Name: Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a técnica de transdução mediada por fagos φBB-1 em Borrelia burgdorferi, oferecendo uma alternativa à eletroporação para manipulação genética desta espiroqueta causadora da doença de Lyme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O autor deseja agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor por sua discussão útil e Vareeon (Pam) Chonweerawong por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciências Biomédicas e bolsas de pesquisa do corpo docente para Christian H. Eggers da Escola de Ciências da Saúde da Universidade de Quinnipiac.

O autor não tem nada a revelar.

O uso da transdução poderia representar um método de superação de pelo menos algumas das barreiras biológicas e técnicas associadas à eletrotransformação de B. burgdorferi 1,4,13,37. Em muitos sistemas, o bacteriófago pode mover o DNA do hospedeiro (não prófago) entre células bacterianas por transdução generalizada ou especializada 22,23,24,49,50.<sup...

O desenvolvimento de ferramentas para a manipulação genética da bactéria espiroqueta Borrelia burgdorferi tem acrescentado um valor imensurável à compreensão da natureza da doença de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tem um genoma extraordinariamente complexo, composto por um pequeno cromossomo linear e plasmídeos lineares e circulares 5,6. A perda espontânea de plasmídeos, o rearranjo intragênico (movimento de genes de um plasmídeo para outro dentro do mesmo organismo) e a transferência horizontal de genes (HGT, o movimento do DNA entre dois organismos) deram origem a uma quantidade estonteante de heterogeneidade genética entre B. burgdorferi (por exemplo, ver Schutzer et al.7). Os genótipos resultantes (ou "cepas") são todos membros da mesma espécie, mas apresentam diferenças genéticas que influenciam sua capacidade de transmitir e infectar diferentes hospedeiros mamíferos 8,9,10,11. Neste relatório, o termo "estirpe" será utilizado para se referir a B. burgdorferi com um fundo genético derivado naturalmente particular; o termo "clone" será utilizado para se referir a uma estirpe que tenha sido geneticamente modificada para um fim específico ou em resultado de manipulação experimental.
A caixa de ferramentas moleculares disponível para uso em B. burgdorferi inclui marcadores selecionáveis, repórteres de genes, vetores de transporte, mutagênese de transposon, promotores induzíveis e marcadores contra-selecionáveis (para uma revisão, ver Drektrah e Samuels12). O uso efetivo dessas metodologias requer a introdução artificial de DNA heterólogo (estranho) em uma cepa de B. burgdorferi de interesse. Em B. burgdorferi, a introdução do DNA heterólogo é realizada quase que exclusivamente por eletroporação, método que utiliza um pulso de eletricidade para tornar uma membrana bacteriana transitoriamente permeável a pequenos pedaços de DNA introduzidos no meio1. A maioria das células (estimada em ≥99,5%) é morta pelo pulso, mas as células restantes têm alta frequência de retenção do DNA heterólogo13. Embora considerado um dos métodos mais eficientes de introdução de DNA em bactérias, a frequência de eletroporação em B. burgdorferi é muito baixa (variando de 1 transformador em 5 × 104 a 5 × 106 células)13. As barreiras para alcançar frequências mais altas de transformação parecem ser técnicas e biológicas. As barreiras técnicas para o sucesso da eletroporação de B. burgdorferi incluem tanto a quantidade de DNA (>10 μg) que é necessária quanto a exigência de que as espiroquetas estejam exatamente na fase correta de crescimento (meio de bordo, entre 2 × 10 7 células·mL−1 e 7 × 107 células·mL−1) ao preparar células eletrocompetentes 12,13. Essas barreiras técnicas, no entanto, podem ser mais fáceis de superar do que as barreiras biológicas.
Pesquisadores da doença de Lyme reconhecem que os clones de B. burgdorferi podem ser divididos em duas grandes categorias no que diz respeito à sua capacidade de serem manipulados geneticamente13,14. Isolados de alta passagem, adaptados ao laboratório, são frequentemente facilmente transformados, mas geralmente perdem os plasmídeos essenciais para a infectividade, comportam-se de maneira fisiologicamente aberrante e não são capazes de infectar um hospedeiro mamífero ou persistir dentro de um vetor de carrapato12,13. Embora esses clones tenham sido úteis para dissecar a biologia molecular da espiroqueta dentro do laboratório, eles são de pouco valor para estudar a espiroqueta dentro do contexto biológico do ciclo enzoótico. Isolados infecciosos de baixa passagem, por outro lado, comportam-se de maneira fisiológica reflexiva de um estado infeccioso e podem completar o ciclo infeccioso, mas geralmente são recalcitrantes à introdução de DNA heterólogo e, portanto, de difícil manipulação para estudo12,13. A dificuldade em transformar isolados de baixa passagem está relacionada a pelo menos dois fatores diferentes: (i) isolados de baixa passagem muitas vezes se aglutinam firmemente, particularmente sob as condições de alta densidade necessárias para a eletroporação, bloqueando assim muitas células da aplicação completa da carga elétrica ou do acesso ao DNA no meio13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica pelo menos dois diferentes sistemas de restrição e modificação (R-M) transmitidos por plasmídeos que podem ser perdidos em isolados de alta passagem14,16. Os sistemas R-M evoluíram para permitir que as bactérias reconheçam e eliminem o DNA estranho17. De fato, vários estudos em B. burgdorferi demonstraram que as eficiências de transformação aumentam quando a fonte do DNA é B. burgdorferi e não Escherichia coli13,16. Infelizmente, adquirir a alta concentração necessária de DNA para eletroporação de B. burgdorferi é uma perspectiva cara e demorada. Outra preocupação potencial ao eletroporar e selecionar isolados de baixa passagem é que o processo parece favorecer transformadores que perderam o plasmídeo crítico associado à virulência, lp2514,18,19; assim, o próprio ato de manipular geneticamente isolados de B. burgdorferi de baixa passagem via eletroporação pode selecionar clones que não são adequados para análise biologicamente relevante dentro do ciclo enzoótico20. Dadas essas questões, um sistema no qual o DNA heterólogo poderia ser eletrotransformado em clones de B. burgdorferi de alta passagem e, em seguida, transferido para isolados infecciosos de baixa passagem por um método diferente da eletroporação poderia ser uma adição bem-vinda à crescente coleção de ferramentas moleculares disponíveis para uso na espiroqueta da doença de Lyme.
Além da transformação (a absorção de DNA nu), existem dois outros mecanismos pelos quais as bactérias absorvem regularmente o DNA heterólogo: a conjugação, que é a troca de DNA entre bactérias em contato físico direto entre si, e a transdução, que é a troca de DNA mediada por um bacteriófago21. De fato, a capacidade do bacteriófago de mediar a HGT tem sido utilizada como ferramenta experimental para dissecar os processos moleculares dentro de vários sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi não é naturalmente competente para a absorção de DNA nu, e há pouca evidência de que B. burgdorferi codifica o aparato necessário para promover a conjugação bem-sucedida. Relatos prévios descreveram, no entanto, a identificação e caracterização preliminar do φBB-1, um bacteriófago temperado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empacota uma família de plasmídeos de 30 kb encontrados em B. burgdorferi25; os membros desta família foram designados cp32s. Consistente com um papel para φBB-1 na participação em HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. relataram uma cp32 idêntica encontrada em duas cepas com cp32s de outra forma díspares, sugerindo um compartilhamento recente dessa cp32 entre essas duas cepas, provavelmente via transdução29. Há também evidências de recombinação significativa via HGT entre os cp32s em um genoma relativamente estável30,31,32,33. Finalmente, a capacidade do φBB-1 de transduzir tanto cp32s quanto DNA vetorial heterólogo entre células da mesma cepa e entre células de duas cepas diferentes foi demonstrada anteriormente27,28. Diante desses achados, o φBB-1 tem sido proposto como outra ferramenta a ser desenvolvida para a dissecação da biologia molecular de B. burgdorferi.
O objetivo deste relato é detalhar um método para induzir e purificar o fago φBB-1 de B. burgdorferi, bem como fornecer um protocolo para a realização de um ensaio de transdução entre clones de B. burgdorferi e seleção e triagem de potenciais transdutores.

<table><tbody><tr><td>Unidades de filtro de 1 L (PES, 0,22 e micro; tamanho do poro m)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 12 mm x 75 mm (tampa de posição dupla) (polipropileno)</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>comporta 4 mL com baixo volume de vazios (para indução)</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL (polipropileno)</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>CUIDADO: potencial cancerígeno; não estão mais disponíveis, não testaram pipetas Pasteur substitutas de</td></tr><tr><td>5,75" (plugadas com algodão/vidro borossilicato/não estéreis)</td><td>Autoclave Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>antes de usar</td></tr><tr><td>tubos de centrífuga cônicos de 50 mL (polipropileno)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td>absoluto</tr><tr><td>Agarose LE</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Neopeptona</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Bacto TC Leveduralada</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (grau de reposição de soro)</td> <td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio (para biologia molecular)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>CUIDADO: orgânico volátil; use apenas em uma capela de exaustão química</td></tr><tr><td>CMRL-1066 sem L-Glutamina (pó)</td> <td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>Solução de reagente de gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Glicose (dextrose anidra)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0.22 &micro; Tamanho dos poros M)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>para filtrar esterilizar antibióticos e outras soluções de pequeno volume</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>CUIDADO: potencial cancerígeno; use apenas em um exaustor químico</td></tr><tr><td>N-acetil-D-glucosamina</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos (primers para PCR)</td> <td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (kit de extração genômica total)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm e 15 mm)</td>Câmara de contagem <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura da câmara de contagem Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 8000 (PEG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Soro de coelho não estéril traço-hemolisado jovem (NRS)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>inativa o calor conforme as instruções do fabricante</td></tr><tr><td>Cuvetes semi-micro UV transparentes</td><td>USA Scientific</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de sódioThermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td> Solução de sulfato de estreptomicina <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>Millipore Sigma</td> S6501-50G Citrato de sódio di-hidratado Millipore Sigma <td>S1804-500G</td><td>Citrato de sódio para BSK</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

manipulação genética mediada por fagos da espiroqueta da doença de lyme borrelia burgdorferi

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

A introdução de DNA estranho na espiroqueta Borrelia burgdorferi foi quase exclusivamente realizada por transformação usando eletroporação. Este processo tem eficiências notavelmente mais baixas na espiroqueta da doença de Lyme em relação a outras bactérias Gram-negativas melhor caracterizadas. A taxa de sucesso da transformação é altamente dependente de ter concentrado quantidades de DNA de alta qualidade de origens específicas e está sujeita a uma variabilidade significativa de cepa para cepa. Meios alternativos para a introdução de DNA estranho (ou seja, vetores de transporte, repórteres fluorescentes e marcadores de resistência a antibióticos) em B. burgdorferi poderiam ser uma adição importante ao arsenal de ferramentas úteis para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Os bacteriófagos têm sido bem reconhecidos como mecanismos naturais para o movimento do DNA entre bactérias em um processo chamado transdução. Neste estudo, um método foi desenvolvido para usar o onipresente fago borrelial φBB-1 para transduzir DNA entre células de B. burgdorferi de origens genéticas iguais e diferentes. O DNA transduzido inclui DNA borrelial e DNA heterólogo na forma de pequenos vetores de transporte. Esta demonstração sugere um uso potencial de transdução mediada por fagos como complemento à eletroporação para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Este relato descreve métodos para a indução e purificação do fago φBB-1 de B. burgdorferi, o uso deste fago em ensaios de transdução e a seleção e triagem de potenciais transdutores.

O uso de bacteriófagos para mover o DNA entre cepas de B. burgdorferi mais facilmente transformáveis ou clones que são recalcitrantes à eletrotransformação representa outra ferramenta para a investigação molecular contínua dos determinantes da doença de Lyme. O ensaio de transdução aqui descrito pode ser modificado conforme necessário para facilitar o movimento do DNA entre quaisquer clones de interesse usando um ou dois antibióticos para a seleção de transdutores potenciais. A transdução do DNA do prófago e dos...

A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.

Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Este protocolo é significativo porque descreve outra ferramenta importante para dissecar a biologia molecular do agente da doença de Lyme Borrelia burgdorferi. A principal vantagem desta técnica é que, ao utilizar a transdução de fagos, ela fornece um método alternativo para a introdução de DNA na Borrelia burgdorferi sem a necessidade da aplicação de um pulso elétrico, como na eletroporação. Este método poderia ser usado para fornecer mais informações sobre os mecanismos moleculares utilizados por Borrelia burgdorferi para persistir em seu ciclo enzoótico e, finalmente, causar a doença de Lyme em humanos.Para começar, inocular 150 microlitros do clone apropriado de Borrelia burgdorferi em 15 mililitros de BSK em tubos de centrífuga cônica estéreis bem tampados para o protocolo de transdução. Em seguida, complementar o meio com a concentração apropriada de antibióticos ou uma combinação de antibióticos para a seleção e manutenção de DNA heterólogo dentro do clone de Borrelia burgdorferi e incubar a amostra a 33 graus Celsius. Após o crescimento da cultura, centrifugar o volume apropriado de cultura a 6.000 G por 10 minutos.Após a decantação do sobrenadante, ressuscite o pellet em quatro mililitros em BSK fresco e transfira a amostra para o menor tubo estéril disponível para manter a amostra com o mínimo de espaço na cabeça. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de agente indutor à concentração recomendada com base em um volume de cultura de quatro mililitros para induzir a produção de fagos, tampar o tubo firmemente e misturar completamente. Incubar a amostra a 33 graus Celsius por duas a quatro horas.Em seguida, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a amostra a 6 000 G durante 10 minutos. Após decantar o sobrenadante, ressuspeite o pellet celular em 15 mililitros de BSK.Complementar a cultura preparada com a concentração adequada de antibióticos descrita no manuscrito, enquanto incuba a amostra a 33 graus Celsius por 72 a 96 horas. Para preparar soluções para a precipitação de PEG, prepare 500 mililitros de cloreto de sódio de cinco molares, 500 mililitros de 40% de PEG e 100 mililitros de meio de suspensão, conforme descrito no manuscrito. Para esterilizar, autoclave a solução, esfrie antes do uso e armazene a temperatura ambiente ou quatro graus Celsius.Para a precipitação de PEG do fago do clone doador Borrelia burgdorferi, após 72 a 96 horas de incubação, centrifugar as amostras a 8.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o sobrenadante em um tubo cônico limpo de 50 mililitros e descartar a pelota celular. Adicionar cloreto de sódio de cinco molares a uma concentração final de um molar.Depois de misturar bem, agite suavemente à temperatura ambiente durante uma hora. Centrifugar as amostras a 8 000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de decantar o sobrenadante em um tubo cônico limpo de 50 mililitros, como demonstrado anteriormente, adicione a solução de 40% de PEG-8000 ao sobrenadante até uma concentração final de 10%Misture bem e coloque no gelo por mais de uma hora, até a noite.Centrifugar para as amostras a 8.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius, como demonstrado anteriormente. Descarte o sobrenadante e remova o máximo de líquido possível sem perder nenhum pellet, que contém as partículas do fago. Ressuspeite o pellet em um volume mínimo de meio de suspensão usando o meio de suspensão para lavar o lado da garrafa e coletar quaisquer partículas potenciais de fago.Trate a amostra de fago recuperada com um volume igual de clorofórmio com base no volume de ressuspensão. Misture bem a amostra e centrifugar a 8.000 G por 10 minutos. Em seguida, remova a camada aquosa para um tubo limpo, evitando qualquer uma das camadas de interface espessas.Após a determinação do volume recuperado, após o primeiro tratamento com clorofórmio, trate novamente a amostra com uma quantidade de clorofórmio igual a 10% desse volume. Transfira a camada aquosa para um tubo limpo, tendo o cuidado de evitar qualquer uma das camadas de interface ou orgânicas. Use o fago imediatamente ou armazene-o a quatro graus Celsius.Após o preparo das culturas de Borrelia burgdorferi para serem utilizadas como receptoras em ensaios de transdução, como demonstrado anteriormente, centrifugar o volume de cultura a 6.000 G por 10 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 14,5 mililitros de BSK fresco. Adicione menos ou igual a 500 microlitros de amostra de fago precipitado por PEG à cultura do clone receptor.Depois de misturar bem, incubar a 33 graus Celsius por 72 a 96 horas. Realizar a seleção de transdutores por chapeamento em fase sólida após mistura com fago precipitado por PEG conforme descrito no manuscrito. Dependendo do contexto do clone receptor, verifique se as colônias aparecem dentro da agarose nas placas de seleção após 10 a 21 dias de incubação.Escolha pelo menos 5 a 10 colônias que crescem na placa na presença de ambos os antibióticos usando pipeta de borossilicato de 5,75 polegadas com algodão esterilizado e inocule-as em 1,5 mililitros de BSK com o antibiótico apropriado. A amplificação por PCR dos genes foi realizada em 10 dos clones que codificam a resistência à canamicina e gentamicina. O gene de resistência à canamicina pode ser amplificado a partir do doador c1673 e dos potenciais transdutores, mas não do receptor c1706.Da mesma forma, o gene de resistência à gentamicina poderia ser amplificado a partir do receptor c1706 e dos potenciais transdutores, mas não do doador, representando eventos de transdução. Demonstrar que o de resistência à canamicina foi transduzido por 5BB1 do doador para o receptor. O fundo dos transdutores foi determinado usando marcadores específicos de deformação.O clone c1673 e o fundo CA-112A codificam amplificadores específicos quatro, cinco e seis, enquanto c1706, que tem um fundo B31 de alta passagem, não. Da mesma forma, os transdutores um e dois estavam faltando amplicons quatro, cinco e seis, demonstrando que os clones têm o fundo c1706 e adquiriram o gene de resistência à canamicina a partir de c1673. Para a precipitação de PEG do fago, execute todas as etapas cuidadosamente para maximizar o rendimento do fago e trate o fago ressuspenso completamente com clorofórmio para remover o máximo possível de contaminantes de PEG e meios de cultura antes do uso e armazenamento do fago.Uma vez que o ensaio de transdução tenha sido realizado com sucesso e o transdutor verificado, esses clones estão disponíveis para responder às perguntas que requerem Borrelia burgdorferi geneticamente modificada. Espera-se que o desenvolvimento desta técnica permita que os pesquisadores manipulem geneticamente cepas de Borrelia burgdorferi para as quais a introdução de DNA via eletroporação é atualmente difícil.

phage-mediated-genetic-manipulation-lyme-disease-spirochete-borrelia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.

Métodos para a transferência rápida e localização de Patógenos Doença de Lyme no intestino Tick

Fonte: Eggers, C. H. Manipulação genética mediada por phage da espiroqueta da doença de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a preparação de uma cultura de Borrelia burgdorferi geneticamente modificada com DNA de bacteriófago dormente carregando um gene de resistência a antibióticos. Após a seleção e incubação de antibióticos, um indutor químico desencadeia danos ao DNA, levando à excisão, replicação e montagem de novos vírions contendo o gene de resistência. Após...

Preparação e Indução de Culturas de Borrelia burgdorferi para Produção de Partículas Virais

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Phage Purification from Borrelia burgdorferi

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

PCR aninhado é uma técnica simples, sensível e específica que pode ser aplicada a escala que DNA extrai para sondar para Borrelia burgdorferi, o agente causador da doença de Lyme. A experiência inicial da PCR usa primeiras demão gene-específico para gerar amplicons longo, que em seguida tornar-se modelos para uma reação subsequente usando iniciadores internos.

Detectando a doença de Lyme espiroqueta, a Borrelia Burgdorferi, em carrapatos usando PCR aninhado

Ensaios de transcrição in vitro podem decifrar os mecanismos de regulação transcricional em Borreliella burgdorferi. Este protocolo descreve as etapas para purificar a RNA polimerase de B. burgdorferi e realizar reações de transcrição in vitro. Abordagens experimentais usando ensaios de transcrição in vitro requerem purificação e armazenamento confiáveis da RNA polimerase ativa.

Componentes essenciais de ensaios de transcrição in vitro de Borreliella (Borrelia) burgdorferi

O cultivo in vitro é um método de detecção direta da presença de bactérias vivas. Este protocolo descreve métodos para o cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluindo as do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, espécies de Borrelia de febre recidivante e Borrelia miyamotoi.  Estas espécies são fastidiosas e de crescimento lento, mas podem ser cultivadas.

Métodos de Cultivo de Espiroquetas do Complexo Borrelia burgdorferi Sensu Lato e Borrelia de Febre Recidivante

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos...

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo...

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abordagens para a frente genéticos em<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Aprenda a técnica de transdução mediada por fagos φBB-1 em Borrelia burgdorferi, oferecendo uma alternativa à eletroporação para manipulação genética desta espiroqueta causadora da doença de Lyme.

Manipulação Genética Mediada por Fagos da Espiroqueta da Doença de Lyme Borrelia burgdorferi

Explorar mais vídeos