Name: Microdissecção do olho de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprenda microdissecção ocular em roedores para pesquisa oftalmológica usando um protocolo refinado com terceira pálpebra. Este método melhora o acesso às subpartes oculares e minimiza danos aos tecidos frágeis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A Dra. Alaknanda Mishra, Departamento de Biologia Celular e Anatomia Humana, Universidade da Califórnia em Davis, EUA, nos treinou neste método no Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. Este trabalho foi apoiado pela subvenção principal recebida do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia para o Instituto Nacional de Imunologia, Nova Deli. P.S. recebeu uma bolsa de pesquisa do Departamento de Biotecnologia.

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal Institucional do Instituto Nacional de Imunologia, Nova Delhi. O número de referência de série da homologação é IAEC#480/18. Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes de regulamentação do Comitê de Controle e Supervisão de Experimentos em Animais, Ministério das Pescas, Pecuária e Laticínios, Governo da Índia, sob a supervisão de um Veterinário profissional no SAF, NII.
1. Preparação
<ol><li>Dilate os olhos dos roedores usando uma gota de soluções oftálmicas de tropicamida a 0,8% e fenilefrina a 5% em cada olho. Coloque o animal em uma área escura por 30 minutos antes do procedimento. NOTA: Um analgésico não é necessário, pois o animal é sacrificado imediatamente após completar os 30 min. A adaptação escura e a dilatação dos olhos do animal permitem que o observador verifique se há lágrimas oculares e danos antes do procedimento. Além disso, a dilatação é vantajosa ao trabalhar com o tecido pigmentado do globo ocular.</li>
	<li>Eutanasiar o animal administrando por via intraperitoneal uma dose de 5x de anestesia. Uma dose típica é de 200 μL de PBS contendo 10 mg de cetamina e 1 mg de xilazina. NOTA: A dose para a eutanásia do animal é cetamina a 400-500 mg/kg de peso corporal e xilazina a 50 mg/kg de peso corporal administrada por via intraperitoneal. Para um rato típico com peso de 20 g, a dose seria de 200 μL de PBS contendo 10 mg de cetamina (100 μL de uma solução-mãe de 100 mg/ml de cetamina) e 1 mg de xilazina (100 μL de uma solução-mãe de 10 mg/ml de xilazina).</li>
	<li>Confirme a completa falta de resposta a um estímulo examinando o reflexo do pedal. A ausência de batimentos cardíacos e respiração também são indicadores importantes.</li>
	<li>Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho.</li>
	<li>Prepare pinças de sutura Colibri, pinças curvas, uma microlâmina (15°, 3 mm de tamanho), microtesouras de mola e microtesouras de mola angulares prontas para o procedimento.</li>
</ol>2. Enucleação do olho do rato juntamente com a terceira pálpebra
<ol><li>Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho. Abra as pálpebras externas com a pinça para visualizar de forma ideal a terceira pálpebra. NOTA: A terceira pálpebra, também conhecida como membrana nictiforme, está localizada em direção ao canto superior da tangente nasal (Figura 1A).</li>
	<li>Identificar a terceira pálpebra como uma protuberância translúcida menor com limite pigmentado (Figura 1B).</li>
	<li>Coloque pinças curvas ao redor do globo ocular e aperte para libertar o olho de anexos estranhos. Isso minimizará o sangramento no olho do tecido circundante.</li>
	<li>Substitua a pinça curva por microtesouras de mola e corte ao redor do globo ocular com a terceira pálpebra presa a ela. Use pequenos cortes contínuos para liberar o globo ocular dos anexos de tecido circundantes.</li>
	<li>Coloque microtesouras de mola curvas sob o globo ocular para liberar o olho cortando o nervo óptico. Certifique-se de que o globo ocular esteja completamente liberado da cavidade ocular.</li>
</ol>3. Limpeza do tecido estranho
<ol><li>Coloque o olho enucleado do rato eutanasiado numa placa de Petri com tampão salino tamponada com fosfato (PBS) a pH 7,4, com a placa de Petri preenchida de tal forma que o globo ocular fique submerso em PBS.</li>
	<li>Imobilize o globo ocular enucleado do rato com a terceira pálpebra anexada com uma mão usando fórceps.</li>
	<li>Suspenda o globo ocular em meio líquido para permitir um manuseio mais eficiente. Alguns músculos ou tecidos extraoculares começarão a flutuar para longe do globo ocular. Removê-los, cortando-os do globo ocular usando micro-tesouras de mola.</li>
	<li>Corte e remova o nervo óptico da base do globo ocular usando microtesouras para permitir a melhor separação da retina para preparações de montagem completa. NOTA: Não é necessário remover o nervo óptico para a secção do tecido.</li>
	<li>Lave o globo ocular com PBS e transfira-o para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% por um período mínimo de 2 h a 4 °C para fixação tecidual. NOTA: O procedimento pode ser pausado nesta etapa, deixando o tecido em PFA por até 12 h a 4 °C. No entanto, para o isolamento de células vivas, as etapas de fixação não devem ser realizadas e todo o procedimento precisa ser realizado sem pausas.</li>
</ol>4. Dissecção do olho enucleado para obtenção dos óculos anterior e posterior
<ol><li>Após a fixação do PFA (se coletar células vivas, prossiga sem a fixação do globo ocular), transfira o globo ocular para uma placa de Petri contendo PBS e coloque-o sob um microscópio de dissecação para realizar o procedimento subsequente.</li>
	<li>Imobilize o globo ocular segurando a terceira pálpebra firmemente com pinça de sutura de Colibri.</li>
	<li>Faça uma pequena incisão no limbo, perfurando-o usando uma micro-lâmina. O limbo é a junção córnea-escleral. Faça a incisão de preferência oposta à terceira pálpebra, fazendo assim um ponto de acesso para a microtesoura da mola. NOTA: O uso de uma microlâmina de 15° e 3 mm de tamanho pode proporcionar um melhor controle sobre a profundidade desta incisão.</li>
	<li>Em seguida, usando esta incisão como ponto de partida, com um par de micro-tesouras, faça pequenos e contínuos cortes ao longo da circunferência do limbo córnea-escleral. Primeiro, complete um semicírculo de cortes a partir do ponto de incisão até a terceira pálpebra. Em seguida, complete o semicírculo restante de cortes do outro lado. Finalmente, faça um corte ao redor da terceira pálpebra para separar o copo posterior e o copo anterior. NOTA: Dependendo do óculo de interesse, a membrana nictitante pode ser deixada ligada ao óculo anterior ou posterior.</li>
	<li>Remova a lente do copo posterior usando fórceps para obter o copo posterior que compreende as camadas de retina neural e epitélio pigmentar da retina (PSE). O cristalino, o copo posterior e o copo anterior do olho são, portanto, separados. NOTA: Se trabalhar com tecidos não fixos, os copos anterior e posterior podem agora ser digeridos enzimaticamente para obter uma suspensão unicelular da córnea ou da retina.</li>
	<li>Para fixar os tecidos, transfira esses copos para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PFA a 4% por 12 h a 4 °C. NOTA: Após a fixação, o tecido pode ser incorporado em um meio apropriado, e a criosecção ou a secção de parafina podem ser feitas para obter seções da córnea ou da retina.</li>
</ol>5. Isolamento das camadas neurais da retina e do EPR
<ol><li>Reintroduza o copo posterior na placa de Petri contendo tampão PBS para submergir o tecido.</li>
	<li>Verifique a presença da retina neural. Isso pode ser visualizado como uma camada opaca na camada de PSE pigmentada, que é anexada na circunferência periférica do copo.</li>
	<li>Segure a terceira pálpebra com fórceps para imobilizar o copo posterior e retire a retina neural a partir da periferia usando um segundo par de fórceps. NOTA: Movimentos muito suaves e leves da mão são altamente recomendados para não danificar o tecido. Na saída do nervo óptico, a tesoura de mola curva pode ser inserida sob a retina neural, e um corte pode ser feito para liberar completamente as camadas se a retina neural permanecer presa, conforme ilustrado na Figura 3. Opcionalmente, libere ou descole a retina com traços suaves usando uma escova macia. No entanto, não seria apropriado fazê-lo se coletasse a retina para histologia. NOTA: A retina neural e a camada de EPR pigmentada com a terceira pálpebra são, assim, obtidas.</li>
</ol>6. Segmentação das camadas retiniana e PSE para montagens inteiras
<ol><li>Reintroduza os copos anterior e posterior na placa de Petri contendo tampão PBS e coloque o prato sob o microscópio de dissecação.</li>
	<li>Imobilize o copo anterior segurando a terceira pálpebra.</li>
	<li>Use microtesouras de mola angulada para fazer um corte de cerca de 3/4 do diâmetro do copo ao lado da terceira pálpebra, cortando da periferia perpendicularmente em direção ao centro óptico.</li>
	<li>Mantenha um aperto na terceira pálpebra e faça um corte ao lado do primeiro corte.</li>
	<li>Faça um corte semelhante entre o segundo corte e a terceira pálpebra. NOTA: Três ou quatro desses cortes equidistantes abrem os copos hemisféricos em forma de flor, que cai plana e pode ser facilmente montada.</li>
	<li>Imobilize o copo posterior segurando a terceira pálpebra.</li>
	<li>Siga os mesmos passos dados para fazer os cortes (passos 6,3-6,5) no copo anterior para fazer três ou quatro cortes equidistantes no copo posterior. NOTA: Para a histologia da retina neural isolada na etapa 5, faça cortes semelhantes para garantir que ela caia plana em uma superfície. Não faça cortes muito profundos no centro do copo, pois isso pode fazer com que as seções das folhas se desintegrem ou se separem facilmente.</li>
	<li>Realizar a coloração e montar os tecidos na íntegra para uma visualização eficaz 7,8. NOTA: A presença da membrana nictitante atua como um indicador físico constante do lado nasal do óculo em todo o corpo. Ajuda a demarcar o lado dorsal/ventral do copo do olho, pois a terceira pálpebra do copo indica a orientação nasal/ventral.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cancer+immunotherapy+using+patient-derived+xenografts+%28PDXs%29+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice.</a> Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li>
<li>Sutherland, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection+of+Highly+Pure+Trabecular+Meshwork+from+Mouse+Eyes+for+Gene+Expression+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis.</a> J Vis Exp. (136), e57576(2018).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+from+the+mouse+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e56997(2018).</li>
<li>Claybon, A., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+mouse+eye+for+a+whole+mount+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of a mouse eye for a whole mount of the retinal pigment epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2563(2011).</li>
<li>Steven, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+induction+and+three-dimensional+two-photon+imaging+of+conjunctiva-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Experimental induction and three-dimensional two-photon imaging of conjunctiva-associated lymphoid tissue.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (4), 1512-1517 (2008).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50546(2013).</li>
<li>Ullmann, J. F., Moore, B. A., Temple, S. E., Fernandez-Juricic, E., Collin, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+wholemount+technique%3A+A+window+to+understanding+the+brain+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The retinal wholemount technique: A window to understanding the brain and behaviour.</a> Brain, Behavior and Evolution. 79 (1), 26-44 (2012).</li>
<li>Nakao, S., Hafezi-Moghadam, A., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatics+and+lymphangiogenesis+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphatics and lymphangiogenesis in the eye.</a> Journal of Ophthalmology. 2012, 783163(2012).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood-derived+monocytes+show+neuronal+properties+and+integration+in+immune-deficient+rd1+mouse+model+upon+phenotypic+differentiation+and+induction+with+retinal+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood-derived monocytes show neuronal properties and integration in immune-deficient rd1 mouse model upon phenotypic differentiation and induction with retinal growth factors.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 412(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A microdissecção ocular tem sido considerada uma tarefa difícil devido ao pequeno tamanho e forma esférica do olho do roedor, e o olho do roedor requer técnicas inovadoras para o manuseio eficiente8. 
No método demonstrado atualmente, o globo ocular de rato enucleado é obtido com a terceira pálpebra presa para um manuseio eficaz e fácil. Usando a terceira pálpebra, o globo ocular pode ser imobilizado completamente, o que permite que a dissecção prossiga com facilidade e...

A dissecção ocular é uma técnica importante na pesquisa oftálmica e tem permitido que os investigadores acessem os segmentos do olho para estudos direcionados. Anteriormente, os pesquisadores oculares confiavam no tecido ocular de indivíduos doentes para seus estudos. No entanto, o número progressivamente crescente de cepas de roedores oftálmicos modelos1 ao longo dos anos diminuiu a necessidade de tecido ocular humano. Essas cepas de camundongos permitiram uma compreensão mais profunda das doenças oculares e intervenções. No entanto, eles também geraram a necessidade de técnicas inovadoras de microdissecção ocular. O pequeno tamanho e a área limitada de operação restringem severamente o acesso efetivo às subpartes oculares. Além disso, devido à montagem celular homogênea dos copos oculares posterior e anterior, é difícil realizar intervenções direcionadas pós-dissecção. As técnicas atuais de microdissecção do laser2 e da microdissecção cirúrgica 3,4 são inadequadas para atender a tais exigências da pesquisa ocular. A microdissecção a laser é muito eficaz na análise de célula única, mas o tecido específico precisa ser microdissecado antes do procedimento a laser2. A técnica pode isolar pequenas regiões de interesse de um tecido pré-dissecado para análise molecular. Assim, a técnica não é adequada para a preparação de montagens inteiras ou para o isolamento de camadas oculares axialmente compactadas para uma visualização ideal.
O método cirúrgico é a técnica mais utilizada; este método envolve imobilizar o olho através do nervo óptico5 e, em seguida, realizar a dissecção. Esta prática é árdua e pode danificar qualquer tecido frágil, pois o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica para isolar as várias seções das camadas da retina, a técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção.
Durante a dissecção, a manutenção da presença da membrana nictitante aderida ou da terceira pálpebra (Figura 1) apresenta vantagens únicas e significativas. Neste método, primeiro, o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra. Em seguida, a terceira pálpebra é utilizada para imobilizar o olho6 (Figura 2A). Segue-se a perfuração do globo ocular através do limbo corneano e a incisão como ponto de entrada (Figura 2B,C). Em seguida, os óculos são separados por corte ao longo da circunferência anterior e posteriormente (Figura 2D-G). Ao dissecar ainda mais o óculo posterior, a camada translúcida da retina neural pode ser identificada e suavemente descascada. Em seguida, são feitos três ou quatro cortes equidistantes nos copos hemisféricos anterior e posterior obtidos, que permitem que esses copos em forma de flor caiam sobre uma lâmina (Figura 2H).
A terceira pálpebra auxilia no manuseio fácil e eficiente durante a dissecção, garantindo assim danos mínimos ao tecido ao acessar as várias camadas oculares e ao produzir montagens inteiras. Além disso, a presença da terceira pálpebra ajuda a localizar e examinar intervenções localizadas durante a visualização.
O procedimento, em nosso laboratório, foi realizado em uma cepa de camundongo CBA/J ou rd1 em P28 de qualquer sexo. O procedimento pode ser realizado em qualquer cepa, idade ou sexo do animal e não tem viés de acordo com essas características.
Os animais foram adquiridos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos no Small Animal Facility (SAF) do Instituto Nacional de Imunologia (NII). Eles foram mantidos em gaiolas ventiladas individuais (VCI) e receberam acesso ad libitum a água e alimentos autoclavados acidificados. Foram mantidos a 21-23 °C e com ciclo claro/escuro de 14 h/10 h.
Dado abaixo é um método cirúrgico modificado para a micro-dissecção de um olho de rato.

<table><tbody><tr><td>Paracetamol (Biocetamol)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>Sem número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Kit de fosfatase alcalina (DEA)</td><td>Coral Clinical System, Índia</td><td></td><td>Sem número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Analisador automatizado</td><td>Tulip, Alto Santracruz, Índia</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Analisador bioquímico para teste funcional do fígado</td></tr><tr><td>Betadine ( Solução de Povidon-Iodo)</td><td>Win-Medicare; &nbsp; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (Aquisição Local)</td></tr> <tr><td>Gabinete de segurança biológica (Classe I)</td> <td>Kartos internacional; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr> <tr><td>Microscópio de campo brilhante</td><td>Olympus, Japão</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos consanguíneos CBA / J</td><td>O Jackson Laboratory</td><td>Stock No. 000654</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxima (Taxim)</td> <td>AlKem ; Injeção de</td><td>sódio de cefotaxima na Índia, sem número de catálogo específico (aquisição local)</td> Cell Strainer Sigma ;<td></td></tr><tr><td></td><td> US</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo I</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr> <tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma ; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Folha de cortina</td><td>JSD Surgicals, Delhi, Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (Aquisição Local)</td></tr> <tr><td>Solução de Eosina Y, Sigma alcoólico</td><td>; Fórceps de HT110132</td><td></td><td></td>dos EUA</tr><tr><td></td><td>Principais Cirúrgicos; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia a gás</td><td>Ugo Basile; Itália</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Himedia, Índia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório (Veet)</td><td>Reckitt Benckiser, Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina, Mayer's</td><td>Sigma ; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódico</td><td>Himedia; Índia</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase de testículos de ovelhas</td><td>Sigma ; US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Cânula IV (Plusflon)</td> <td>Mediplus, Índia</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de Insulina</td><td>BD; US</td><td>REF 303060</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (Forano)</td> <td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>Inalação Anestésico</td></tr><tr><td>Cetamina (Ketamax)</td> <td>Troikaa Pharmaceuticals Ltd.</td><td></td><td>Cloridrato de cetamina IP, sem número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Meloxicam (Melonex)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Micro porta-agulhas reta e curva</td><td>Mércia; &nbsp; Inglaterra</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Micro porta-agulhas reta & curvo</td><td>Mérciano ; &nbsp; Inglaterra</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-Line Laboratories, Itália</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Fio de Nylon</td><td>Poderoso ; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Himedia; Índia</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Tears/Eyemist Gel</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, Índia</td><td>P3060</td><td>Nenhum número de catálogo específico</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Major Surgicals; Índia</td><td></td><td>Sem número de catálogo específico (Aquisição Local)</td></tr><tr><td>Tesouras</td><td>Major Surgicals; Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Índia</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ; US</td><td></td><td>Nenhum número de catálogo específico</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma ; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina Cirúrgica No. 22</td><td>La Medcare, Índia</td><td></td><td>Sem Número de Catálogo específico (Aquisição Local)</td></tr><tr><td>Placa Cirúrgica</td><td>Feita</td><td></td> Localmente <td>Sem Número de Catálogo específico (Aquisição Local)</td></tr><tr><td>Fita Cirúrgica Branca</td><td>3M Índia ; Índia</td><td>1530-1</td> Suturas de <td>fita cirúrgica micropore</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, Índia</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>Seringas (1ml, 26 G)</td><td>Dispo Van; Índia</td><td></td><td>Sem número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>Aparador (aparador)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de pesagem</td><td>Braun</td><td></td><td>Sem número de catálogo específico (aquisição local)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; Índia</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>xilazina (xilaxina)</td> <td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td><td>Sedativo, pré-anestésico, analgésico e relaxante muscular</td></tr></tbody></table>

microdissecção do olho de roedores

Microdissection of the Rodent Eye

A microdissecção ocular do olho de roedor envolve a segmentação do globo ocular enucleado com a membrana nictitante anexada, ou terceira pálpebra, para obter os óculos anterior e posterior. Com esta técnica, as subpartes do olho, incluindo o tecido da córnea, tecido neural, tecido epitelial pigmentar da retina (PSE) e lente, podem ser obtidas para montagens inteiras, crio-seccionamento e / ou suspensões unicelulares de um tecido ocular específico. A presença da terceira pálpebra apresenta vantagens únicas e significativas, pois beneficia a manutenção da orientação do olho, o que é importante para a compreensão da fisiologia ocular após qualquer intervenção localizada ou em estudos envolvendo análise ocular relacionada à topografia espacial do olho.
Neste método, enucleamos o globo ocular na órbita juntamente com a terceira pálpebra, cortando cuidadosa e lentamente os músculos extraoculares e cortando o nervo óptico. O globo ocular foi perfurado através do limbo corneano usando uma microlâmina. A incisão foi utilizada como ponto de entrada, permitindo o corte ao longo da junção córnea-escleral por meio da inserção de microtesouras através do ponto de incisão. Pequenos e contínuos cortes ao longo da circunferência foram feitos até que os copos se separassem. Estes poderiam ser ainda mais dissecados descascando suavemente a camada translúcida da retina neural usando pinça de sutura de Colibri para obter as camadas de retina neural e RPE. Além disso, três/quatro cortes equidistantes foram feitos da periferia perpendicularmente ao centro óptico até que o nervo óptico fosse atingido. Isso abriu os copos hemisféricos em forma de flor para que eles caíssem e pudessem ser facilmente montados. Esta técnica tem sido usada em nosso laboratório para montagens inteiras da córnea e seções da retina. A presença da terceira pálpebra delineia a orientação nasal-temporal, o que permite o estudo de diversas intervenções de terapia celular pós-transplante e, assim, a validação fisiológica direcionada vital para visualização e representação precisa em tais estudos.

Uma montagem inteira de tecido olho/córnea de camundongo rd1 foi preparada para estudar a potencial linfangiogênese no tecido anterior/corneano em um estado doente. O tecido conjuntival aderido da terceira pálpebra atuou como um controle positivo, uma vez que a córnea carece de vasos linfáticos. Para o estudo, o tecido corneano foi dissecado com a conjuntiva e fixado com PFA a 4%, seguido de permeabilização e bloqueio. O tecido foi então corado com um anticorpo primário contra o marcador endotelial linfático (LYVE1)<sup ...

Este trabalho apresenta um protocolo para microdissecção ocular em roedores. O processo envolve a enucleação do globo ocular junto com a membrana nictitante (ou seja, a terceira pálpebra). Isto é seguido pela separação dos copos oculares posterior e anterior.

Microdissecção do olho de roedores

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...

A pesquisa ocular nos primeiros tempos dependia principalmente do tecido ocular de indivíduos falecidos. No entanto, ao longo dos anos, muitos modelos oftálmicos de roedores foram desenvolvidos e a necessidade de tecido ocular humano diminuiu. Devido ao pequeno tamanho e à área limitada de operações no olho do roedor, o acesso efetivo às subpartes oculares é severamente restrito.Normalmente, para operar o olho de um roedor, o olho é imobilizado através do nervo óptico e a dissecção é realizada. Esta prática é árdua e pode danificar o tecido frágil à medida que o olho esférico continua a se mover durante a dissecção. Apesar de ser benéfica no isolamento das várias seções das camadas da retina, esta técnica não pode demarcar a orientação espacial do tecido após a dissecção do tecido.Além disso, uma intervenção direcionada é difícil de localizar após a dissecção devido à montagem celular homogênea do copo ocular posterior e anterior. Neste vídeo, um método cirúrgico modificado para microdissecção é demonstrado. A presença da membrana nictitante anexada, ou a terceira pálpebra, apresenta vantagens únicas e significativas.Neste método, primeiro o globo ocular é enucleado com a terceira pálpebra, em seguida, a terceira pálpebra é usada para imobilizar o olho. É seguido por piercing do globo ocular através do limbo da córnea, e a incisão é usada como ponto de entrada. Em seguida, cortando ao longo da circunferência, os copos oculares anterior e posterior são separados.Ao dissecar ainda mais o copo ocular posterior, a camada translúcida da retina neural é identificada e suavemente descascada. As camadas neurais e RPE são assim obtidas para processamento posterior. A terceira pálpebra nos permitirá demarcar a orientação espacial do olho pós-enucleação.Vamos agora seguir o procedimento passo-a-passo detalhado. Dilate os olhos dos roedores usando uma gota de soluções oftálmicas de 0,8% de tropicamida e 5% de fenilefrina e coloque o animal em uma área escura por 30 minutos antes do procedimento. Eutanasiar o animal administrando por via intraperitoneal cinco vezes doses de anestesia.Uma dose típica é de 200 microlitros PBS contendo 10 mg de cetamina e um mg de xilazina. Confirme a completa falta de resposta ao estímulo examinando o reflexo do pedal. Coloque o rato em decúbito lateral para permitir o acesso completo ao olho.Mantenha uma pinça de sutura Colibri, uma pinça curva, uma microlâmina de 15 graus de tamanho de três milímetros, microtesoura de mola e uma microtesoura de mola angular pronta para o procedimento. Coloque uma pinça curva ao redor do globo ocular e aperte para libertar o olho de anexos estranhos. A terceira pálpebra, também conhecida como membrana nictitante, está localizada no canto superior da tangente nasal e pode ser identificada como uma protuberância translúcida menor com limites pigmentados.Em seguida, use uma microtesoura de mola e corte ao redor do globo ocular. Cortes pequenos e contínuos liberam o globo ocular dos anexos esclerais. Coloque uma microtesoura de mola curva sob o globo ocular para liberar o olho, cortando o nervo óptico.Coloque o olho enucleado em uma placa de Petri contendo tampão PBS de tal forma que o globo ocular esteja submerso em PBS. Alguns músculos ou tecidos extraoculares começarão a flutuar para longe do globo ocular. Removê-los, cortando-os do globo ocular usando micro-tesouras de mola.Em seguida, remova o nervo óptico da base do globo ocular para permitir uma melhor separação da retina para preparações completas. Não é necessário remover o nervo óptico para a secção do tecido. Transfira o globo ocular para um tubo de 1,5 ml contendo um ml de paraformaldeído a 4% ou PFA.Mantenha-o por duas horas a quatro graus Celsius para fixação do tecido. É possível fazer uma pausa nesta etapa, deixando o tecido em PFA por até 12 horas a quatro graus Celsius. No entanto, para o isolamento de células vivas, as etapas de fixação não devem ser realizadas e todo o procedimento precisa ser realizado em contínuo.Após a fixação do PFA, transfira o globo ocular para uma placa de Petri contendo PBS e coloque-o sob um microscópio de dissecação para realizar o procedimento subsequente. Imobilize o globo ocular segurando a terceira pálpebra firmemente com pinça de sutura de Colibri. O limbo é a junção escleral da córnea.Faça uma pequena incisão no limbo, perfurando-o usando uma microlâmina. A incisão é feita preferencialmente oposta à terceira pálpebra. Em seguida, usando esta incisão como ponto de partida, com a microtesoura fazer pequenos e contínuos cortes ao longo desta circunferência do limbo escleral corneano.Primeiro, complete um semicírculo de cortes a partir do ponto de incisão até a terceira pálpebra. Em seguida, complete o semicírculo restante de cortes do outro lado. Finalmente, faça um corte ao redor da terceira pálpebra para separar o copo posterior e o anterior.Remova o cristalino do copo posterior usando fórceps para obter o copo posterior composto pela retina neural e camada de EPR e o copo anterior da córnea. Se trabalhar com tecidos não fixos, os copos anterior e posterior agora podem ser digeridos enzimaticamente para obter suspensão unicelular da córnea ou da retina. Para fixar os tecidos, transfira esses copos para um tubo de 1,5 ml contendo 1 ml de PFA a 4% por 12 horas a quatro graus Celsius.Após a fixação, o tecido pode ser incorporado em meio apropriado e criossecção ou seccionamento de parafina pode ser feito para obter cortes de córnea ou retina. Reintroduza o copo posterior na placa de Petri contendo tampão PBS. Uma camada opaca na camada de PSE pigmentada é a retina neural.Descasque a retina neural usando uma segunda pinça. Um movimento muito suave e leve da mão é altamente recomendado para não danificar o tecido. Na saída do nervo óptico, a tesoura de mola curva pode ser inserida sob a retina neural, e um corte pode ser feito para liberar completamente as camadas se a retina neural permanecer ligada.A retina também pode ser liberada ou destacada, acariciando-a suavemente com uma escova macia. Reintroduzir os copos anterior e posterior na placa de Petri contendo tampão PBS. Use uma mola angular micro-tesoura para fazer um corte ao lado da terceira pálpebra da periferia perpendicularmente em direção ao centro óptico.Mantenha um aperto da terceira pálpebra e faça um corte ao lado do primeiro corte. Faça um corte semelhante entre o segundo corte e a terceira pálpebra. Três ou quatro desses cortes equidistantes abrem os copos hemisféricos em forma de flor, que cai plana e pode ser facilmente montada.Não faça cortes muito profundos até o centro do copo, pois isso pode fazer com que as seções das folhas se desintegrem ou se separem facilmente. O meio líquido permite que o copo do olho anterior atinja uma estrutura curva. Siga os mesmos passos dados para fazer cortes no copo posterior para fazer três ou quatro cortes equidistantes no copo anterior.Os tecidos estão agora prontos para novas colorações. Nesta figura, todo o monte de copo anterior é mostrado. O tecido corneano foi microdissecado conforme descrito para revelar os vasos linfáticos no tecido conjuntival anexado do folheto corneano.Nesta figura, todo o monte de retina neural é mostrado. A vasculatura retiniana da retina neural foi corada com isopectina e é visível como vasos verdes. Neste método, o globo ocular enucleado dos ratos é obtido com a terceira pálpebra anexada para um manuseio eficaz e fácil.A terceira pálpebra imobiliza completamente o globo ocular e permite que a dissecção prossiga com facilidade e erros mínimos. Este método é vantajoso para seccionamento específico de tecido ocular, análise de célula única e montagens inteiras. No entanto, a necessidade de fixação tecidual repetitiva torna o tecido inviável para a cultura de células ou tais necessidades de células vivas.Assim, o procedimento precisa ser realizado em continuum para o isolamento de células vivas.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Uma demonstração formal da dissecação de um olho de rato, resultando em uma montagem de todo o epitélio pigmentar da retina.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

A técnica de dissecção ilustra enucleação do olho do rato para fixação do tecido para realizar fenotipagem em alto rendimento telas.

Enucleação Rato Olho para fenotipagem de alta capacidade remota

Este relatório descreve métodos detalhados para preparar seções congeladas do retina do rato para immunohistochemistry (IHC).  Os métodos descritos incluem dissecção do copo posterior ocular, fixação paraformaldeído, incorporação em meios de temperatura de corte ideal (OCT) e orientação tecidual, corte e imunocoloração.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Este manuscrito apresenta um protocolo para a preparação histológica de lâminas de globos oculares de roedores. Com o método proposto, a retina interna pode ser facilmente visualizada e avaliada ao microscópio óptico. O procedimento é apresentado para os globos oculares de camundongos e ratos.

Preparação e análise de lâminas histológicas de globos oculares de ratos e camundongos para avaliação da retina

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Este protocolo descreve o procedimento para isolar a retina de camundongo de montagem inteira e realizar imunocoloração para marcar todas as células ganglionares da retina (RGCs). O processo é seguido por imagens e contagem automática de RGCs usando software baseado em IA, fornecendo um método simples, rápido e preciso para quantificar RGCs em toda a retina do camundongo.

Imunocoloração de montagem total e contagem automática de células ganglionares da retina de camundongos

Um protocolo para preparar criossecções de retina de camundongos e realizar imunocoloração em fotorreceptores é descrito. Este artigo permite que os pesquisadores produzam consistentemente seções congeladas de retina de camundongos com morfologia bem preservada e resultados de imunocoloração de alta qualidade.

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda microdissecção ocular em roedores para pesquisa oftalmológica usando um protocolo refinado com terceira pálpebra. Este método melhora o acesso às subpartes oculares e minimiza danos aos tecidos frágeis.

Microdissecção do olho de roedores

Explorar mais vídeos