Após 5 minutos, remova a tampa das colunas e deixe o sobrenadante fluir para fora por gravidade.</li>
	<li>Adicionar cuidadosamente 1 ml do tampão de lavagem (Tabela Suplementar 2) às colunas sem perturbar a resina embalada de agarose Ni-NTA e lavá-la através do fluxo de gravidade.</li>
	<li>Execute a etapa de lavagem três vezes.</li>
	<li>Para a eluição das caspases, colocar 1,5 mL de tubos de microcentrífuga sob o bocal coletor das colunas após a drenagem completa do tampão de lavagem.</li>
	<li>Adicionar 0,5 ml do tampão de eluição (suplementado com inibidores da protease 1x imediatamente antes da utilização) a cada coluna e recolher o eluato nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. NOTA: O eluato purificado fino será de cor transparente.</li>
	<li>Mantenha os eluídos no gelo e meça a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford25. Confirmar a pureza/homogeneidade das caspases purificadas por SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie Blue26. NOTA: O rendimento de uma cultura de 50 mL de LB varia entre 0,5 e 1,5 mg de proteína caspase. Dado que 0,5 mL de tampão de eluição é usado para eluição, a concentração varia de 1 a 3 mg/mL. É importante usar os eluítes de caspase purificados para ensaios de clivagem in vitro no mesmo dia de lise e purificação, pois essas preparações de caspase perdem atividade durante a noite.</li>
</ol>4. Expressão do substrato de caspase putativa em sistemas de expressão livre de células
NOTA: Neste protocolo, o Drice, o substrato natural do Dronc, é preparado tanto pela expressão recombinante em E. coli (ver secção 3 acima) como pela expressão no lisado de reticulócitos de coelho (RRL), um sistema de expressão livre de células de mamíferos (esta secção, ver abaixo).
<ol><li>Clone o gene do substrato putativo em um vetor de expressão contendo um promotor T7, T3 ou SP6 usando procedimentos padrão23. NOTA: Neste protocolo, DriceC211A está sendo usado como substrato modelo e foi clonado no vetor pT7CFE1-N-Myc, que carrega um promotor T7 para expressão gênica e marca o substrato proteico putativo com um Myc-tag N-terminal para detecção por immunoblotting.</li>
	<li>Na RRL, os substratos candidatos podem ser sintetizados radioativamente ou não radioativamente.<ol><li>Síntese não radioativa: Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, adicione 25 μL de RRL, 2 μL de tampão de reação, 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos -Menos Leucina (1 mM), 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos-Menos Metionina (1 mM), 1 μL de Inibidor de Ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de DNA Molde (0,5 μg/μL) e 1 μL de T7-RNA Polimerase. Adicione água livre de nuclease para ajustar o volume final da reação a 50 μL. Misture suavemente os componentes pipetando ou mexendo com a ponta da pipeta e gire brevemente para baixo. NOTA: O lisado RRL contém 100-200 mg/mL das proteínas endógenas. Para reações de tradução in vitro , adicione o RRL na concentração de 50% (aqui reação de 25 μL/50 μL).</li>
		<li>Síntese radioativa: Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, adicione 25 μL de lisato RRL, 2 μL de tampão de reação, 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos-Menos Metionina (1 mM), 1 μL de Inibidor de Ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de DNA Molde (0,5 μg/μL), 2 μL de Metionina Marcada com S35 (1000 Ci/mmol a 10 mCi/mL) e 1 μL de Polimerase T7-RNA. Adicione água livre de nuclease para ajustar o volume final da reação a 50 μL. Misture suavemente os componentes pipetando ou mexendo com a ponta da pipeta e gire brevemente para baixo. Descarte pontas e tubos em um recipiente de resíduos radioativos. NOTA: Não adicione a mistura de aminoácidos sem leucina. O vetor pT7CFE1 usa um promotor T7 para a expressão de proteínas. Outros vetores usam promotores T3 ou SP6. Nesse caso, as RNA polimerases T3 ou SP6 devem ser usadas em vez da RNA polimerase T7. Por favor, certifique-se de que o modelo de DNA é de alta pureza.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a reacção a 30 °C durante 90 min.</li>
	<li>Gire brevemente por 10 s e coloque os tubos no gelo. Verificar o nível de expressão do substrato putativo em RRL por SDS-PAGE e imunoblotting/autorradiografia. NOTA: A quantidade de extrato de RRL adicionada à reação de clivagem deve ser baseada na quantidade de proteína que pode ser detectada pelo método de detecção (imunoblotting ou autorradiografia S35 ). Proceder ao ensaio de clivagem in vitro (secção seguinte) ou guardá-lo a -80 °C.</li>
</ol>5. Ensaio de clivagem in vitro com substratos gerados com RRL
<ol><li>Tomar o(s) substrato(s) putativo(s) gerado(s), conforme descrito na secção 4. Neste protocolo, N-Myc-DriceC211A é usado como substrato modelo.</li>
	<li>Dependendo do nível de expressão do substrato putativo (a ser determinado separadamente por imunoblot ou análise de autorradiografia, ver etapa 4.4), use 1-10 μL do RRL programado com a proteína de interesse no ensaio de clivagem.</li>
	<li>Adicionar 10 μg de proteína caspase purificada gerada nas secções 1, 2 e 3.</li>
	<li>Elevar o volume total de reação para 50 μL com tampão de ensaio de caspase.</li>
	<li>Incubar as reacções em banho-maria a 30 °C durante 3 h. Certifique-se de incluir os controles apropriados no ensaio de clivagem. Aqui, o mutante catalítico DroncC318A é usado como controle.</li>
	<li>Após 3 h, pare as reações transferindo os tubos no gelo.</li>
	<li>Adicione um volume de buffer de amostra SUD contendo 50 mM de TDT. A reação é interrompida completamente com a adição de buffer de amostra SUD.</li>
	<li>Incubar as amostras a 75 °C num bloco de calor durante 10 minutos.</li>
	<li>Girar rapidamente, misturar agitando, carregar 24 μL por amostra e executar o SDS-PAGE (ver secção 7) ou armazenar as amostras a -20 °C.</li>
</ol>6. Ensaio de clivagem in vitro com proteína de substrato recombinante expressa por bactérias
<ol><li>Adicionar 10 μg de substrato candidato purificado (aqui 6xHis-DriceC211A, gerado nas seções 1, 2 e 3) a um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 10 μg das proteínas caspase purificadas geradas nas secções 1 e 2. Reduza o volume total para 50 μL usando o buffer de ensaio de caspase.</li>
	<li>Siga as etapas 5.5 a 5.9.</li>
</ol>7. SDS-PAGE e immunoblotting
<ol><li>Carregar as reações de clivagem (24 μL) em géis de gradiente Tris-Glycine ou Bis-Tris a 4%-12% (Tabela de Materiais) e realizar eletroforese de proteínas e immunoblotting (ou autorradiografia se usando substratos marcados com S35) para visualizar os resultados usando procedimentos padrão27,28. NOTA: Aqui, neste protocolo, foram utilizados géis gradiente Bis-Tris com buffer de execução Mops e buffer de carregamento LDS. Em geral, os protocolos PAGE comumente usados de géis de Tris-Glycine são executados usando o buffer de corrida Tris-Glycine-SDS e o buffer de carregamento SDS funcionam bem.</li>
</ol>

<ol><li>Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+function+in+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase function in programmed cell death.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).</li>
<li>Hawkins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+cleaves+following+glutamate+or+aspartate+and+is+regulated+by+DIAP1%2C+HID%2C+and+GRIM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+and+dATP-dependent+formation+of+Apaf-1%2Fcaspase-9+complex+initiates+an+apoptotic+protease+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade.</a> Cell. 91 (4), 479-489 (1997).</li>
<li>Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+DRONC+is+regulated+by+DIAP1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1.</a> EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).</li>
<li>Timmer, J. C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).</li>
<li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).</li>
<li>Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apaf-1%2C+a+human+protein+homologous+to+C.+elegans+CED-4%2C+participates+in+cytochrome+c-dependent+activation+of+caspase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3.</a> Cell. 90 (3), 405-413 (1997).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+and+substrate+specificity+of+the+Drosophila+initiator+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).</li>
<li>Fraser, A. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+melanogaster+ICE%2FCED-3-related+protease%2C+drICE%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE.</a> EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).</li>
<li>Denton, D., Mills, K., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+for+studying+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols for studying cell death in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).</li>
<li>Dorstyn, L., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biochemical+analysis+of+the+activation+of+the+Drosophila+caspase+DRONC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).</li>
<li>Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDPs%3A+caspase-dependent+non-lethal+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).</li>
<li>Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+message+from+the+Holy+Land%3A+The+first+international+conference+on+nonapoptotic+roles+of+apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins.</a> FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).</li>
<li>Baena-Lopez, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+about+the+caspase-dependent+functions+without+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">All about the caspase-dependent functions without cell death.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).</li>
<li>Florentin, A., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+levels+and+execution+efficiencies+determine+the+apoptotic+potential+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).</li>
<li>Amcheslavsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+localization+of+apoptotic+caspases+for+non-apoptotic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions.</a> Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).</li>
<li>Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+membranes+non-apoptotic+compartments+for+apoptotic+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases.</a> Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave%3A+towards+more+accurate+prediction+of+caspase+substrate+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites.</a> Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascleave+2.0%2C+a+new+approach+for+predicting+caspase+and+granzyme+cleavage+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets.</a> Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).</li>
<li>Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+mono-ubiquitylation+of+the+Drosophila+initiator+caspase+Dronc+functions+in+both+apoptotic+and+non-apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways.</a> PLoS Genetics. 13 (2), 1006438(2017).</li>
<li>Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+preparation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caspases: preparation and characterization.</a> Methods. 17 (4), 313-319 (1999).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+%284th+edition%29%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition)</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e253(2007).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Hirano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).</li>
<li>Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Western blot techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Fogarty, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+reactive+oxygen+species+drive+apoptosis-induced+proliferation+via+Drosophila+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages.</a> Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interactions+between+Drosophila+caspases+and+the+proapoptotic+genes+rpr%2C+hid%2C+and+grim%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).</li>
<li>Edfors, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+validation+of+antibodies+for+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced validation of antibodies for research applications.</a> Nature Communications. 9 (1), 4130(2018).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Brizzard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging.</a> Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).</li>
<li>Kanuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+cell+death+pathway+by+Dapaf-1%2C+a+Drosophila+Apaf-1%2FCED-4-related+caspase+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator.</a> Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).</li>
<li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+is+a+Drosophila+homologue+of+Apaf-1%2FCED-4+and+functions+in+an+evolutionarily+conserved+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway.</a> Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).</li>
<li>Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAC-1%2C+a+Drosophila+homolog+of+APAF-1+and+CED-4+functions+in+developmental+and+radiation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis.</a> Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).</li>
<li>Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Apoptotic+caspase+activity+preferentially+targets+a+novel+consensus+sequence+associated+with+cytoskeletal+proteins+in+the+developing+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844(2022).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

A maior parte do nosso conhecimento sobre caspases e função da caspase foi derivada de um intenso trabalho em apoptose durante as últimas três décadas. Está muito bem estabelecido que as caspases iniciadoras processam proteoliticamente as caspases efetoras, e centenas de proteínas têm sido identificadas como substratos efetores da caspase durante a apoptose 5,29. Em contraste, muito menos se sabe sobre a função das caspases para processos não-apoptóticos e quais substratos não-apoptóticos eles estão processando. É concebível que as caspases iniciadoras sejam os principais tomadores de decisão aqui. Durante a apoptose, eles ativam caspases efetoras causando morte celular. No entanto, para desencadear processos não apoptóticos, eles podem ativar diferentes proteínas (além das caspases efetoras), que controlam o processo não apoptótico. Este protocolo testa proteínas candidatas como substratos da caspase iniciadora Dronc em Drosophila 17,30.
Os substratos a serem testados no ensaio de clivagem podem ser produzidos em um sistema de expressão livre de células de mamíferos in vitro , como o RRL, ou por expressão recombinante em E. coli. Existem várias vantagens para a expressão in vitro usando RRL sobre a expressão bacteriana. O protocolo de expressão RRL é simples e rápido, permitindo que muitos substratos diferentes sejam preparados em paralelo. Em muitos casos, o extrato de RRL contendo a proteína de interesse pode ser armazenado a -80 °C antes do uso no ensaio de clivagem (embora isso precise ser determinado separadamente para cada substrato). O substrato putativo pode ser marcado com S35-Met, o que permite fácil análise por autorradiografia após SDS-PAGE. Isso é particularmente útil, se nenhum anticorpo específico do substrato estiver disponível. Alternativamente, se a rotulagem S35-Met não for desejada, o substrato putativo pode ser marcado com tags comuns, como tags Flag, HA ou Myc, o que permite a detecção de clivagem da caspase por immunoblotting.
É preciso enfatizar fortemente que o sucesso deste protocolo depende da purificação cuidadosa e consistente das proteínas recombinantes Dronc e Drice. Infelizmente, essas proteínas não podem ser armazenadas – nem mesmo a curto prazo – nem na geladeira nem congeladas. Eles perdem a atividade enzimática durante a noite em qualquer forma armazenada. Portanto, eles precisam ser preparados recentemente no dia do ensaio de clivagem. Independentemente da(s) proteína(s) candidata(s) a ser testada(s), DriceC211A deve ser sempre utilizado como controlo positivo para validar a actividade enzimática da preparação empeso de Dronc (ver Figura 2B,C). Alternativamente, a atividade das preparações de Dronc e Drice também pode ser testada por clivagem in vitro de substratos tetrapeptídicos sintéticos fluorogênicos 2,9,31.
Se os anticorpos forem utilizados para detectar os substratos candidatos, eles precisam ser validados pelo usuário32,33. Isso também se aplica a anticorpos comercialmente disponíveis que detectam marcas de epítopos, como Flag, HA, Myc ou outros. A má qualidade dos anticorpos pode obscurecer resultados importantes. Recomenda-se também a marcação de epítopos duplos dos substratos candidatos nos terminais N e C com diferentes marcações34. Se ocorrer clivagem, a marcação dupla ajuda a rastrear ambos os produtos de clivagem e pode ajudar a elucidar se a clivagem ocorrer em um ou mais locais.
Embora este protocolo valide facilmente o substrato biológico conhecido de Dronc, Drice, também existem limitações. Uma limitação é que este é um protocolo in vitro com proteínas recombinantes. Nestes ensaios, as caspases estão presentes em uma concentração não fisiologicamente alta, o que é evidente a partir da observação de que elas podem se autoprocessar espontaneamente em E. coli. O autoprocessamento espontâneo geralmente não ocorre sob as condições fisiológicas. Esta alta concentração de caspase pode causar atividade espúria, resultando em falsos positivos. Os falsos positivos podem ser eliminados diminuindo a concentração de caspase na reação de clivagem in vitro . Além disso, conforme descrito em mais detalhes abaixo, ensaios adicionais são necessários para confirmar substratos genuínos e eliminar falsos positivos.
As caspases recombinantes podem não ter a mesma especificidade que têm em seu ambiente celular normal in vivo. Por exemplo, a atividade das caspases pode ser modificada por modificações pós-traducionais. Estes não estão presentes nas proteínas recombinantes. Além disso, in vivo, as caspases iniciadoras, incluindo o Dronc, são incorporadas em grandes complexos proteicos, como o apoptossoma. Sob as condições deste protocolo, a formação do apoptossomo não é alcançada. Isso exigiria a expressão recombinante de Drosophila Apaf-1 (também conhecido como Dark ou Hac-1)35-37, que tem desafios próprios. Portanto, in vitro, o Dronc pode não ter a mesma especificidade que tem in vivo.
Também é concebível que o Dronc seja incorporado em um complexo proteico diferente para processos não apoptóticos. Isso pode conferir uma especificidade de clivagem diferente a Dronc, o que também poderia explicar por que o Dronc não induz apoptose em condições não apoptóticas. Relacionado a isso, CasCleave usa os locais de consenso de clivagem conhecidos para prever novos substratos de caspase. No entanto, não se sabe se os mesmos locais de consenso de clivagem também são usados para processos não apoptóticos. De fato, recentemente, foi demonstrado que a Caspase-3 altera seu local de consenso preferido durante um processo não apoptótico no desenvolvimento auditivo do tronco encefálico no embrião de pintinho38. Da mesma forma, se as caspases iniciadoras forem incorporadas em diferentes complexos proteicos, elas podem ter uma especificidade diferente e, portanto, podem se separar em diferentes sequências de consenso.
Essas limitações ilustram que não é suficiente confiar apenas nos ensaios de clivagem in vitro descritos neste protocolo. Abordagens alternativas devem ser empregadas para validar ainda mais os resultados obtidos usando este protocolo. Idealmente, ensaios in vivo devem ser usados para abordar as seguintes questões: A proteína candidata é processada proteoliticamente durante o processo não apoptótico in vivo? Em caso afirmativo, o mesmo local de clivagem é usado in vivo e in vitro? Qual é a consequência se a clivagem é bloqueada pela mutagênese do local da clivagem? O processamento do substrato candidato depende de caspases e, em caso afirmativo, qual? Qual o papel dos fragmentos de clivagem para o processo não apoptótico? Essas questões podem ser facilmente abordadas nos organismos modelo genético, como C. elegans e Drosophila, usando métodos genéticos e transgênicos padrão.
Em resumo, este protocolo descreve um método confiável e consistente para produzir caspases enzimaticamente ativas, especificamente as caspases Drosophila Dronc e Drice. O objetivo final deste protocolo é examinar se o Dronc pode clivar substratos candidatos in vitro, que foram identificados por abordagens genéticas, bioquímicas ou bioinformáticas. Como explicado no parágrafo anterior, ensaios adicionais são necessários para validar essas proteínas como substratos de caspase in vivo. Dado o grau de conservação dos genes da caspase em todos os metazoários, deve ser possível adaptar este protocolo às caspases de outros organismos também.

A morte celular programada ou apoptose é executada por uma classe de proteases de morte celular altamente especializadas denominadas caspases (revisadas na referência1). Caspases são proteases Cys que contêm um resíduo de Cys no sítio catalítico. Eles definiram locais de clivagem de consenso e clivam substratos proteoliticamente após resíduos de Asp (embora a Drosophila caspase Dronc também tenha sido relatada para clivar após resíduos de Glu2). Eles são subdivididos em caspases iniciadoras (também conhecidas como apical ou upstream) e effector (executor ou downstream). As caspases do iniciador ativam as caspases do efetor. Por exemplo, em mamíferos, o iniciador caspase Caspase-9 cliva e ativa o efetor caspase Caspase-33. Da mesma forma, em Drosophila melanogaster, a caspase-9-ortholog Dronc cliva e ativa a caspase-3-ortholog Drice 2,4. Durante a apoptose, as caspases efetoras clivam centenas de substratos levando à morte da célula5.
As caspases são sintetizadas como proenzimas inativas (zimogens) na célula. Nesta forma, eles contêm um prodomínio N-terminal, uma grande subunidade com o Cys catalítico na porção central da proenzima e uma pequena subunidade no C-terminal 1 (Figura 1). O mecanismo de ativação é diferente entre as caspases do iniciador e do efetor. As caspases iniciadoras (Caspase-9, Dronc) requerem dimerização para ativação, que ocorre pela incorporação em um grande complexo proteico, denominado apoptossomo6. Para a incorporação no apoptossoma, a Caspase-9 e o Dronc possuem um domínio de ativação e recrutamento da caspase (CARD) no prodomínio N-terminal (Figura 1). O componente apoptossomo Apaf-1 também contém um CARD e recruta Caspase-9 ou Dronc via interação CARD/CARD no apoptossomo 3,6,7. Embora a Caspase-9 e o Dronc possam ser processados proteoliticamente no apoptossoma, esse processamento não é totalmente necessário para a atividade enzimática 8,9.
Em contraste, as caspases efetoras (Caspase-3, Drice) não carregam um CARD em seus pró-domínios e não são incorporadas em grandes complexos proteicos para ativação1. Eles são dependentes da clivagem proteolítica pela Caspase-9 ativa ou Dronc1, respectivamente. A caspase efetora ativa forma um tetrâmero composto por duas subunidades grandes e duas pequenas, e assim contém dois sítios catalíticos (Figura 1). É importante ressaltar para este protocolo a expressão recombinante de caspases em E. coli causa autoprocessamento e ativação de caspases, incluindo Drice 10 e Dronc 2,8,9,11,12, mesmo na ausência de Apaf-1. Este autoprocessamento permite realizar ensaios de clivagem in vitro de substratos candidatos com proteína caspase recombinante.
As caspases não estão envolvidas apenas na apoptose, mas também podem ter muitas funções não apoptóticas, incluindo proliferação, diferenciação, migração celular, poda neuronal, imunidade inata e outras13,14,15. Atualmente, não se sabe como as células podem sobreviver, apesar de conter caspases ativas durante processos não apoptóticos. É possível que essas células ativem caspases apenas em níveis subletais16 ou sequestrem caspases ativas em compartimentos não apoptóticos da célula, como a membrana plasmática17,18. Portanto, a identificação e verificação de substratos não apoptóticos não apenas revelará como as caspases medeiam processos não apoptóticos, mas também pode ajudar a entender como as células podem sobreviver na presença de caspases ativas.
Proteínas candidatas como substratos de caspase podem ser identificadas usando métodos genéticos e bioquímicos. As proteínas identificadas podem ser verificadas quanto à presença dos locais de clivagem de Dronc de consenso. Isso pode ser feito inspecionando visualmente a sequência proteica ou utilizando ferramentas de bioinformática on-line mais sofisticadas, como CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Essas ferramentas usam os conhecidos locais de clivagem de consenso de caspases e considerações estruturais para prever novos alvos de caspases. Embora o CasCleave incorpore as informações de substratos verificados de Caspases-1, -3, -6, -7 e -8 humanos, ele também pode, no entanto, ser útil para os fins descritos aqui, pois essas caspases e seus locais de clivagem de consenso são bem conservados. No entanto, como o local de clivagem de Dronc não está bem definido (dois estudos identificaram dois locais de clivagem ideais diferentes, TATD/E2 e LALD9), os substratos candidatos também são examinados quanto à presença de outro local de clivagem da caspase, incluindo Drice.
Para validar os substratos previstos das caspases, são necessários ensaios adicionais. Um desses ensaios é a demonstração de que uma dada caspase pode realmente clivar a proteína candidata in vitro. Aqui, fornecemos um protocolo conveniente para ensaios de clivagem em caspase in vitro . Usando este protocolo, os substratos candidatos são testados com Dronc como caspase. Eles também podem ser testados como substratos de Drice. Embora este protocolo seja escrito para as caspases Drosophila Dronc e Drice, ele também pode ser adaptado para caspases de outros organismos.
A extração e purificação de Dronc e Drice, juntamente com o ensaio de clivagem in vitro, devem ser realizadas no mesmo dia devido à perda de atividade catalítica por essas caspases. Este protocolo foi modificado e otimizado a partir de publicações anteriores 8,9,11,12,21,22. Neste protocolo, quatro proteínas caspase diferentes são expressas recombinantemente na cepa BL21 (DE3) de E. coli pLysS. Essas proteínas são: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt e 6xHis-DriceC211A. Cada uma dessas proteínas é marcada com 6 resíduos de histidina (6xHis) no terminal N para purificação. Dronc wt e Dricewt são as proteínas do tipo selvagem e podem se auto-processar na caspase ativa após a expressão recombinante. DroncC318A e DriceC211A codificam formas mutantes de Dronc e Drice que mudam o resíduo catalítico de Cys para um resíduo de Ala. Essas construções são cataliticamente inativas e não podem ser processadas automaticamente (consulte a Figura 2A). Eles são usados como controles no ensaio de clivagem. Como o DriceC211A não pode ser autoprocessado, ele também é usado como substrato modelo para o Droncwt no ensaio de clivagem in vitro descrito aqui.

<table><tbody><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His anticorpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo IgG, anticorpo ligado a HRP</td><td>Sinalização celular</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Myc</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho IgG, HRP-linked Anticorpo</td><td>Sinalização celular</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Biofotômetro</td><td>Eppendorf</td><td>#6131</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS Células Competentes</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA-25.50</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc com software</td><td>de imagem Bio-Rad</td><td>Universal Hood II</td><td>para imagem de quimioluminescência</td></tr><tr><td>Substrato de quimioluminescência</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>34095</td><td>para imagem de quimioluminescência</td></tr><tr><td>Clivada, Drosophila ICE (drICE) (Asp230)</td> Tecnologia <td>de sinalização celular</td> de anticorpos <td>9478S</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetes</td> <td>descartáveisFisher Scientific</td><td>14955128</td><td>Usado para medir o crescimento bacteriano e a concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610610</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Erlenmeyer, 1000 mL</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS49801L</td><td>Para preparação de meio de ágar LB e frascos Erlenmeyer em autoclavagem</td></tr><tr><td>, 250 mL</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS4980250</td><td>Para crescimento e indução de cultura bacteriana.</td></tr><tr><td>Ácido etileno-diamina-tetra-acético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de gel Sistema SDS-PAGE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>STM1001</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-Drice-pET28a&nbsp;</td><td>Este estudo</td><td>N/A</td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>His-DriceC211A-pET28a&nbsp;</td><td>Este estudo</td><td>N/A</td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>His-Dronc-pET28a&nbsp;</td><td>Este estudo</td><td>N/A</td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>His-DroncC318A-pET28a&nbsp;</td><td>Este estudo</td><td>N / A</td><td>Disponível dos autores</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-&szlig;-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB Ágar, Miller (Pó)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de placas microbiológicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Para crescimento de colônias após transformação</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Kit Midiprep</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotador de tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>para misturar lisados bacterianos e Ni-NTA agarose</td></tr><tr><td>Kit Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipeta motorizado</td><td>Gilson</td><td>F110120</td><td>Para usar pipetas sorológicas</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-1</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Gel de Proteína Midi, 20 poços</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>WG1402BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação orbital com controle de temperatura</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25 agitador</td><td></td>de incubadora</tr><tr><td>Petridish 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Contas de revestimento</td><td>Zymo research</td><td>S1001</td><td>Para espalhar cultura em placas AmpR/KanR</td></tr><tr><td>Colunas de polipropileno (1 mL)</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>Para purificação de proteínas marcadas com His</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de Proteína Concentrado de Reagente de Corante</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>pT7CFE1-NMyc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88863</td><td>Para clonagem de substratos para expressão de RRL</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Invitrogen</td><td>LC2007</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polipropileno tubos de fundo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>352029</td><td>Para o crescimento de culturas de plasmídeos</td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19095</td><td>Para segurar colunas de polipropileno durante a purificação</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade Beckman</td><td>Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>rRNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N251A</td><td>Para expressão RRL</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Falcão Estéreis, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Falcão Estéreis, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70903-250G</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipetas Sorológicas, Tratamento de células estéreis</td><td></td><td>229001B</td><td>Para lise de células bacterianas em tubos de 50 mL</td></tr><tr><td>TnT Lisado de Reticulócitos Acoplado -T7</td><td>Promega</td><td>L4611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Fisher Scientific</td><td>2340</td><td></td></tr><tr><td>Western de transferência úmida</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>STM2001</tr></tbody></table>

in vitro ensaios de clivagem usando caspases de drosophila recombinante purificada para triagem de substrato

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

As caspases são proteases de morte celular muito específicas que estão envolvidas em processos apoptóticos e não apoptóticos. Embora o papel das caspases durante a apoptose tenha sido muito bem definido e muitos substratos proteolíticos apoptóticos das caspases tenham sido identificados e caracterizados, o papel das caspases para processos não apoptóticos não é bem compreendido. Em particular, poucos substratos não apoptóticos de caspases foram identificados até o momento. Aqui, a fim de facilitar a identificação e caracterização de potenciais substratos de caspase, é descrito um protocolo que permite o teste de substratos candidatos em ensaios de clivagem de caspase in vitro . Este protocolo inclui a produção e purificação de proteínas caspase recombinantes, a produção dos substratos candidatos de forma recombinante ou em um sistema de expressão livre de células e a reação real de clivagem in vitro seguida de SDS-PAGE e immunoblotting. Este protocolo é adaptado para as caspases Drosophila Dronc e Drice, mas pode ser facilmente adaptado para caspases de outros organismos, incluindo mamíferos.

Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a indução da proteína caspase em E. coli, purificação do recombinante Drosophila caspases Dronc e Drice, a síntese de substratos candidatos e a reação de clivagem in vitro com substratos candidatos (aqui DriceC211A) e a caspase Dronc. O mutante catalítico DriceC211A foi utilizado como substrato modelo neste ensaio por não possuir atividade de autoprocessamento (Figura 2A) e permanecer de comprimento total até ser clivado peloDronc wt. DriceC211A deve ser sempre usado como um controle positivo para validar que a preparação Droncwt tem atividade enzimática.
A Figura 2A fornece um exemplo representativo da expressão e purificação de caspases recombinantes. Quatro caspases recombinantes diferentes foram induzidas e purificadas: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt e 6xHis-DriceC211A. As caspases purificadas foram executadas por SDS-PAGE, imunoblotted, e o blot foi sondado com um anticorpo anti-His (diluído 1:5.000; seguido por IgG anti-rato, anticorpo ligado à HRP (1:10.000)). O 6xHis-Dronc não processado (proDronc) funciona a um peso molecular relativo (MW r) de 55 kDa (pista 2) e o 6xHis-Drice não processado (proDrice) tem um MWr de 35 kDa (pista 4). O autoprocessamento das caspases é visível pelo aparecimento de bandas de MWr menores que, devido à presença da His-tag no N-terminal, representam as grandes subunidades das caspases (Figura 1). No caso do 6x-Dronc, a grande subunidade tem um MWr de 40 kDa (pista 1). A grande subunidade de 6x-Drice corre a 23 kDa (pista 3). Os mutantes catalíticos 6xHis-DroncC318A e 6xHis-DriceC211A não conseguem se autoprocessar e só são detectáveis como proteínas de comprimento total (faixas 2 e 4).
Figura 2B Para demonstrar que a preparaçãoem peso 6xHis-Dronc produzida e purificada por bactérias tem atividade enzimática, foi realizado um ensaio de clivagem in vitro, conforme descrito neste protocolo. Como controle negativo, foi utilizado o mutante catalítico 6xHis-DroncC318A. O substrato foi N-Myc-DriceC211A gerado por RRL, que é marcado com uma etiqueta Myc no terminal N. Após a reação de clivagem in vitro, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, imunoblotted e as manchas foram incubadas com um anticorpo anti-Myc (diluído 1:1.000) seguido de IgG anti-camundongo, anticorpo ligado à HRP (1:10.000)) para detectar N-Myc-DriceC211A. A clivagem bem-sucedida e, portanto, a atividade enzimática da caspase podem ser demonstradas pelo aparecimento de pelo menos uma banda de MWr menor em comparação com a forma total e não processada do substrato. N-Myc-Drice C211A não processado e de comprimento total tem um MWr de 40 kDa (pistas 2 e 4), enquanto a grande subunidade de N-Myc-DriceC211A processado funciona a 30 kDa (pista 3). A faixa 1 representa o lisado RRL não programado (sem plasmídeo/transcrito adicionado). A pista 2 demonstra a produção in vitro de DriceC211A por expressão RRL. A faixa 3 contém a reação de clivagem in vitro com 6xHis-Droncwt. A faixa 4 contém a reação de clivagem in vitro com 6xHis-DroncC318A.
Figura 2C Uma reação de clivagem in vitro que utiliza caspase recombinante e purificada (6xHis-Droncwt e 6x-His-DroncC318A) e substrato (6xHis-DriceC211A) de acordo com este protocolo, foi analisada por SDS-PAGE e immunoblot. Para a análise da reação de clivagem, o anticorpo Drice anticlivado (diluído 1:5.000; seguido por IgG anti-coelho, anticorpo ligado à HRP (1:10.000)) foi usado neste immunoblot. O anticorpo Drice anticlivado detecta seu neoepítopo na grande subunidade (23 kDa) de 6xHis-DriceC211A somente após o processamento por 6xHis-Droncwt (pista 1). O mutante catalítico 6xHis-DroncC318A é incapaz de processar 6xHis-Drice C211A neste ensaio e 6xHis-DriceC211A de comprimento total aparece como uma banda não processada fraca de 35 kDa (pista 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig01.jpg"> Figura 1: Estrutura do domínio das caspases iniciadoras Caspase-9 e Dronc e das caspases efetoras Caspase-3 e Drice. CARD - domínio de ativação e recrutamento de caspase; Cys - localização relativa do resíduo catalítico de cisteína; L - subunidade grande; S - subunidade pequena. A localização dos prodomínios N-terminal é indicada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos . (A) Análise de immunoblot de preparações recombinantes purificadas 6xHis-Dronc e 6xHis-Drice, sondadas com um anticorpo anti-His. Não processados (proDronc e proDrice) e clivados 6xHis-Dronc e 6xHis-Drice são indicados por setas. Os marcadores MW são indicados à esquerda. (B) Análise de immunoblot da reação de clivagem in vitro de N-Myc-Drice gerado por RRL com caspases 6xHis-Droncwt (pista 3) ou 6x-His-DroncC318A (pista 4) sondadas com um anticorpo anti-Myc. As reações RRL não programadas e programadas (N-Myc-DriceC211A) são carregadas e separadas nas faixas 1 e 2. Não processado (proDrice) e clivado N-Myc-Drice são indicados por setas. Os marcadores MW são indicados à esquerda. (C) Análise de immunoblot da reação de clivagem in vitro do recombinante 6xHis-DriceC211A expresso e purificado bacterialmente com caspases 6xHis-Droncwt (pista 1) ou 6x-His-DroncC318A (pista 2), sondado com um anticorpo Drice anticlivagante. Full-length (proDrice) e clivado 6xHis-DriceC211A são indicados por setas. Os marcadores MW são indicados à esquerda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Quadro complementar 1: Esta tabela contém primers usados para clonagem no vetor pET28a. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Quadro complementar 2: Esta tabela contém a composição de buffers e mídia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Aqui apresentamos um protocolo para expressar e purificar Drosophila caspases recombinantes Dronc e Drice, e seu uso em ensaios de clivagem in vitro .

In vitro Ensaios de Clivagem usando Caspases de Drosophila Recombinante Purificada para Triagem de Substrato

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

Caspases são proteases de cisteína que clivam substratos durante a apoptose e processos não apoptóticos. Este protocolo descreve um ensaio de clivagem in vitro para identificar supostos substratos da caspase iniciadora Dronc de Drosophila. Se seguido cuidadosamente, este protocolo fornece um procedimento confiável para triagem de alto rendimento de substratos putativos da caspase Dronc ou qualquer outra caspase.Embora este protocolo tenha sido projetado para ensaios de clivagem in vitro usando a Drosophila caspase Dronc, ele pode ser facilmente adaptado para caspases de outros organismos, incluindo mamíferos. É importante que a purificação das caspases recombinantes e os ensaios de clivagem in vitro sejam realizados no mesmo dia, porque essas preparações de caspase perdem atividade enzimática rapidamente. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Prathibha Yarikipati, um pós-doutorando do meu laboratório.Para começar, remova os tubos congelados com as culturas peletizadas do armazenamento de menos 80 graus Celsius e mantenha-os no gelo por 10 minutos para suavizar o pellet. Após 10 minutos, adicione 0,6 mililitros de tampão de lise de células bacterianas suplementado com inibidores de protease recém-adicionados, 10 miligramas por mililitro de lisozima e 50 unidades por mililitro de Benzonase, no pellet contendo tubos usando um controlador de pipeta com uma pipeta sorológica de um mililitro. Com a mesma ponta da pipeta, dissolva o pellet pipetando para cima e para baixo até que uma solução límpida e amarela pálida, sem partículas de pellets, seja visível e incube por 30 minutos no gelo.Transfira lisados para tubos de centrífuga apropriados e centrifuja-os a 17.000 G por 40 minutos a 4 graus Celsius. Transfira os sobrenadantes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, que é o extrato bruto que contém as caspases, e mantenha os tubos no gelo. Adicionar 0,2 mililitros da pasta de 50% de agarose de ácido ni-ninitrilacético a cada tubo dos extratos de caspase e girar os tubos em um rotador de ponta a ponta por uma hora a 4 graus Celsius.Após uma hora, adicione o extracto com a agarose do ácido ni-ninilocacético a colunas de polipropileno de um mililitro com uma ponta intacta, colocado numa cremalheira, e deixe repousar durante cinco minutos para permitir que a agarose do ácido ni-nitriloacético se assente. Após cinco minutos, remova a tampa das colunas e deixe o sobrenadante fluir para fora por gravidade. Em seguida, adicione cuidadosamente um mililitro do tampão de lavagem às colunas sem perturbar a resina embalada de acarose do ácido ni-nitrilacético e lave-a através do fluxo de gravidade.Para a eluição das caspases, colocar tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros sob o bocal coletor das colunas, após a drenagem completa do tampão de lavagem. Em seguida, adicione 0,5 mililitros do tampão de eluição a cada coluna e recolha o eluante nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Mantenha os eluantes no gelo e meça a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford.Dependendo do nível de expressão do substrato putativo, use de 1 a 10 microlitros do lisado de reticulócitos de coelho programado com a proteína de interesse no ensaio de clivagem e mantenha-o no gelo. Adicione 10 microgramas de proteína de caspase purificada gerada anteriormente e eleve o volume total de reação para 50 microlitros com tampão de ensaio de caspase. Incubar as reações em banho-maria a 30 graus Celsius durante três horas, garantindo a inclusão dos controlos adequados no ensaio de clivagem.Após três horas, pare as reações transferindo os tubos no gelo e adicione um volume de tampão de amostra SUD contendo 50 milimolares de TDT. Incubar as amostras a 75 graus Celsius em um bloco de calor por 10 minutos. Gire rapidamente, misture agitando, carregue 24 microlitros por amostra e execute a página SDS ou armazene as amostras a menos 20 graus Celsius.Quatro caspases recombinantes diferentes foram induzidas, purificadas e analisadas por SDS-PAGE, imunoblotted, e o blot foi sondado com um anticorpo anti-histidina . O Dronc 6x-Histidine não processado funciona a um peso molecular relativo de 55 kilodalton e o 6x-His DRICE não processado tem um peso molecular de 35 kilodalton. O processamento automático das caspases é visível pelo aparecimento de bandas de menor peso molecular.Para o Dronc clivado é uma faixa de 40 kilodaltons. Para Drice clivado é uma faixa de 23 kilodalton. Após a reação de clivagem in vitro, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, imunoblotted, e as manchas foram incubadas com um anticorpo anti-Myc para detectar Drice C211A com marcação amino terminalmente Myc.Os resultados demonstraram que a preparação do tipo selvagem Dronc 6x-histidina produzida e purificada por bactérias tem atividade enzimática. Isto é visível pela presença da menor faixa de Drice clivada em comparação com a pró-Drice tiado. A reação de clivagem in vitro que utiliza caspase recombinante e substrato foi analisada por SDS-PAGE e immunoblot.Para a análise da reação de clivagem, o anticorpo Drice clivado foi utilizado neste immunoblot. Os resultados demonstraram que a preparação de Dronc 6x-His produzida e purificada por bactérias tem atividade enzimática. Isto é visível pela presença da menor faixa de Drice clivada em comparação com o tio proDrice.Lembre-se de que as caspases recombinantes perdem atividade enzimática rapidamente. Eles não podem ser armazenados, nem mesmo a menos 80 graus Celsius. Os ensaios de clivagem in vitro têm de ser realizados no mesmo dia.Acertos positivos no ensaio de clivagem in vitro devem ser validados in vivo. Isso pode ser feito em células ou em organismos modelo genético, como Drosophila ou C.elegans.

in-vitro-cleavage-assays-using-purified-recombinant-drosophila

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós descrevemos um protocolo simplificado para a geração de "filé" preparações de embriões Drosophila de genótipos específicos. Este protocolo permite a execução eficiente de uma variedade de telas genética. Ele também permite excelente visualização das estruturas do embrião tarde.

Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Este vídeo descreve um método de triagem para identificar moscas transgênicas de Drosophila, cujo genoma foi modificado usando CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma poderosa ferramenta de edição de genoma que revolucionou a maneira como os cientistas podem manipular o genoma de um organismo. No protocolo de exemplo, veremos como identificar mutantes gerados por CRISPR, em que uma inserção de uma sequência de transativação substitui o primeiro éxon do gene branchless (bnl), criando assim uma linha de...

Triagem para modificações genômicas: um método para identificar mutantes gerados por CRISPR em Drosophila

Introdução de moléculas pequenas para o embrião de Drosophila em desenvolvimento oferece um grande potencial para a caracterização de actividade biológica de novos compostos, medicamentos e toxinas, bem como para sondar as vias de desenvolvimento fundamentais. Métodos descritos aqui delinear medidas que superem as barreiras naturais para essa abordagem, ampliando a utilidade do modelo embrião Drosophila.

Um método de permeabilização de<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões para Ensaios de pequena molécula Atividade

Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis ​​de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.

In Vivo Biosensor Tracks apoptótica não-Caspase Atividade em Drosophila

Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS ).

Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Aqui descrevemos um ensaio de fagocitose usando as células embrionárias dispersas de Drosophila . Ele nos permite quantificar de forma fácil e precisa os níveis de fagocitose in vivo e identificar novas moléculas necessárias para a fagocitose das células apoptóticas.

Ensaio de fagocitose para células apoptóticas em Drosophila Embriões

Nós apresentamos um protocolo usando uma aproximação genética para a frente à tela para os mutantes que exibem a neurodegeneração no melanogaster de Drosophila. Incorpora um ensaio de escalada, uma análise da histologia, um mapeamento do gene e um sequenciamento do ADN para identificar finalmente genes novos relativos ao processo de neuroprotection.

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

Drosophila é um modelo experimental amplamente utilizado adequado para o rastreamento de medicamentos com aplicações potenciais para a terapia do câncer. Aqui, descrevemos o uso de fenótipos de cor dos olhos variegated drosophila como um método para triagem de compostos de pequenas moléculas que promovem a formação de heterocromatina.

Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Aprenda ensaios de clivagem in vitro para triagem de substratos usando caspases Dronc e Drice de Drosophila recombinantes purificadas. Este método permite identificar substratos potenciais em biologia celular e neurociência.

In vitro Ensaios de Clivagem usando Caspases de Drosophila Recombinante Purificada para Triagem de Substrato

Explorar mais vídeos