Name: Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a usar microscopia de folha de luz para imaginar a cóclea inteira sem destruição mecânica. Este método permite avaliar alterações patológicas, como perda de neurônios ganglionares espirais em modelos de envelhecimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação dos Institutos Nacionais de Saúde, da Fundação Kellogg e doações privadas de Bridget Sperl e John McCormick. O TSLIM foi desenvolvido com a excelente assistência de Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg e Julian Wuester da Universidade Técnica de Illmenau, Alemanha, sob supervisão de seus mentores (Stefan Sinzinger e Rene Theska) e James Leger.

Todos os procedimentos e o uso de animais vivos foram revisados e aprovados (ID do Protocolo #2010-38573A) pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade de Minnesota (IACUC) e os pesquisadores que usam esses animais foram exaustivamente treinados e testados pelos Veterinários de Recursos Animais de Pesquisa (RAR) antes de terem acesso às instalações para animais. Camundongos machos e fêmeas foram utilizados neste estudo.
1. Remoção da cóclea para fixação e processamento tecidual para aquisição de imagens
<ol><li>Eutanásia de camundongos usando inalação de CO2 . Decapitar o camundongo com tesoura e fazer uma incisão dorso-ventral através do cérebro para hemissectar o crânio. Remova o cérebro, identifique a bula redonda na parte baso-ventral do crânio, abra a bula com rongeurs e visualize e remova a cóclea.</li>
	<li>Fixação: Realizar este procedimento sob exaustor e com microscópio de dissecção em aumento de 5x. Use luvas e roupas de proteção. Punture a janela oval e remova o estribo com uma picareta afiada. Insira um palito na janela redonda para perfurar a membrana.</li>
	<li>Cubra a janela redonda aberta com a ponta cortada de um conjunto de perfusão ligado a uma seringa de 1 ml preenchida com 2 ml de formalina. Infundir lentamente formalina através dos espaços perilinfáticos da cóclea durante um período de 2 minutos, observando que a formalina está saindo da cóclea através da janela oval aberta. Corte o excesso de tecido da cóclea e mergulhe em um frasco contendo 10% de formalina e coloque em um rotador durante a noite.</li>
	<li>Descalcificação: Enxaguar a cóclea em PBS 3x por 5 min cada e imergir em frasco contendo solução a 10% de ácido etilenodiaminotetracético dissódico (EDTA) com rotação por 4 dias, trocando a solução diariamente.</li>
	<li>Desidratação: Perfundir a cóclea com PBS 3x e imergir por 15 min entre as trocas. Desidratar a cóclea com concentrações crescentes de etanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; por 30 min em cada concentração. NOTA: É importante remover todo o EDTA antes da desidratação, pois o EDTA precipita em etanol. Além disso, as cócleas podem ser deixadas em qualquer concentração de etanol superior a 70% durante a noite.</li>
	<li>Coloração: Manchar toda a cóclea por imersão em uma solução de isotiocinato de Rodamina B (5 μg/mL em etanol 100%) durante a noite com rotação. Retirar o excesso de corante da cóclea com duas trocas de etanol 100%, 5 min cada troca.</li>
	<li>Clearing: Transferir a cóclea corada para duas trocas de solução de Spalteholz12 (salicilato de metilo 5:3:3:benzoato de benzila), 30 min cada troca e deixar durante a noite na solução de limpeza com rotação. As cócleas podem ser deixadas em solução de Spalteholz indefinidamente.</li>
</ol>2. Imagem das cócleas
<ol><li>Fixar as cócleas a uma haste de espécime na extremidade da membrana da janela oval e redonda para que a solução de clareamento permaneça dentro da cóclea e não se formem bolhas (Figura 2). Deve-se tomar cuidado para não deixar bolhas se formarem dentro da cóclea, pois são difíceis de remover e, se deixadas no tecido, causarão artefatos de imagem.</li>
	<li>Utilizar cola ativadora de UV para fixar a cóclea úmida à haste seca da amostra (Figura 2). Fixe a cóclea nas extremidades oval e redonda da janela. Cure a cola UV por 10 s movendo-se ao redor da cóclea com a luz UV. NOTA: Uma fixação solta da cóclea à haste da amostra resultará em defeitos de imagem. Esta haste é fabricada especificamente para este protocolo (ver Santi et al.8 para detalhes) e é específica para o nosso microscópio de folha de luz.</li>
	<li>Suspender a cóclea na câmara de imagem preenchida com solução de Spalteholz para aquisição de imagens. A câmara do espécime é uma célula de fluorômetro de quartzo opticamente transparente (Vídeo 1).</li>
	<li>Fixe a haste da amostra a um suporte rotativo que também está ligado ao estágio de translação XZ. A maioria das pilhas é obtida traduzindo o espécime nos planos XZ, mas pilhas rotacionais também podem ser obtidas.</li>
	<li>Secção óptica TSLIM: Use um laser azul ou verde para excitação, dependendo do tipo de coloração de fluorocromo. Posicione a folha de luz no meio do tecido para focalização e determine a ampliação que será usada para iluminar toda a largura da cóclea. Em seguida, use um programa personalizado para mover o espécime através da folha de luz através do espécime no eixo X (costurando a imagem) e em passos Z para fazer uma pilha de imagens 2D em toda a cóclea.</li>
	<li>Para a primeira imagem, a cintura do feixe da folha de luz é posicionada na borda do espécime e o programa varre toda a largura do espécime coletando colunas de dados (ver costura da imagem; Santi et al.8) que são a largura do parâmetro confocal (Figura 3) para produzir uma imagem 2D composta de máxima resolução em toda a largura do espécime. O programa automatiza a costura de imagens para cada passo Z até que o espécime seja completamente fotografado.</li>
	<li>Processamento de imagem: Transfira a pilha de imagens para outro computador e carregue-a em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O corte óptico por microscopia óptica para exame das estruturas cocleares não é mecanicamente destrutivo como outros métodos histológicos mais tradicionais, e fornece uma visão digital completa das estruturas cocleares em relação umas às outras. Métodos anteriores, como preparações superficiais do órgão deCorti14 , forneceram um mapa da perda de células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar, mas a perda de SGN não pôde ser avaliada, uma vez que o tecido havia sido dissecado para rev...

A cóclea é o órgão sensorial periférico para a audição em mamíferos. Tem uma anatomia espiral complexa de células sensoriais e de suporte repetidas que são anatomicamente especializadas para detectar vibrações sonoras e transmiti-las ao cérebro para a percepção da audição. Os principais elementos sensoriais são as células ciliadas internas e externas e suas fibras nervosas inervantes, cujos corpos celulares compõem o gânglio espiral, que reside dentro do canal de Rosenthal (Figura 1). Essas estruturas sensoriais e neurais são dispostas tonotopicamente de tal forma que sons de alta frequência são transduzidos na base da cóclea e sons de baixa frequência são transduzidos no ápice da cóclea2. Um mapa anatômico da distribuição dessas células sensoriais ao longo do comprimento espiral da membrana basilar de suporte é chamado de citococleograma3 e pode ser comparado com a perda auditiva em função da frequência retratada em um audiograma.
O labirinto membranoso da cóclea, que é circundado por osso denso, torna tecnicamente difícil examinar mais de uma estrutura coclear ao mesmo tempo. Portanto, a justificativa para o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz é produzir cortes seriados bem alinhados da cóclea completa para que todas as estruturas cocleares possam ser examinadas em relação umas às outras em reconstruções 3D. Voie et al.4 e Voie e Spelman5 projetaram o primeiro microscópio de folha de luz, chamado microscópio de corte óptico de fluorescência no plano ortogonal (OPFOS), para seccionar opticamente toda a cóclea. No entanto, este microscópio nunca foi desenvolvido comercialmente; assim, nosso objetivo foi construir um microscópio de folha de luz chamado microscópio de imagem a laser de folha fina (TSLIM; Gráfico 2). Os detalhes de projeto e construção do TSLIM foram publicados anteriormente8. TSLIM fez várias melhorias sobre o OPFOS, incluindo o uso de uma câmera digital de baixa luz versus uma câmera CCD para coleta de imagens, microposicionadores codificados opticamente para movimento preciso e reprodutível do espécime através da folha de luz, uso de uma câmara de amostra opticamente clara disponível comercialmente e coloração de rodamina em etanol em vez de na solução de limpeza para evitar a precipitação de manchas dentro do tecido. O desenvolvimento comercial de microscópios fotográficos, como o SPIM6, tem se concentrado em imagens de alta resolução de espécimes vivos e transparentes pequenos, mas não são adequados para imagens cocleares inteiras por não terem distância de trabalho adequada. Uma revisão do desenvolvimento de outros microscópios de folha de luz foi publicada por Santi7. A principal vantagem do TSLIM sobre outros métodos histológicos para examinar a cóclea é a secção óptica dos tecidos para reconstrução 3D, preservando a integridade do espécime para que possa ser usado por outros métodos histológicos. Outra vantagem da imagem TSLIM é que apenas uma fina folha de luz produzida por um laser é exposta ao tecido, em comparação com a exposição de toda a espessura do tecido ao laser como na microscopia confocal. A limpeza do tecido para minimizar a dispersão da luz e o fato de que apenas uma pequena porção do tecido é exposta ao laser resulta em mínimo desbotamento de fluorocromo (fotoclareamento) com imagens a laser de folha de luz. No entanto, o processo de fixação, desidratação e clareamento altera a morfologia das estruturas cocleares e resulta em encolhimento do tecido em comparação com o tecido vivo. A quantidade real de encolhimento tecidual que ocorre não foi determinada.
O TSLIM foi desenvolvido por Shane Johnson e oito estudantes alemães de engenharia óptica (ver Agradecimentos). Os detalhes de construção do TSLIM foram fornecidos por Santi et al.8 e uma versão de varredura (sTSLIM) por Schröter et al.9. O TSLIM funciona como um micrótomo não destrutivo para seccionar opticamente espécimes e como um microscópio para coletar cortes seriados 2D através de toda a largura e espessura da cóclea. O TSLIM pode obter imagens de espécimes pequenos (mm) e grandes (cm) espécimes espessos. As lentes são montadas a ar para permitir longas distâncias de trabalho com objetivas de coleta de 1x e 2x em um microscópio de dissecção. O microscópio de dissecção também possui zoom óptico que permite ao TSLIM resolver estruturas subcelulares e sinápticas nas células. O TSLIM é equipado com um laser azul (473 nm) e verde (532 nm) para iluminação que permite que uma variedade de sondas fluorescentes sejam usadas para geração de imagens. O objetivo do TSLIM é produzir cortes ópticos 2D bem alinhados através de toda a cóclea para uma reconstrução digital completa dos tecidos cocleares. Por ser um método fluorescente, ligantes e imunohistoquímica também podem ser utilizados para identificar estruturas cocleares específicas.
Inicialmente, uma lente cilíndrica foi usada para produzir duas folhas de luz Gaussiana opostas, mas produziu artefatos de imagem de absorção. Devido ao trabalho de Keller et al.10, a lente cilíndrica fixa foi substituída por um espelho galvanômetro de varredura para produzir a folha de luz9. Além disso, como o centro da folha de luz é o mais fino na cintura do feixe, as imagens sTSLIM 2D são produzidas coletando uma composição de colunas de dados do eixo X em toda a largura do espécime (Figura 3). Esse método foi descrito pela primeira vez por Buytaert e Dircks11. O software personalizado TSLIM para conduzir e coletar imagens foi desenvolvido usando um programa gráfico para controle de instrumentos. A folha de luz viaja através do espécime e ilumina um plano fluorescente dentro do tecido. Este plano fluorescente é projetado ortogonalmente através do espécime transparente e é coletado por um microscópio de dissecção. Microposicionadores codificados opticamente permitem varrer através da cintura do feixe no eixo X para coletar uma única imagem 2D composta e, posteriormente, o microposicionador do eixo Z move o espécime para um plano mais profundo dentro do tecido para obter uma pilha de imagens 2D seriais seccionadas (Vídeo 1, Figura 4). Uma pilha de imagens translacionais é coletada em toda a largura, espessura e comprimento da cóclea, não sendo necessária a costura das imagens (Vídeo 2). A pilha de imagens é transferida para outro computador e carregada em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D. As pilhas de imagens contêm todas as informações digitais sobre a morfologia de uma cóclea na resolução do microscópio. No entanto, se uma resolução maior for necessária, a cóclea intacta pode ser processada por métodos histológicos destrutivos, como secção em micrótomos, varredura e microscopia eletrônica de transmissão.
O programa de renderização 3D é usado para segmentar diferentes estruturas cocleares para renderização 3D e análise quantitativa. Para segmentação, cada estrutura em cada imagem 2D da pilha é rastreada usando uma cor diferente por uma mesa gráfica e caneta (Figura 5). Até o momento, 20 diferentes estruturas cocleares foram segmentadas (Figura 6). Após a segmentação, uma variedade de análises 3D pode ser realizada. Por exemplo, o software de renderização 3D pode ressecção virtualmente da cóclea em qualquer plano ao longo do centroide da estrutura. O vídeo 3 mostra a secção tangencial ao órgão de Corti, que revela as células ciliadas ao longo do comprimento da membrana basilar. Esse processo requer primeiramente a segmentação manual da estrutura de interesse. Em seguida, o centroide da estrutura é calculado com base no ajuste dos mínimos quadrados dos pontos spline colocados ao longo do centro da estrutura desde sua base até seu ápice, permitindo assim uma aproximação do comprimento da estrutura (Vídeo 4). Um processo semelhante chamado esqueletonização pode ser usado para visualizar a largura radial da estrutura ao longo de seu comprimento usando um mapa colorido (Vídeo 4). O volume total de cada estrutura é calculado pelo programa após a segmentação, mas as distâncias relativas também podem ser quantificadas e visualizadas com mapas coloridos em um software de renderização 3D (Figura 7). Estruturas segmentadas também podem ser exportadas para produzir renderizações ampliadas de modelos de plástico sólido (Figura 8). Além disso, a contagem semi-automatizada de células também pode ser realizada usando um software de renderização 3D (Figura 9). A imuno-histoquímica e a ligação ao ligante podem ser usadas para corar estruturas cocleares específicas e estas estruturas podem ser isoladas de outras estruturas cocleares para avaliação morfométrica, como a confecção de um citococleograma (Figura 10). O comprimento, a largura, a superfície, o volume e o número de todas as estruturas cocleares podem ser determinados a partir dos modelos 3D, tornando esta abordagem ideal para mapear os danos cocleares e os comprometimentos funcionais. Especificamente, danos cocleares devido ao envelhecimento, trauma induzido por ruído ou outros insultos podem ser mostrados e quantificados em reconstruções cocleares 3D a partir de cortes ópticos 2D. Uma vez que a cóclea foi digitalizada, existem inúmeros algoritmos de imagem que podem ser usados para avaliar o dano coclear de qualquer tecido dentro da cóclea no registro anatômico para outros tecidos cocleares.

<table><tbody><tr><td>Software de Renderização 3D Amira</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Endereço: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>benzoato de benzila (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Endereço: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>Bondic&nbsp;</td><td></td><td>Endereço: 235 Industrial Parkway S., Unidade 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canadá</td></tr><tr><td>Etanol 95% e 100%&nbsp;</td><td>Universidade de Minnesota</td><td></td><td>Endereço: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado (EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Endereço: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Programa gráfico LabVIEW e Visão</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Endereço: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>salicilato de metila (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Endereço: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação Olympus MVX10</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>Endereço: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Isotiocinato de rodamina B, (283924)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Endereço: Caixa postal, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Célula de flurômetro Starna (3-G-20)</td><td>Células</td><td></td> Starna <td>Endereço: Caixa postal 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

imagem da cóclea envelhecida com microscopia de fluorescência de folha de luz

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

A surdez é a deficiência sensorial mais comum, afetando aproximadamente 5% ou 430 milhões de pessoas no mundo, de acordo com a Organização Mundial da Saúde1. O envelhecimento ou presbiacusia é uma causa primária de perda auditiva neurossensorial e é caracterizada por danos às células ciliadas, neurônios do gânglio espiral (GNG) e estria vascular. Essas estruturas residem dentro da cóclea, que tem uma anatomia complexa em forma de espiral de tecidos membranosos suspensos em fluido e circundados por osso. Essas propriedades dificultam tecnicamente a investigação e quantificação das alterações histopatológicas. Para suprir essa necessidade, desenvolvemos um microscópio fotográfico (TSLIM) que pode obter imagens e digitalizar toda a cóclea para facilitar o estudo das relações estrutura-função na orelha interna. Seções seriais bem alinhadas de toda a cóclea resultam em uma pilha de imagens para renderização de volume tridimensional (3D) e segmentação de estruturas individuais para visualização 3D e análise quantitativa (ou seja, comprimento, largura, superfície, volume e número). As cócleas requerem etapas mínimas de processamento (fixação, descalcificação, desidratação, coloração e clareamento óptico), todas compatíveis com imagens subsequentes de alta resolução por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Uma vez que todos os tecidos estão presentes nas pilhas, cada estrutura pode ser avaliada individualmente ou em relação a outras estruturas. Além disso, como a imagem utiliza sondas fluorescentes, a imunohistoquímica e a ligação de ligantes podem ser usadas para identificar estruturas específicas e seu volume ou distribuição 3D dentro da cóclea. Aqui usamos TSLIM para examinar cócleas de camundongos idosos para quantificar a perda de células ciliadas e neurônios do gânglio espiral. Além disso, análises avançadas (por exemplo, análise de agrupamento) foram usadas para visualizar reduções locais de neurônios do gânglio espiral no canal de Rosenthal ao longo de seu volume 3D. Essas abordagens demonstram a capacidade da microscopia TSLIM de quantificar as relações estrutura-função dentro e entre as cócleas.

Como o tema deste número especial é a imagem dos efeitos do envelhecimento na cóclea, uma cóclea jovem (camundongo HS2479, cepa CBA) e envelhecida (camundongo HS2521, cepa C57 de 23 meses) será usada como exemplo. Deve-se notar que o TSLIM é capaz de obter imagens de uma variedade de espécimes, incluindo cócleas de humanos, mamíferos, outros roedores e peixes, bem como outros órgãos, como o cérebro.
Johnson e col. 13 publicaram um artigo sobre SGNs em camundongos CBA jo...

Um microscópio fotográfico foi desenvolvido para obter imagens e digitalizar a cóclea inteira.

Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Desenvolvemos um microscópio de folha de luz que pode digitalizar toda a cóclea. Este microscópio tem objetivas montadas no ar com uma longa distância de trabalho que pode obter imagens de pequenas cócleas de camundongos até um grande osso temporal humano. Ele seciona a cóclea em série com um feixe de laser sem causar qualquer destruição mecânica.Nosso método de imagem pode ser usado para avaliar alterações patológicas na cóclea, como a perda de células ciliadas e neurônios do gânglio espiral devido ao envelhecimento. Depois de eutanasiar e decapitar um rato, faça uma incisão dorso-ventral através do cérebro para hemisseccionar o crânio. Remova o cérebro e identifique a bula redonda na parte basoventral do crânio.Abra a bula com rongeurs. Em seguida, visualize e remova a cóclea. Sob um microscópio de dissecção com aumento de cinco vezes, puncione a janela oval e remova o estribo com um palito afiado.Em seguida, insira um palito na janela redonda para perfurar a membrana. Para realizar a fixação, cubra a janela redonda aberta com a ponta de corte de um conjunto de infusão que é anexado a uma seringa de um mililitro preenchida com dois mililitros de formalina. Infundir formalina lentamente através dos espaços perilinfáticos de uma cóclea durante um período de dois minutos, garantindo que a formalina está saindo da cóclea através da janela oval aberta.Aparar o excesso de tecido da cóclea. Mergulhe em um frasco contendo 10% de formalina e coloque-o em um rotador durante a noite. Para descalcificação, enxaguar a cóclea em PBS três vezes por cinco minutos cada.Imergir num frasco contendo solução a 10% de EDTA. Incubar por quatro dias com rotação, trocando a solução diariamente. Em seguida, perfundir a cóclea com PBS três vezes e mergulhar por 15 minutos entre as trocas para remover todo o EDTA.Após a lavagem, desidratar a cóclea com concentrações crescentes de etanol por 30 minutos em cada concentração. Corar toda a cóclea por imersão em solução de rodamina B durante a noite com rotação. Retirar o excesso de corante da cóclea com duas trocas de etanol a 100% com incubação por cinco minutos para cada troca.Transferir a cóclea corada para duas trocas da solução de Spalteholz por 30 minutos em cada troca. Deixe durante a noite na solução de limpeza com rotação. Fixar a cóclea a uma haste de amostra na extremidade oval e redonda da membrana da janela.Certifique-se de que a solução de limpeza permanece dentro da cóclea e bolhas não são formadas. Fixe as extremidades ovais e redondas da cóclea molhada à haste seca da amostra usando cola ativadora UV. Cure a cola UV por 10 segundos movendo-se ao redor da cóclea com uma luz UV.Suspender a cóclea na câmara de imagem em célula de fluorômetro de quartzo opticamente transparente preenchida com solução de Spalteholz com a haste da amostra conectada a um suporte rotativo que também está conectado ao estágio de translação X/Z. Em seguida, use um programa personalizado para mover a amostra através da folha de luz nas etapas do eixo X e Z e faça uma pilha de imagens 2D em toda a cóclea. Para processar a imagem, transfira a pilha de imagens para outro computador e carregue-a em um programa de renderização 3D para reconstrução e quantificação 3D.A renderização direta do volume da cóclea de camundongo mostrou as janelas oval e redonda, órgão de Corti com células ciliadas, o canal de Rosenthal foi segmentado e o volume renderizado, e mostrou neurônios do gânglio espiral, ou SGNs, ao longo de sua extensão. Usando TSLIM, a cóclea de um camundongo jovem de três meses de idade e um camundongo de 23 meses de idade foram imageadas e contadas para SGNs. A contagem de células SGN em função da distância do canal de Rosenthal mostrada em um gráfico linear mostrou maiores SGNs no animal mais jovem nas extremidades média e apical da cóclea em comparação com o animal mais velho.Essa aparente perda de SGNs foi visualizada utilizando-se análise de cluster e software de renderização 3D. As diferenças de densidade do SGN foram descritas em uma escala de cores onde os clusters de alta densidade são amarelos e o azul representa regiões de menor densidade. A análise de agrupamento mostrou claramente as regiões de menor densidade celular ao longo do comprimento do canal de Rosenthal.A microscopia de folha de luz é projetada para produzir uma pilha bem alinhada de imagens a partir da qual renderizações de volume 3D de estruturas podem ser produzidas. Programas de renderização 3D permitem a avaliação quantitativa de estruturas e relações anatômicas entre diferentes estruturas. No entanto, como os programas de renderização 3D oferecem muitos parâmetros de usuário diferentes, há uma curva de aprendizado significativa para usar esses programas de forma eficaz.

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

Nós apresentamos um método para isolar o órgão de Corti adulto como três voltas intactas cocleares (Apex, médio e base). Nós também demonstrar um procedimento para a imunocoloração com anticorpos marcados por fluorescência. Em conjunto estas técnicas permitem o estudo de células ciliadas, células de suporte, e outros tipos de células encontradas na cóclea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

O peixe-zebra é um sistema de modelo que tem muitos recursos valiosos, incluindo claridade ótica, rápido desenvolvimento externo e, de particular importância para o campo de audição e equilíbrio, localizado externamente células sensoriais do cabelo. Este artigo descreve como transgênico zebrafish pode ser usado para ensaiar tanto cabelo-célula mechanosensation e função pré-sináptica em toto.

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

Aqui apresentamos um protocolo para a Microscopia de Condução de Íons da Sonda Hopping (HPICM), uma técnica de sonda de varredura sem contato que permite imagens nanoescala de feixes de estereócilia em células ciliadas auditivas vivas.

Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Um protocolo para processar a cópula gerbil jovem e envelhecida imunolabelando as estruturas sinápticas e células ciliadas anciavelmente, saciando a autofluorescência no tecido envelhecido, dissecando e estimando o comprimento da cóclea, e quantificando as sinapses em pilhas de imagens obtidas com imagens confocalas.

Sinpses de fita de imunolabeling e contagem em jovens adultos e cócleas de Gerbil Envelhecido

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

Apresentamos um protocolo para um modelo de perda auditiva induzida por ruído (PAIR) em camundongos. Para induzir a PAIR, desenvolvemos um dispositivo novo e simples usando plástico corrugado, uma gaiola armadilha para ratos e um alto-falante. O potencial evocado auditivo de tronco encefálico e a imagem de imunofluorescência foram empregados para avaliar a função auditiva e o dano às células ciliadas externas, respectivamente.

Condições experimentais modificadas para perda auditiva induzida por ruído em camundongos e avaliação da função auditiva e lesão das células ciliadas externas

Aprenda a usar microscopia de folha de luz para imaginar a cóclea inteira sem destruição mecânica. Este método permite avaliar alterações patológicas, como perda de neurônios ganglionares espirais em modelos de envelhecimento.

Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Explorar mais vídeos