Teste pré-clínico de drogas em tecidos musculares escaláveis de engenharia 3D
7 de abril de 2023
Este protocolo fornece métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D e descreve seu uso em modalidades de triagem pré-clínica de medicamentos. Os métodos descritos utilizam um sistema de detecção magnética para facilitar a avaliação simultânea de 24 tecidos em paralelo.
Nossa plataforma usa tecidos musculares projetados em 3D e hardware de detecção magnética para medir a contratilidade em 24 poços simultaneamente. Isso fornece um método de maior rendimento para avaliar novas terapias in vitro usando tecidos musculares humanos. Nosso método de fundição melhora a consistência e a reprodutibilidade na fabricação de tecidos musculares projetados em 3D.
Projetamos uma placa de fundição consumível de 24 poços equipada com hardware de detecção magnética para medições e análises de contratilidade em nossa plataforma. Este método pode fornecer informações valiosas sobre a modelagem de doenças in vitro, a descoberta de medicamentos e a terapia gênica para qualquer doença muscular que afete a contratilidade. Atualmente, estamos incorporando neurônios motores em nossas construções 3D para criar um modelo de junção neuromuscular também.
Para começar, coloque um kit de fundição de tecido pré-resfriado em um bloco frio ou gelo dentro do exaustor de cultura de células. Coloque a placa de fundição plana no gelo. Adicione trombina ao meio de base para fazer a solução de trombina e mova a rede de pós-treliça da placa de fundição para uma nova placa estéril de 24 poços.
Pipetar 50 microlitros de solução de trombina em cada poço pré-refrigerado da placa de fundição e colocar a treliça de volta no kit. Coloque o kit de fundição de lado no gelo. Em seguida, adicione 500 mililitros de meio RPMI, 10 mililitros de B27 e 2,5 gramas de ácido aminocapróico, ou ACA, para preparar o meio EMT cardíaco.
Retire o meio EMT que será usado para moldar os tecidos e adicione 10 inibidores micromolares de ROCK a ele. Prepare o meio EMT esquelético adicionando 50 mililitros de meio F10 e 0,25 gramas de ácido aminocapróico, ou ACA, para mioblastos primários. Use 0,1 gramas de ACA para mioblastos derivados de IPSC.
Em seguida, filtre estéril, o meio de fundição contendo ACA. Aqueça o reagente de dissociação do grau de cultura celular e um volume igual de EMT médio a 37 graus Celsius. Este meio EMT aquecido será usado para diluir o reagente de dissociação.
Lave as células com PBS e adicione o reagente de dissociação aquecido para levantar as células. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos ou até que as células tenham levantado e verifique as culturas a cada dois ou três minutos, tocando no lado da placa. Uma vez que as células tenham levantado, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros.
Triturar com uma pipeta P-1000 para garantir uma suspensão de célula única. Lavar a placa e o balão com um meio EMT adicional para recolher as células restantes e adicioná-las ao tubo cónico. Novamente, triture as células para garantir uma única suspensão celular.
Adicione o meio EMT para encerrar o processo de dissociação e, em seguida, tire amostras das suspensões celulares para contagens de células. Realize contagens de células usando um contador de células automatizado ou um hemocitômetro em azul de tripano. Gire as células a 200 G por quatro minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em cinco mililitros do meio de base EMT para remover o reagente de dissociação residual.
Depois de centrifugar novamente por quatro minutos, aspirar o sobrenadante e preparar as suspensões celulares nas densidades apropriadas. Calcular os volumes de cada solução celular necessária para compor o número desejado de tecidos e pipetar os volumes calculados de células para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione 10 microlitros de fibrinogênio por EMT à suspensão celular e coloque-a no gelo.
Certifique-se de que cada EMT tenha 90 microlitros de suspensão celular, 10 microlitros de fibrinogênio e 50 microlitros de solução de trombina na construção final do tecido. Em um exaustor de cultura de células, remova a tampa do kit de fundição de tecido e coloque a placa de fundição com a pós-treliça deitada no gelo. Misture a mistura de fibrinogênio celular e desenhe 100 microlitros com uma pipeta P-200.
Adicione 100 microlitros da mistura a poços preparados com 50 microlitros de solução de trombina e triturar cinco vezes para misturar bem. Não empurre a pipeta para além da primeira paragem e remova a ponta após a trituração para evitar a criação de bolhas. Misture a suspensão celular no tubo cônico antes de fundir cada tecido.
Segure a treliça e a placa do poço de fundição simultaneamente usando o dedo indicador e o polegar de uma mão para evitar qualquer movimento da rede ou deixe a placa plana no gelo e agite o balde de gelo para ver a placa de fundição. Repita com uma ponta P-200 fresca para cada tecido até que todos os tecidos estejam moldados. Transfira cuidadosamente o kit semeado para a incubadora e incube a 37 graus Celsius por 80 minutos.
Em seguida, prepare uma placa fresca de 24 poços com dois mililitros por poço do meio EMT para tecidos cardíacos e incube a placa a 37 graus Celsius para aquecer o meio. Após a incubação de 80 minutos, adicione suavemente um mililitro do meio EMT à borda dos poços de fundição e incube por mais 10 minutos a 37 graus Celsius. Após 10 minutos de incubação, levante cuidadosamente a pós-treliça e transfira os tecidos da placa de fundição para uma placa preparada de 24 poços com o meio aquecido.
Finalmente, devolva as placas com tecidos à incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius. A produção malsucedida de EMT pode variar de falhas catastróficas, como o descolamento de tecido dos postes, a falhas estruturais mais sutis, como bolhas de ar e deposição desigual de tecido em torno de ambos os postes. A construção EMT um dia após o casting é mostrada aqui.
Os tecidos musculares esqueléticos foram transferidos para um meio de diferenciação a partir do dia zero de fusão celular e compactação em hidrogel. Do sétimo dia até o dia 28, o mesmo EMT exibiu um comprimento total ligeiramente menor entre os dois postes e uma largura menor quando medido através da seção do meio do EMT. Quatro placas de tecidos foram rastreadas ao longo de 21 dias comparando o diâmetro da EMT ao longo da compactação.
Os pontos de tempo mostram o tamanho consistente do EMT entre as placas. A compactação máxima é alcançada no dia 21, à medida que a remodelação da matriz é estabilizada. A imuno-histoquímica dos EMTs é descrita aqui.
Os EMTs foram fixados no dia 10 de cultura e embutidos em parafina. Cortes transversais finos foram corados com anticorpos contra a cadeia pesada de miosina e distrofina antes da imagem. Essas imagens gráficas representam a força de contração absoluta média medida a partir dos EMTs cardíacos e dos EMTs esqueléticos ao longo do tempo.
O tratamento com doxorrubicina aguda e crônica em tecidos cardíacos modificados é mostrado aqui. Três concentrações de dose diferentes de Dox foram administradas em bolus ou administradas continuamente aos tecidos cardíacos modificados ao longo de 27 dias. A resposta à dose de BDM em tecidos musculares esqueléticos modificados é apresentada nesta figura.
A frequência de batimento cardíaco ou de contração cessa de forma dose-dependente em conjunto com uma cessação da força contrátil indicando cardiotoxicidade quando os EMTs são expostos a este composto. As coisas mais importantes a lembrar ao fundir tecidos são manter tudo frio em todos os momentos, incluindo sua suspensão celular e reagentes e manter a rede de pós-poste completamente estacionária assim que a fundição começar.
Visão Geral
Este protocolo descreve a geração de tecidos musculares cardíacos e esqueléticos tridimensionais, utilizando um sistema de detecção magnética para triagem de fármacos. Os métodos permitem a avaliação simultânea de 24 tecidos, aumentando a produtividade em estudos pré-clínicos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Engenharia de músculo cardíaco e esquelético
- Triagem pré-clínica de fármacos
- Modelagem de tecidos
Antecedentes
- Tecidos musculares projetados em 3D fornecem um modelo in vitro relevante para o estudo de doenças musculares.
- A tecnologia de detecção magnética permite medições de contratilidade de alto rendimento.
- A melhoria da consistência na fabricação de tecidos é crucial para resultados experimentais confiáveis.
- A incorporação de neurônios motores tem como objetivo criar um modelo de junção neuromuscular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para gerar tecidos musculares tridimensionais consistentes.
- Facilitar a descoberta de fármacos e a modelagem de doenças utilizando tecidos musculares humanos.
- Aumentar a produtividade das avaliações de contratilidade in vitro.
Métodos Utilizados
- Preparação de placas de moldagem e soluções de trombina para a formação de tecidos.
- Dissociação e contagem celular para garantir a densidade celular adequada.
- Moldagem de tecidos musculares utilizando soluções de fibrinogênio e trombina.
- Incubação e transferência dos tecidos para meio de diferenciação.
Resultados Principais
- Geração bem-sucedida de tecidos musculares tridimensionais com contratilidade consistente.
- Compactação máxima dos tecidos observada no dia 21.
- A análise imunohistoquímica confirmou a presença de proteínas específicas do músculo.
- Foi alcançada a avaliação de alto rendimento da contratilidade em múltiplos tecidos.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido permite a geração e avaliação eficientes de tecidos musculares.
- Este método pode auxiliar significativamente na descoberta de fármacos e na modelagem de doenças musculares.
- Os trabalhos futuros concentrar-se-ão na integração de neurônios motores nas construções.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Plataformas escalonáveis de tecidos musculares tridimensionais projetados preenchem uma lacuna crítica nos testes pré-clínicos de fármacos, permitindo a avaliação reprodutível e quantitativa da função contrátil em modelos saudáveis e de doença. Esta tecnologia aumenta a confiabilidade preditiva para cardiotoxicidade e miotoxicidade, apoiando a redução precoce de riscos e decisões de portfólio mais informadas. A integração de ensaios de contratilidade sem marcadores e de alto rendimento posiciona esses modelos como ferramentas fundamentais para a continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em sistemas musculares relevantes para a doença.
- Auxilia na redução de riscos mecanicistas mediante a quantificação das respostas contráteis a compostos candidatos.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da medição direta da força muscular e da cinética.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Fornece construtos musculares tridimensionais padronizados e reprodutíveis para fluxos de trabalho de triagem de compostos.
- Oferece leituras quantitativas e de alto rendimento da contratilidade em 24 tecidos simultaneamente.
- Reduz a variabilidade do ensaio e apoia a triagem escalável para detecção de toxicidade cardíaca e miotóxica.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha métricas de contratilidade in vitro com biomarcadores translacionais para segurança cardíaca e muscular esquelética.
- Permite análise longitudinal de efeitos agudos e crônicos de fármacos em tecidos engenheirados.
- Apoia o avanço com ajuste de risco ao modelar toxicidades clinicamente relevantes, como aquelas observadas com BMS-986094.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica de segurança ao fornecer um sistema unificado e escalonável para avaliação funcional do músculo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias em modelos musculares projetados.
- Triagem: Fornece dados quantitativos reprodutíveis de contratilidade para triagem de compostos.
- Análises: Permite a medição de resposta à dose e avaliações longitudinais da força e cinética.
- Pesquisa Translacional: Facilita a correlação com pontos finais clínicos de segurança da função muscular.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma reutilizável e compatível com automação, adaptável a diversas fontes celulares e modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva quanto à segurança e eficácia de medicamentos relacionados aos músculos.
- Valor Operacional: Padroniza a fabricação de tecidos e as medições, reduzindo taxas de falha e intervenção manual.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir ao fornecer dados quantitativos de segurança precoces.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e reduz a desistência em fases avançadas devido a toxicidades musculares inesperadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de tecidos tridimensionais e operação de ensaios de contratilidade.
- Necessita de acesso a equipamentos de detecção magnética e placas de moldagem compatíveis de 24 poços.
- Exige padronização entre equipes para protocolos de análise de dados e fabricação de tecidos.
- Adaptável a diversas fontes celulares, incluindo mioblastos derivados de iPSCs e mioblastos primários.
- As limitações incluem o risco de desprendimento do tecido, formação de bolhas de ar e inconsistências estruturais se os protocolos não forem rigorosamente seguidos.
