In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

A tecnologia de silenciamento epigenético que desenvolvemos pertence a uma arena maior de tecnologias, que são tecnologias de silenciamento de genes. Antes de começarmos a desenvolver a necessidade de silenciamento epigenético, havia duas muitas alternativas no campo. Um deles é a derrubada de genes por interferência de RNA, e o outro é a ruptura de genes por nucleases artificiais.

E a ruptura genética por nucleases artificiais funciona no nível do DNA. Então você tem seu gene alvo que você quer inativar, e você entrega para a célula algumas nucleases artificiais, que induzem uma quebra de corda dupla. Esse tipo de quebra de corda dupla pode realizar a soma degeneral, mutação frameshift, que finalmente impõe a degeneração de proteínas não funcionais ou simultaneamente a degradação transcricional.

Assim, o silenciamento epigenético funciona entregando a célula, os chamados repressores de transcrição projetados. Estas são algumas pequenas proteínas que são capazes de se ligar ao seu DNA alvo e, em seguida, impor apenas ao seu gene alvo, o chamado marx epigenético. Estas são algumas modificações químicas, que uma vez depositadas no DNA, podem levar à compactação da cromatina.

A compactação da cromatina leva à inibição da transcrição, para que você não tenha mais a expressão do seu gene alvo. E, muito importante, esse tipo de estado repressivo de transcrição pode ser prolongado unido pelas células. Para identificar linhagens celulares que expressam o gene alvo a ser silenciado, procure o gene alvo no Atlas de Proteínas Humanas e navegue pela seção Linha Celular para identificar linhagens celulares representativas do tecido somático de interesse.

A partir das linhagens celulares identificadas, priorize aquelas para as quais protocolos eficientes de entrega gênica transitória estão disponíveis. Em seguida, abra um visualizador de genes e identifique a região do gene alvo para integrar o de expressão de fluoróforo. Em seguida, use CHOPCHOP para identificar e selecionar GNRA, que cortará a região alvo no primeiro íntron do gene Beta-2M.

Em seguida, desenhe um modelo de doador para o local de corte GNRA, consistindo de um braço de homologia esquerdo, um de expressão transgênica livre promotora e um braço de homologia direito. Entregar o sistema de nuclease CRISPR Cas9 e o molde do doador dentro da linha celular K-562 através da nucleofecção, de acordo com as instruções do fabricante. Cultivar as células K-562 por pelo menos 14 dias.

Monitore os níveis de expressão do repórter fluorescente ao longo do tempo usando um citômetro de fluxo. Ative o canal etherin FICO para medir a intensidade de fluorescência do repórter tdTomato. Procure o gene alvo no UCSC Genome Browser e extraia a sequência de nucleotídeos de regiões que potencialmente regulam sua atividade transcricional, como ilhas CpG e locais enriquecidos para acetilação de H3K27.

Cole as sequências selecionadas na ferramenta on-line CHOPCHOP e selecione a repressão como a finalidade dos GNRAs a serem recuperados. O CHOPCHOP fornecerá uma lista de GNRAs mapeados na sequência genética de interesse e listados de acordo com uma pontuação, considerando o número de partidas fora do alvo e a eficiência prevista no alvo. Selecione pelo menos 10 GNRAs por sequência de destino.

Tente selecionar GNRAs que abrangem toda a região para serem integrados sem correspondências completas com outras sequências intergênicas ao longo do genoma. Após transformar os plasmídeos que codificam para o ETRS em células de E.coli quimicamente competentes, rastreie as colônias quanto à presença do plasmídeo portador do ETR por digestão enzimática de restrição e sequenciamento de Sanger. Para clonar os GNRAs dentro do backbone do GNRA phU6, primeiro, gerar oligos usando software de design de biologia molecular.

Acrescentar uma sequência de cinco nucleotídeos a montante do espaçador de proto e rotular este oligo longo de 25 nucleotídeos. Da mesma forma, acrescentar uma sequência de cinco nucleotídeos do complemento reverso do espaçador proto e uma citosina a jusante dele, para gerar um oligo longo de 25 nucleotídeos e marcá-lo. Obtenha esses oligos sintetizados como oligos de DNA de fita simples sem sal ressuspensos em água a 100 micromolares.

Adicione um microlitro de cada oligo a dois microlitros de tampão de recozimento e 16 microlitros de água. Realizar o recozimento oligo colocando a solução em um termociclador a 95 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, esfriar gradualmente até 25 graus Celsius ao longo de 45 minutos.

Diluir um microlitro dos oligos recozidos com 99 microlitros de água livre de nucleases. Em seguida, ligar um microlitro dessa diluição com 50 nanogramas de plasmídeo de GNRA phU6, previamente digerido com a enzima de restrição Bsa1. Transformou 20 microlitros de células de E.coli quimicamente competentes com dois microlitros do produto da ligadura.

Escolha várias colônias para a produção de DNA plasmidial e confirme a clonagem bem-sucedida do espaçador proto por sequenciamento de Sanger. Para entregar os GNRAs e DTRs baseados em CRISPR dCas9 na linha celular repórter em matriz, primeiro, prepare tubos separados contendo 500 nanogramas de cada um dos plasmídeos e adicione 125 nanogramas de diferentes plasmídeos codificadores de GNRA para serem testados. Incluir uma condição de nucleofeção livre de GNRA e ETR como amostra tratada simulada.

Preparar pelo menos três réplicas técnicas por amostra. Pelotizar cinco vezes 10 a quinta célula Beta-2M tdTomato K-562 por tubo e nucleofectá-las com a mistura de plasmídeos. Ressuspenda as células em 200 microlitros de meio de cultura de células de mamíferos RPMI 1640 previamente aquecido e coloque-as na incubadora.

Use citometria de fluxo para medir a porcentagem de células silenciadas em diferentes momentos após a entrega das ETRs. Use células do tipo selvagem sem a sequência de revestimento Flora 4. Para definir o limite de células negativas do repórter.

Use a amostra tratada simulada para definir o portão para as células positivas do repórter. Identificar os três principais GNRAs em termos de eficiência de silenciamento de longo prazo. Use fatos para selecionar as subpopulações negativas do repórter mantidas de forma estável nessas amostras.

Também realizar fatos das amostras tratadas simuladas sob o mesmo tratamento para permitir a comparação adequada em análises subsequentes. Um repórter fluorescente tdTomato foi integrado no primeiro íntron do gene Beta-2M humano por CRISPR Cas9 induzido tomologia dirigida reparo. Células K-562 positivas para repórteres aparecem na amostra tratada após a integração.

Após a entrega transitória da combinação de ETR tripla, juntamente com GNRAs, a análise longitudinal de citometria de fluxo foi realizada para avaliar a expressão do repórter fluorescente. Um pico foi observado na repressão do repórter nas análises agudas, que foi parcialmente reabsorvido devido à diluição mitótica dos plasmídeos codificadores de ETR ao longo do tempo. A deposição efetiva da metilação de CpG no locus alvo pela combinação GNRA da ETR foi evidente pela repressão permanente do repórter em uma fração considerável de células tratadas.

Diferentes GNRAs mostraram eficiência de silenciamento variável a longo prazo. Um dos passos mais importantes para alcançar o silenciamento permanente e eficiente do epigenoma é a identificação de um único RNAg eficaz. Para fazer isso qualquer tipo de aplicação, precisa começar com a identificação das sequências mais responsivas, incluindo promotor e resposta em quaisquer outros sites para reguladores transcricionais.

Uma vez identificado qual poderia ser a região mais responsiva e eficaz, qualquer pessoa deve projetar um tipo diferente de teste de gRNA único como indivíduo ou combinação de gRNA único. Uma das aplicações mais óbvias da edição do epigenoma é, com certeza, a tradução pré-clínica em qualquer ganho de mutação funcional, na qual o silenciamento desse gene poderia ser útil para curar doenças específicas. Alternativamente, devemos de qualquer forma ter em mente que a capacidade de alterar especificamente a regulação epigenética de um determinado promotor pode ser uma ferramenta super útil para a ciência translacional clínica e básica.