Name: Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprenda a cultivar organoides em plataforma de alto rendimento com microtextura para imagem 3D de longo prazo. Este método facilita pesquisas em triagem de fármacos e biologia do câncer com compatibilidade microscópica.

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A pesquisa é apoiada pelo projeto CALIPSO apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa, Gabinete do Primeiro-Ministro, Cingapura, no âmbito de seu programa Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. reconhece o apoio do investigador NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, financiamento inicial MBI e ANR ADGastrulo. A.B. e G.G. reconhecem o apoio do financiamento principal do MBI. A A.B. reconhece a Andor Technologies pelo empréstimo do microscópio BC43.

NOTA: A primeira parte deste protocolo detalha a microfabricação do dispositivo de cultura de células. Um molde primário original com cavidades piramidais pode ser produzido internamente - se as instalações de microfabricação estiverem disponíveis - ou terceirizado para empresas externas. O molde primário utilizado neste trabalho é produzido internamente, com etapas do processo de fabricação descritas em outroslugares 11,13. Um protocolo básico para a microfabricação do molde está disponível no Arquivo Suplementar 1. CRÍTICA: As operações nas etapas 1 a 6 precisam ser conduzidas em um ambiente livre de poeira. Um exaustor de fluxo laminar ou uma sala limpa, se disponível, são preferidos. Durante todas essas etapas, equipamentos de proteção individual (EPIs) precisam ser usados, como luvas, jaleco de laboratório e óculos de segurança.
1. Corte do molde PDMS
<ol><li>Corte pequenas porções do molde PDMS na dimensão necessária para o dispositivo final (por exemplo, 1 cm x 1 cm [Figura 1B]). Cortá-los paralelos às direções XY da matriz. CRÍTICO: Ao cortar o molde PDMS em cubos de 1 cm x 1 cm, execute os cortes em etapas únicas; usando uma lâmina de barbear unilateral, aplique pressão e corte o PDMS em uma única etapa. Isso é para evitar a formação de pequenas partículas de PDMS, que podem se depositar na superfície do molde e afetar a qualidade das etapas da réplica (etapa 3).</li>
</ol>2. Preparação de substratos PDMS planos
<ol><li>Pesar ~15-20 g de resina de base PDMS e 1,5-2 g de seu agente de reticulação (ou seja, uma proporção de 10:1), misture-os cuidadosamente e desgaseifique em um frasco de vácuo por ~20 min.</li>
	<li>Despeje lentamente o PDMS desgaseificado em uma placa de Petri de plástico de 15 cm de largura (diâmetro).</li>
	<li>Cure o PDMS mantendo a placa de Petri em um forno ajustado a 65 ° C por 2 h. Depois de aguardar a conclusão da cura, um filme PDMS plano de ~1,5 mm de espessura (contido na placa de Petri) está pronto para uso (Figura 2A).</li>
	<li>Usando uma lâmina afiada, corte 2 cm x 2 cm pedaços do PDMS (Figura 2B-D). NOTA: A espessura exata desta folha PDMS não é crítica; ~ 1-2 mm é uma faixa adequada. A dimensão para o corte deve ser maior do que o molde texturizado, mas não muito maior, o que resultaria em desperdício de material.</li>
</ol>3. Produção da camada texturizada feita de adesivo UV-curável
<ol><li>Coloque um dado de molde PDMS (conforme preparado na etapa 1) virado para baixo em cima do corte PDMS plano (conforme preparado na etapa 2) (Figura 3A,B). NOTA: Certifique-se de que as saliências piramidais no molde estão orientadas para o substrato PDMS plano e que apenas a superfície superior das pirâmides truncadas está em contato. Avalie o posicionamento correto com um microscópio óptico (Figura 3C,D).</li>
	<li>Para um lado do molde, usando uma pipeta, solte uma pequena quantidade (duas gotas, aproximadamente 0,1-0,2 mL) de adesivo curável por UV (Figura 4A). NOTA: À medida que o líquido entra em contato com a borda do molde, a capilaridade levará o líquido a preencher a cavidade entre o próprio molde e o corte plano do PDMS usado como substrato.<ol><li>Acompanhar a progressão do líquido dentro da cavidade, por exemplo, utilizando um microscópio óptico invertido com objetivo de ampliação de 10x (Figura 4B,C).</li>
	</ol></li>
	<li>Exponha o adesivo curável por UV à luz UV para curá-lo. Ajuste o tempo de exposição dependendo da densidade de potência da fonte UV usada (por exemplo, uma caixa UV-LED com uma densidade de potência de 35 mW/cm 2;2 min a 50% de potência neste protocolo para curar o adesivo completamente).</li>
	<li>Usando a quantidade excessiva de adesivo em uma borda, segure o adesivo curado no substrato PDMS plano pressionando suavemente com um dedo (Figura 5A,B). Enquanto isso, use uma pinça para beliscar um canto do molde ao lado da mesma borda que está sendo mantida para baixo e descasque-a lentamente, certificando-se de que o filme texturizado não seja levantado também. NOTA: A Figura 5C mostra o resultado de um procedimento adequado de remoção do molde; A Figura 5E-G mostra o procedimento errado.</li>
	<li>Apare o excesso de adesivo e o excesso de substrato PDMS usando uma lâmina de barbear para deixar a camada adesiva curada, texturizada, plana no PDMS com o excesso de PDMS em apenas uma borda (Figura 5D), o que será necessário na etapa 5.</li>
</ol>4. Preparação do substrato coverslip
NOTA: Como substrato para o dispositivo final, são utilizadas folhas de cobertura arredondadas padrão de 1,5H com 25 mm de diâmetro. Antes de poderem ser usados, eles precisam ser limpos para remover poeira e / ou resíduos orgânicos de sua superfície.
<ol><li>Limpeza da tampa<ol><li>Mergulhe as tampas em água e sabão por 5 minutos enquanto o ultrassom é aplicado (40 kHz, potência sônica de 110 W).</li>
		<li>Lave as tampas em água limpa deionizada (DI), primeiro por imersão e, finalmente, com água DI corrente de uma torneira. Seque as tampas com uma pistola de gás N2 .</li>
		<li>Mergulhe as tampas em um banho de acetona por 5 min; mova-se imediatamente para um banho de 2-propanol (IPA) por mais 5 minutos.</li>
		<li>Lave as tampas com IPA limpo usando um frasco de espreme. Seque as tampas com a pistola de gás N2 . NOTA: As folhas de cobertura limpas usando este procedimento podem ser armazenadas em um recipiente fechado até que seja necessário. Mantenha-os em um armário seco para evitar que a umidade se deposite em sua superfície.</li>
	</ol></li>
	<li>Quando estiver pronto para ser usado, trate uma tampa limpa com um processo de plasma O 2 curto para melhorar sua hidrofilicidade: O2 20 sccm, pressão de 3 mbar, 60 W no gerador de energia de RF e duração de 60 s.</li>
	<li>Imediatamente após a ativação do plasma, prossiga com o revestimento por rotação da fina camada de adesivo curável por UV, colocando a tampa no mandril a vácuo de um revestidor de spin padrão e despejando uma pequena gota de adesivo no centro da lâmina de cobertura (Figura 6). Execute o processo de revestimento por rotação: espalhamento por 5 s a 500 rpm, revestimento a 3.000 rpm por 45 s (com a aceleração e desaceleração ajustadas a 100 rpm/s).<ol><li>Se o revestimento por rotação não estiver disponível, use a seguinte maneira alternativa de produzir uma fina película de adesivo UV nas tampas:<ol><li>Em uma tampa limpa, solte ~0,1 mL de adesivo curável por UV usando uma pipeta (Figura 7A).</li>
			<li>Pegue uma segunda tampa e coloque-a em cima da primeira para fazer com que o adesivo líquido se espalhe uniformemente entre as duas folhas de cobertura (Figura 7B-D).</li>
			<li>Uma vez que o adesivo de espalhamento tenha atingido as bordas das tampas, separe-as suavemente deslizando uma sobre a outra. Uma vez separadas, ambas as coberturas são totalmente revestidas com uma fina camada de adesivo líquido (Figura 7E). NOTA: O revestimento pode não ser uniforme e liso somente se a separação não for feita com um movimento suave e contínuo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Pré-cura de adesivo curável por UV<ol><li>Após o revestimento, pré-cure o adesivo por exposição aos raios UV. Ajuste o tempo de exposição dependendo da densidade de potência da fonte UV usada (aqui, uma caixa UV-LED com uma densidade de potência de 35 mW/cm2 foi usada por 1 min a 50% de potência). CRÍTICA: O adesivo usado aqui é uma cola óptica. Veja a discussão para pontos-chave relacionados às doses de energia para sua cura.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Transferência do filme texturizado para o substrato final
<ol><li>Pegue um dos filmes texturizados (preparados na etapa 3) e coloque-a em contato com a tampa revestida com adesivo (preparada na etapa 4). Certifique-se de que o contato entre o adesivo parcialmente curado na tampa e o filme texturizado seja o mais uniforme possível (Figura 8A-C). CRÍTICA: Nesta fase, o adesivo na tampa deve ser sólido o suficiente para evitar o refluxo, o que preencheria as cavidades piramidais do filme texturizado quando colocado em contato, mas também seria plástico e adesivo o suficiente para que o contato possa ser otimizado pressionando suavemente o filme texturizado.</li>
	<li>Exponha as folhas de cobertura à luz UV até que a camada adesiva revestida na folha de cobertura esteja totalmente curada. Isso selará o filme texturizado na tampa e fornecerá isolamento à prova de vazamento entre as cavidades piramidais.</li>
	<li>Por fim, retire o substrato plano do PDMS (Figura 8D-F). Usando uma pinça, aperte o PDMS em um canto na borda onde o excesso de material foi deixado após o corte (etapa 3.5). Desta forma, a camada de filme texturizado é deixada adesiva à tampa com acesso aberto na parte superior para a semeadura celular. CRÍTICA: Ao descascar o PDMS plano, o filme texturizado deve permanecer bem preso à tampa. As falhas de adesão são facilmente confirmadas se o filme texturizado puder ser retirado da tampa após a exposição final aos raios UV sem qualquer esforço.</li>
</ol>6. Passivação a longo prazo da cobertura da cultura celular para cultura celular
NOTA: A passivação é obtida através da geração de um revestimento conformacional e contínuo de um copolímero biomimético com uma estrutura semelhante ao grupo polar de fosfolipídios na membrana celular. Este revestimento conformacional impede a adesão das células ao dispositivo de cultura de células
<ol><li>Preparar uma solução com 0,5% (p/v) do copolímero biomimético dissolvido em etanol puro. Conservar a solução a 4 °C para utilização futura.</li>
	<li>Coloque a tampa da cultura celular em uma placa de Petri de 35 mm e cubra-a totalmente com a solução de copolímero biomimético.</li>
	<li>Após 5 min, retirar a cobertura da cultura celular do recipiente com a solução de copolímero biomimético e deixá-la secar à temperatura ambiente no interior do prato final num exaustor de biossegurança (>1 h). NOTA: Um revestimento mais espesso pode ser produzido aumentando a concentração do copolímero biomimético na solução de revestimento; os resultados de um revestimento mais espesso são visíveis sob um microscópio de campo brilhante (Figura 9A).</li>
</ol>7. Semeadura de células
<ol><li>Desgaseificação e esterilização<ol><li>Pouco antes da semeadura celular, dispense solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) nas placas de cultura celular (tipicamente 1 mL para uma placa de Petri de 35 mm). Desgaseifique o prato com o PBS estéril usando um dispositivo ultra-sônico por ~ 10 min, seguido por várias rodadas de pipetagem para remover todas as bolhas. CRÍTICA: Se o ar estiver preso dentro das cavidades piramidais, isso impedirá que as células entrem nelas. Para garantir que não haja ar preso na pirâmide antes da semeadura celular, recomenda-se garantir visualmente (sob um microscópio de campo brilhante de bancada com ampliação de 10x ou 20x) a ausência de ar nessas cavidades (Figura 10).</li>
		<li>Substitua o PBS por meio de cultura estéril e esterilize a placa com luz UV por 30 minutos sob um exaustor de cultura celular. NOTA: A partir deste passo, o prato deve ser considerado estéril e manipulado usando técnicas estéreis. Uma maneira alternativa de remover o ar preso do dispositivo de cultura de células é usar um frasco de vácuo com uma bomba de vácuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da suspensão celular NOTA: As células podem ser semeadas como agregados de células únicas ou pequenas e entrar nos poços de amostra através da abertura superior. Com o tempo, as células inseridas se agregam e crescem dentro dos poços de amostra em esferoides de tamanho maior que o tamanho da abertura. Como modelos de linhagem celular validados, use células cancerígenas HCT116 (CCL-247 ATCC) ou MCF7 (HTB-22 ATCC) mantidas em meio de cultura recomendado (diretrizes ATCC).<ol><li>Prepare uma suspensão celular (por exemplo, usando um processo de tripsinização seguindo as diretrizes ATCC). Siga as recomendações de preparação de tripsinização/suspensão celular para as células de interesse.</li>
		<li>Contar e ajustar a concentração celular para 0,5 × 106 células/ml no meio de cultura recomendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Dispensação de células<ol><li>Remova o tampão PBS da placa de cultura celular de 35 mm e, em seguida, dispense 1 mL da suspensão celular ajustada. Veja a Figura 11A para uma imagem de microscópio óptico de um procedimento de semeadura celular com densidade e homogeneidade celulares adequadas.</li>
		<li>Coloque a placa de cultura celular de volta na incubadora de células (37 °C, 5% de CO2 e 100% de umidade) por 10 min. Aproximadamente 80-100 células entrarão em cada cavidade piramidal. NOTA: É possível aumentar o número de células por placa de cultura de células aumentando a concentração celular ou o tempo gasto antes da remoção da suspensão celular. Normalmente, a formação de esferoides leva várias horas (dependendo do tipo de célula) após a semeadura da célula e pode ser seguida com um microscópio de campo brilhante (objetivos de 4x a 40x; Figura 11). A partir daqui, o meio de cultura, as matrizes extracelulares e os fatores de crescimento de diferenciação podem ser alterados ou adicionados ao prato de cultura celular contendo os esferoides de acordo com protocolos típicos de diferenciação que podem durar alguns dias, semanas ou meses.</li>
		<li>Após a incubação de 10 minutos, recupere a placa de cultura celular da incubadora e aspirar suavemente a suspensão celular para remover as células não aprisionadas. Adicione 1 mL de meio de cultura a um prato de 35 mm e coloque-o de volta na incubadora celular. CRÍTICA: Nesta fase, como os esferoides ainda não se formaram, é muito importante evitar uma forte aspiração ou dispensação que resultará na perda das células. O controle visual usando um microscópio de campo brilhante de bancada é altamente recomendado nesta etapa.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Imunocoloração e imagem
<ol><li>Fixação e coloração NOTA: Diferentes procedimentos clássicos de fixação e imunocoloração são completamente compatíveis com a placa de cultura celular. Um protocolo típico é descrito aqui.<ol><li>Fixar os organoides/esferoides no prato de cultura celular durante 20 min em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente.</li>
		<li>Permeabilizar os organoides por 24 h em solução surfactante a 1% em PBS estéril a 4 °C em um agitador orbital e incubar por 24 h em tampão de bloqueio (albumina sérica bovina a 2% [BSA] e surfactante a 1% em PBS estéril) a 4 °C em um agitador orbital.</li>
		<li>Incubar as amostras com anticorpos primários de interesse numa diluição entre 1/50 e 1/200 (ou de acordo com as recomendações do fabricante) em tampão de diluição de anticorpos (2% BSA e 0,2% surfactante em PBS estéril) a 4 °C durante 48 h.</li>
		<li>Enxaguar as amostras 3x com tampão de lavagem num agitador orbital (NaCl a 3% e tensoactivo a 0,2% em PBS estéril) e incubar com os anticorpos secundários correspondentes no tampão de diluição de anticorpos (diluição entre 1/100 e 1/300 ou de acordo com as recomendações do fabricante), 0,5 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e 0,2 μg/ml Alexa Fluor 647 ou 488 Faloidina a 4 °C durante 24 h num agitador orbital, seguido de cinco etapas de enxágue com PBS. Opcionalmente, monte as amostras utilizando um agente desmatante solúvel em água pré-aquecido a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagiologia NOTA: Nesta fase, os organoides na placa do micropoço podem ser considerados como um prato de cultura normal contendo amostras fixas e coradas para imagem: qualquer procedimento de imagem padrão pode ser usado sem necessidade de adaptação ou modificação. A Figura 12 ilustra um resultado representativo das imagens e da reconstrução 3D obtidas por meio de um microscópio confocal de disco giratório, com objetiva de ar 40x (abertura numérica de 0,75).<ol><li>Utilizar software construtor para o processo automático de aquisição de imagens com as seguintes configurações: tempo de exposição = 50 ms, com um estágio z motorizado para adquirir uma z-stack (1 μm Z-step, para uma altura total de 70 μm).</li>
		<li>Realizar reconstrução 3D utilizando software de análise de imagens.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Liberação e coleta dos organoides
NOTA: A camada adesiva texturizada da placa de cultura celular pode ser separada da folha de cobertura para liberar os esferoides/organoides vivos (antes da fixação) contidos dentro das cavidades piramidais para análise das células com outros procedimentos, como sequenciamento de RNA, abordagens -ômicas, experimentos in vitro e transplante in vivo .
<ol><li>Com a amostra ainda na placa de Petri e em um exaustor de biossegurança, use uma lâmina, como um bisturi, para cortar um canto da camada adesiva texturizada.</li>
	<li>Com a pinça, aperte a camada adesiva texturizada na borda cortada e retire-a suavemente da tampa de vidro, mas mantenha-a imersa no meio (alguns organoides podem estar permanecendo com a camada adesiva, Figura 13).</li>
	<li>Enxaguar 3x com meio de cultura e coletar os organoides por pipetagem.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Takebe, T., Wells James, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
<li>Vives, J., Batlle-Morera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+developing+human+3D+organoids+into+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">The challenge of developing human 3D organoids into medicines.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72(2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274(2020).</li>
<li>Lukonin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+intestinal+organoid+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration.</a> Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).</li>
<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+3D+imaging+method+for+quantitative+characterization+of+organoid+development+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

Um pedido de patente internacional foi publicado com o Número de Publicação WO 2021/167535 A1.

O procedimento para a fabricação do prato de cultura de micropoços, que permite o cultivo e diferenciação de organoides de alta densidade, foi descrito neste trabalho. Devido à geometria e disposição das microcavidades, milhares de esferoides podem ser cultivados e corados em uma única placa por longos períodos de tempo (várias semanas ou mais) com quase nenhuma perda de material. Como comparação, uma área de 4 mm x 2 mm na placa de cultura celular pode conter tantos esferoides quanto uma única placa de 384 poços com uma...

Em culturas organotípicas de células 3D, doravante referidas como organoides, as células-tronco se diferenciam e se auto-organizam em estruturas espaciais que compartilham fortes semelhanças morfológicas e funcionais com órgãos reais. Os organoides oferecem modelos valiosos para estudar a biologia e o desenvolvimento humano fora do corpo 1,2,3. Um número crescente de modelos está sendo desenvolvido que imitam o fígado, cérebro, rim, pulmão e muitos outros órgãos 2,4,5. A diferenciação em organoides é direcionada pela adição de fatores de crescimento solúveis e uma matriz extracelular em uma sequência de tempo precisa. No entanto, em contraste marcante com os órgãos, o desenvolvimento de organoides é bastante heterogêneo.
Além dos inúmeros desafios biológicos6,7, as culturas organoides também apresentam desafios tecnológicos em termos de métodos de cultura celular, caracterização da transcriptômica e imagem. O desenvolvimento de órgãos in vivo ocorre em um ambiente biológico que resulta em uma auto-organização altamente estereotipada dos arranjos celulares. Qualquer alteração fenotípica pode ser usada como proxy para diagnosticar um estado doente. Em contraste, os organoides se desenvolvem in vitro em microambientes minimamente controlados, compatíveis com as condições de cultura celular, resultando em grande variabilidade no caminho de desenvolvimento e na formação de formas para cada organoide individual.
Um estudo recente8 demonstrou que imagens quantitativas da forma organoide (descritores fenotípicos) acopladas à avaliação de alguns marcadores genéticos permitem a definição de paisagens de desenvolvimento fenotípico. Indiscutivelmente, a capacidade de relacionar a diversidade da expressão genômica em organoides com seu comportamento fenotípico é um passo importante para liberar todo o potencial das culturas organotípicas. Assim, implora pelo desenvolvimento de abordagens de imagem dedicadas e de alto conteúdo que permitam a caracterização das características organoides em escalas subcelulares, multicelulares e organoides inteiras em 3D 9,10.
Desenvolvemos uma plataforma versátil de triagem de alto conteúdo (HCS) que permite a cultura organoide simplificada (de células-tronco embrionárias humanas isoladas [hESCs], células-tronco pluripotentes induzidas por humanos [hIPSCs] ou células primárias a organoides 3D, multicelulares e diferenciados) e imagens 3D rápidas e não invasivas. Ele integra um dispositivo de cultura de células 3D miniaturizado de última geração, chamado chip JeWells (o chip doravante), que contém milhares de micropoços bem arranjados ladeados por espelhos de 45° que permitem imagens rápidas, 3D e de alta resolução por microscopia de folha de luz de objetivo único11. Compatível com qualquer microscópio padrão, comercial e invertido, este sistema permite a imagem de 300 organoides em 3D com resolução subcelular em <1 h.
A microfabricação do dispositivo de cultura celular parte de um molde microestruturado existente, que contém centenas de micropirâmides (Figura 1A) com uma base quadrada e paredes laterais a 45° em relação à base. A Figura 1C mostra imagens de microscópio eletrônico (EM) de tais estruturas. O molde em si é feito de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) e pode ser feito como uma réplica de um molde primário (não mostrado aqui) com características correspondentes (como cavidades) usando procedimentos litográficos suaves padrão. O molde primário pode ser produzido por diferentes procedimentos. O utilizado para este protocolo foi feito utilizando gravura úmida de silício, conforme relatado em Galland et al. 11; o procedimento para a fabricação do molde primário não é crítico para este protocolo. As pirâmides estão dispostas em uma matriz quadrada, com o mesmo passo para as direções X e Y (neste caso, o passo é de 350 μm).
Como ilustração, experimentos de prova de conceito12 foram publicados para demonstrar que o chip permite a cultura a longo prazo (meses) e protocolos de diferenciação, definindo com precisão o número de células iniciais nos poços. O desenvolvimento individual de um grande número de organoides pode ser monitorado automaticamente ao vivo usando microscópios padrão de fluorescência de campo brilhante e folha de luz 3D. Além disso, os organoides podem ser recuperados para realizar investigações biológicas adicionais (por exemplo, análise transcriptômica). Este artigo descreve protocolos detalhados para a fabricação das coberturas de cultura celular, o procedimento de semeadura e coloração para microscopia de fluorescência, bem como a recuperação dos organoides.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Bancada BC43</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>microscópio confocal de disco giratório</td></tr><tr><td>soro bovino albumina&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gravação de óxido tamponado</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq água</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H, redondo 25 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>de análise de imagem</td><td>BitPlane</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio óptico de transmissão invertida</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Homogeneizador Ultrassônico</td> <td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>copolímero biomimético</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>Adesivo curável por UV</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>Thermofisher científico&nbsp;</td><td>A12379</td><td>Alexa</td></tr><tr><td>Fluor Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermofisher scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Photo Resist AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>Pico Plasma ferramenta</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>Para tratamento de O2</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>agente de limpeza solúvel em água</td></tr><tr><td>Placa Quente/Agitador RCT</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de Gravação de Íons Reativos</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Meio</td> de cultura <td>de 11875093 Invitrogen</td><td></td><td>para células HCT116</td></tr><tr><td>Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsiloxano ou, em suma, PDMS</td></tr><tr><td>Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Surfactante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Thermofisher Limpador</td><td>ultrassônico científico 15400054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>Fonte de luz UV-LED, comprimento de onda de 365 nm, 35 mW / cm 2 máscara UV de densidade de potência</td></tr><tr><td> alinhador</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3d de organoides

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

A caracterização de um grande número de culturas organotípicas tridimensionais (3D) (organoides) em diferentes escalas de resolução é atualmente limitada por abordagens de imagem padrão. Este protocolo descreve uma maneira de preparar chips de cultura de organoides microfabricados, que permitem imagens ao vivo 3D em multiescala em um instrumento fácil de usar que requer manipulações mínimas e capaz de obter até 300 organoides / h de rendimento de imagem. Esses chips de cultura são compatíveis com os objetivos de ar e imersão (ar, água, óleo e silicone) e uma ampla gama de microscópios comuns (por exemplo, disco giratório, scanner de ponto confocal, campo amplo e campo brilhante). Além disso, eles podem ser usados com modalidades de folha de luz, como a tecnologia de microscopia de iluminação de plano único e objetivo único (SPIM) (soSPIM). 
O protocolo aqui descrito fornece etapas detalhadas para a preparação dos cavacos de cultura microfabricados e a cultura e coloração de organoides. Apenas um curto período de tempo é necessário para se familiarizar, e consumíveis e equipamentos podem ser facilmente encontrados em biolaboratórios normais. Aqui, os recursos de imagem 3D serão demonstrados apenas com microscópios padrão comerciais (por exemplo, disco giratório para reconstrução 3D e microscopia de campo amplo para monitoramento de rotina).

A Figura 8F mostra o aspecto típico de uma cobertura de cultura de células após a fabricação bem-sucedida. A camada adesiva curável por UV parece plana e adere bem à tampa. A transferência da camada adesiva na folha de cobertura pode falhar se a camada na folha de cobertura estiver sobrecurada, ou se a remoção do substrato PDMS plano for feita incorretamente (como mostrado na Figura 8G,H). Em ambos os casos, a falha é evidente, pois nenhum filme...

Este trabalho apresenta um protocolo de fabricação para um novo tipo de substrato de cultura com centenas de microrecipientes por mm2, no qual organoides podem ser cultivados e observados por microscopia de alta resolução. Os protocolos de semeadura celular e imunocoloração também são detalhados.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Este protocolo demonstra uma placa de cultura de células de microtextura projetada para o crescimento de centenas de organoides com conhecimento de material e totalmente compatível com microscopia. Nossa técnica permite gerar eficientemente milhares de organoides, totalmente compatíveis com imagens de longo prazo e cultura celular de longo prazo. Este protocolo é de forte interesse para aplicações biomédicas, como pipeline de triagem de medicamentos e domínios de pesquisa de câncer.A técnica apresentada neste protocolo é fácil de dominar após algumas tentativas por qualquer pessoa que tenha experiência com procedimentos laboratoriais e microscopia óptica. Para começar, corte pequenas porções do molde PDMS na dimensão necessária para o dispositivo final. Cortá-los paralelos às direções XY da matriz.Coloque um dos dados de molde PDMS preparados virado para baixo na seção plana do PDMS. Em seguida, usando uma pipeta, adicione aproximadamente 0,1 a 0,2 mililitros de adesivo curável UV a um lado do molde. Siga a progressão do líquido dentro da cavidade usando um microscópio óptico invertido com ampliação de 10X.Exponha o adesivo à luz UV para curá-lo. Ajuste o tempo de exposição depende

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Toda a estrutura 3D e o conteúdo celular dos organoides, bem como sua semelhança fenotípica com o tecido original podem ser capturados usando o protocolo de imagem 3D de resolução unicelular descrito aqui. Este protocolo pode ser aplicado a uma ampla gama de organoides variando em origem, tamanho e forma.

Resolução unicelular imagens tridimensionais de organoides intactos

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Aqui, fornecemos protocolos detalhados, robustos e complementares para realizar imagens de coloração e resolução subcelular de modelos de cultura celular tridimensional fixa que variam de 100 μm a vários milímetros, permitindo assim a visualização de sua morfologia, composição do tipo celular e interações.

Coloração e Imagem de Alta Resolução de Modelos Organoides e Esferoides Tridimensionais

Um protocolo detalhado é apresentado aqui para descrever um modelo organoide in vitro de células epiteliais nasais humanas. O protocolo tem opções de medições que requerem equipamentos de laboratório padrão, com possibilidades adicionais de equipamentos e softwares especializados.

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

Este protocolo descreve um método semi-automatizado para rastreios de drogas organoides de médio a alto rendimento e software de análise de imagem automatizado e agnóstico ao microscópio para quantificar e visualizar respostas multiparamétricas de drogas organoides únicas para capturar a heterogeneidade intratumoral.

Triagem de Drogas Organoides Tumorais Multiparamétricas Usando Imagem de Células Vivas de Campo Amplo para Análise a Granel e Organoide Único

O presente estudo descreve metodologias para cultivo, congelamento, descongelamento, processamento, coloração, marcação e exame de esferoides e organoides inteiros sob vários microscópios, enquanto permanecem intactos em um hidrogel dentro de um dispositivo multiuso.

Cultura, congelamento, processamento e imagem de organoides e esferoides inteiros ainda em um hidrogel

Este protocolo documenta a fabricação e montagem do SPOT, uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento, nos formatos de 96 e 384 poços. Ele também detalha o processo de semeadura do SPOT, tanto manual quanto usando um manipulador de líquidos disponível comercialmente.

Fabricação reprodutível de SPOT como uma plataforma de cultura baseada em andaimes de alto rendimento

Apresentamos um protocolo passo a passo para imagens tridimensionais de alta resolução, sem rótulos e tridimensionais usando holotomografia de baixa coerência. Este protocolo detalha a preparação da cultura de organoides, aquisição de imagens e análise computacional de imagens, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica estrutural e respostas a medicamentos em organoides vivos.

Imagens 3D de alta resolução e sem rótulos e análise de aprendizado de máquina de organoides intestinais por meio de holotomografia de baixa coerência

Descrevemos pipelines de imagem e rastreamento confocais aplicados a duas estratégias de repórteres: organoides mosaico para resolver comportamentos individuais de células e organoides repórteres de destino para monitoramento de transições de tipos celulares em organoides intestinais humanos e murinos.

Imagens de células vivas e rastreamento de células únicas para monitorar dinâmicas clonais e transições de destino em organoides intestinais humanos e murinos

Nós desenvolvemos um romance de vários compartimentos neurônio plataforma microssistema co-cultura para a investigação in vitro a interação do SNC axônio glia. A plataforma é capaz de realizar até seis experimentos independentes em paralelo e foi fabricado usando um recém-desenvolvido macro / micro método de fabricação híbrida.

Um compartimento Multi-glia do SNC Neuron-Co-cultura plataforma microfluídica

Aprenda a cultivar organoides em plataforma de alto rendimento com microtextura para imagem 3D de longo prazo. Este método facilita pesquisas em triagem de fármacos e biologia do câncer com compatibilidade microscópica.

Uma plataforma de alto rendimento para cultura e imagem 3D de organoides

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