Microcosmos de composto como ambientes microbianamente diversos e naturais para pesquisa de microbioma em Caenorhabditis elegans
13 de setembro de 2022
Os microcosmos de composto trazem a diversidade microbiana encontrada na natureza para o laboratório para facilitar a pesquisa do microbioma em Caenorhabditis elegans. Aqui são fornecidos protocolos para a criação de experimentos de microcosmos, com os experimentos demonstrando a capacidade de modular a diversidade microbiana ambiental para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e a composição do microbioma intestinal do verme.
Este protocolo descreve como criar vermes e microcosmos de compostagem, permitindo a exploração em laboratório das interações hospedeiro-microbioma em um contexto natural. Este método oferece uma alternativa ao isolamento de vermes selvagens da natureza ou ao uso de comunidades microbianas sintéticas de diversidade microbiana limitada. Este protocolo é simples e pode ser realizado em qualquer laboratório e é até mesmo adequado para iniciantes.
Para começar, obtenha composto ou solo de jardim de qualquer fonte conveniente e armazene-o dentro do laboratório em um recipiente de plástico de cozinha padrão com furos cortados na tampa para aeração. Tape os buracos com algodão para manter as moscas da fruta e outros invertebrados fora. Enriqueça o composto ou o solo com produtos picados ou uma mistura de produtos diferentes no solo para produzir uma proporção de dois para um em massa.
Misture o composto uma vez por dia e adicione o meio M9 conforme necessário para manter a umidade sem torná-la lamacenta. Para cada microcosmo, adicione 10 gramas de composto enriquecido a um copo de vidro de 30 mililitros coberto com tinfoil. Adicione 30 gramas de composto enriquecido a cada tubo de 50 mililitros.
Encha o tubo com M9 e vórtice. Centrifugar os tubos a 560 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Usando uma pipeta sorológica, remova os sobrenadantes sem perturbar o pellet e combine-os em um novo tubo de 50 mililitros.
Concentrar o extracto bacteriano centrifugando o tubo à velocidade máxima durante 15 minutos à temperatura ambiente. Ressuspenda os pellets em M9 suficiente para ter 200 microlitros para cada microcosmo e 200 microlitros para uma placa que servirá como um proxy visível para microcosmos. Adicionar 200 microlitros do extrato microbiano concentrado ao copo de composto autoclavado e à placa NGM proxy visível.
Adicione 500 a 1000 larvas L1 a cada microcosmo e à placa proxy. Forre um tubo de PVC cilíndrico com papel de seda. Este cilindro deve ter uma malha de nylon de um milímetro colada em seu fundo no funil.
Colocar o cilindro no funil Baermann num balão. Adicione 20 mililitros de M9 ao microcosmo do verme. Agite a mistura e, em seguida, despeje a mistura do copo no cilindro revestido de papel de tecido na configuração do funil Baermann.
Submerja o composto no funil inteiramente adicionando mais M9. Desprenda o grampo para liberar o filtrado contendo os vermes colhidos em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, concentre os vermes centrifugando o tubo a 560 G por dois minutos à temperatura ambiente. Repita estes passos e puxe os filtrados de diferentes rodadas se mais vermes forem desejados.
Remova o sobrenadante com uma pipeta sorológica, deixando 15 mililitros no tubo. Transfira o líquido restante para um tubo de 15 mililitros e centrifugar novamente por um minuto para concentrar ainda mais os vermes. Remova 14 mililitros do sobrenadante com uma pipeta sorológica.
Simultaneamente, colete um grama do solo do microcosmo restante em um tubo de 1,5 mililitro enquanto processa as amostras de solo contendo a comunidade bacteriana ambiental, conforme descrito no manuscrito. Transfira um mililitro dos vermes colhidos concentrados para um tubo de 1,5 mililitro usando uma pipeta de vidro. Incube por dois minutos para permitir que os vermes se depositem no fundo do tubo.
Remova o sobrenadante deixando 100 microlitros do pellet intactos na parte inferior do tubo. Lave o pellet com 1,5 mililitros de M9 mais Triton X, permitindo que os vermes se depositem no fundo a cada vez. Transfira os vermes lavados em um volume de 100 microlitros para um novo tubo de 1,5 mililitro usando uma pipeta de vidro.
Para paralisar os vermes, adicione 100 microlitros de cloridrato de levamisol 25 milimolares e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Adicionar 200 microlitros de solução de alvejante a 4% e incubar durante dois minutos. Remova o sobrenadante deixando o fundo de 150 microlitros intacto e lave o pellet de minhoca três vezes com M9 mais Triton X.Estes vermes esterilizados por superfície podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até o uso e podem ser usados mais tarde para aplicações a jusante.
A comparação dos microbiomas intestinais de vermes e comunidades ambientais usando a análise de coordenadas de princípio com base na distância UniFrac não ponderada ou ponderada mostrou agrupamento distinto de microbiomas intestinais de vermes longe daqueles em seus respectivos ambientes. Embora a análise de coordenadas de princípio baseada em distâncias UniFrac não ponderadas não tenha distinguido entre microbiomas de solo e vermes, o agrupamento baseado em distâncias ponderadas revelou uma clara separação dos microbiomas intestinais e compostos de vermes. Neste estudo, vermes criados em microcosmos de composto foram utilizados para sequenciamento de 16S, mas também podem ser usados para testar os efeitos de diferentes microbiomas ambientais na resistência do hospedeiro a condições adversas.
Alternativamente, novos táxons bacterianos podem ser isolados de vermes colhidos de microcosmos de composto, a fim de expandir a diversidade taxonômica e funcional conhecida de comensais intestinais de vermes. Após seu desenvolvimento, o pipeline de microcosmos facilitou a avaliação das contribuições de fatores genéticos ambientais versus hospedeiros na formação do microbioma intestinal.
Visão Geral
Este estudo investiga as interações entre hospedeiro e microbioma utilizando microcosmos de composto em Caenorhabditis elegans, fornecendo um método em laboratório para explorar as relações entre a diversidade microbiana ambiental e o microbioma intestinal de vermes. O método permite condições semelhantes às naturais, sem a necessidade de isolar vermes selvagens ou depender de comunidades sintéticas limitadas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Pesquisa sobre microbioma
- Interações hospedeiro-microrganismo
- Diversidade microbiana ambiental
Antecedentes
- As comunidades microbianas naturais são complexas e diversas.
- Os métodos anteriores apresentavam baixa fidelidade ecológica.
- Este protocolo utiliza composto para imitar de perto as condições naturais.
Métodos Utilizados
- Montagem de microcosmos de compostagem em ambientes laboratoriais
- Uso de Caenorhabditis elegans como organismo modelo
- Sequenciamento 16S e análise de coordenadas principais
Resultados Principais
- Agrupamento distinto dos microbiomas intestinais de vermes em relação às comunidades ambientais
- Revelou o impacto de fatores ambientais versus genéticos do hospedeiro na composição do microbioma intestinal
- Permitiu o isolamento de novas táxons bacterianos de vermes
Conclusões
- O estudo demonstra como microcosmos de compostagem podem facilitar a pesquisa do microbioma em ambientes laboratoriais.
- Destaca a importância do contexto ambiental na formação da diversidade do microbioma, com implicações para estudos futuros sobre resistência do hospedeiro e saúde intestinal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Microcosmos de composto permitem a modelagem em laboratório de interações entre hospedeiro e microbioma em Caenorhabditis elegans, fornecendo uma alternativa escalável à coleta no ambiente natural ou a comunidades sintéticas. Essa abordagem favorece a redução mecanicista de riscos e confiança preditiva na pesquisa de microbiomas, ao capturar diversidade microbiana semelhante à natural. O método potencializa a descoberta inicial e a continuidade translacional em portfólios de P&D direcionados ao microbioma.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Facilita a investigação dos mecanismos moleculares entre hospedeiro e microbioma em um contexto semelhante ao natural.
- Permite a desmistificação biológica ao modelar as influências ambientais e genéticas na montagem do microbioma intestinal.
- Amplia a confiança preditiva na identificação de microbiomas centrais específicos de espécies.
- Permite a validação funcional de alvos em fenótipos impulsionados pelo microbioma.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prepara sistemas validados e microbianamente diversos para ensaios funcionais subsequentes.
- Permite comparação reprodutível e quantitativa de microbiomas intestinais e ambientais utilizando sequenciamento de 16S e análise de coordenadas principais.
- Apoia a padronização de ensaios para avaliação da resistência do hospedeiro a microbiomas ambientais.
- Oferece uma plataforma para triagem escalonável dos efeitos microbianos sobre fenótipos do hospedeiro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos laboratoriais com exposições ambientais relevantes para doenças, visando a descoberta translacional de biomarcadores.
- Permite a continuidade do processo de descoberta até a validação pré-clínica de intervenções no microbioma.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, esclarecendo as contribuições ambientais versus genéticas.
- Amplia a diversidade taxonômica e funcional conhecida de microrganismos comensais intestinais para exploração pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, esclarecimento de vias e validação funcional em contextos de microbioma semelhantes aos naturais.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses mecanicistas de interações entre hospedeiro e microbioma e a redução de riscos ambientais.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis do microbioma para análise comparativa.
- Análises: Oferece análise de coordenadas principais e agrupamento baseado em UniFrac para distinguir comunidades intestinais e ambientais.
- Pesquisa Translacional: Conecta exposições laboratoriais e naturais para alinhamento de biomarcadores e avaliação de intervenções.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e escalonável para diversas aplicações em pesquisa de microbioma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos do microbioma.
- Valor Operacional: Padroniza e amplia a modelagem de microbioma semelhante ao natural para uso entre equipes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper e a eficiência do capital ao esclarecer os efeitos ambientais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de ativos direcionados ao microbioma.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em análise do microbioma e manipulação de C. elegans.
- Exige acesso à infraestrutura de sequenciamento 16S e análise de coordenadas principais.
- Exige padronização entre equipes no preparo de composto e enriquecimento microbiano.
- Adaptável a diferentes sistemas modelo genéticos e ambientais.
- Depende da obtenção reprodutível de composto e do manejo da diversidade microbiana.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Preparation of Compost
1:20
Preparation of Compost Microcosms and Raising Worms in Compost Microcosms
2:39
Preparing a Baermann Funnel, Harvesting Worms from Microcosms, and Collecting the Respective Soil Samples
4:17
Washing and Surface Sterilization of the Harvested Worms
5:43
Results: Comparisons of Worm Gut Microbiomes and Environmental Communities
6:26
Conclusion
