Name: Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a isolar folículos pré-antrais de ovário bovino usando fragmentação, homogeneização e filtração seriada. Este método mecânico eficiente aumenta a viabilidade das amostras para estudos de foliculogênese e preservação da fertilidade.

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Este projeto foi parcialmente financiado pelo projeto multiestadual do USDA W4112 e pelo prêmio UC Davis Jastro Shields à SM.
Os autores gostariam de estender seu apreço à Central Valley Meat, Inc. por fornecer os ovários bovinos usados em todos os experimentos. Os autores também agradecem a Olivia Silvera pela assistência com o processamento do ovário e isolamento do folículo.

Os autores não têm nada a revelar.

O presente protocolo detalha um método reprodutível para recuperar folículos pré-antrais em estágio inicial, especificamente nos estágios primário e secundário inicial, do ovário bovino. Este protocolo baseia-se em relatórios anteriores 20,25,30,34,35,36 e fornece otimizações que resultam no isolamento de um número significativo de folículos de um ovário individual....

Os folículos ovarianos são as unidades funcionais do ovário, responsáveis pela produção do gameta (ovócito), bem como hormônios críticos para a função reprodutiva e a saúde geral. Os folículos primordiais se formam no ovário durante o desenvolvimento fetal ou no período neonatal, dependendo da espécie1, e constituem a reserva ovariana de uma fêmea. O crescimento folicular começa com a ativação de folículos primordiais que deixam a piscina de repouso e entram na fase de crescimento. A foliculogênese pré-antral, abrangendo todos os estágios do folículo antes do desenvolvimento do antro, é um processo altamente dinâmico que requer alterações morfológicas e metabólicas síncronas no ovócito e nas células granulosas circundantes, impulsionadas pela comunicação estreita entre esses dois tipos celulares 2,3. Os folículos pré-antrais constituem a maioria das unidades foliculares encontradas no ovário em um dado momento4. Estima-se que o desenvolvimento através dos estágios pré-antrais da foliculogênese seja várias semanas maior do que o desenvolvimento antral 5,6, e esse tempo é necessário para que o ovócito e as células somáticas adquiram maturidade suficiente para entrar no estágio final de desenvolvimento (ou seja, o estágio antral) e se preparar para a ovulação, fertilização e desenvolvimento embrionário 7,8,9.
Grande parte do conhecimento atual sobre a foliculogênese pré-antral ovariana vem de modelos de camundongos 10,11,12,13, devido em parte à facilidade em recuperar um grande número desses folículos de um ovário menor e menos fibroso. Embora os relatos de isolamento de um grande número de folículos pré-antrais de ovários bovinos remontem a aproximadamente 30 anos14, uma compreensão mais completa sobre os processos que regulam o desenvolvimento desses folículos em estágio inicial permaneceu não realizada, em grande parte devido à falta de métodos otimizados, eficientes e repetíveis para recuperar um número suficiente de folículos pré-antrais viáveis, particularmente nos estágios iniciais de desenvolvimento. Com o crescente interesse em preservar a reserva ovariana para uso futuro na reprodução assistida em humanos, as vacas tornam-se um modelo atraente devido à sua estrutura ovariana mais semelhante15. No entanto, o ovário bovino é marcadamente mais rico em colágeno em comparação com o ovário de camundongo16, tornando o isolamento mecânico usando métodos descritos para o camundongo muito ineficiente. Os esforços para expandir as técnicas de preservação da fertilidade incluem o crescimento in vitro completo dos folículos pré-antrais até o estágio antral, seguido de maturação in vitro (IVM) dos ovócitos fechados, fertilização in vitro (FIV) e produção e transferência de embriões17. Até agora, todo esse processo só foi alcançado em camundongos18. Em bovinos, o progresso em direção ao crescimento do folículo in vitro é limitado a poucos relatos com estágios folículos variáveis no início da cultura, bem como tempo variável de cultura entre os protocolos17,19.
Os métodos descritos na literatura para a colheita de folículos pré-antrais do ovário bovino têm utilizado principalmente técnicas mecânicas e enzimáticas, isoladas ou em combinação 2,14,17,20. O primeiro relato de um protocolo de isolamento do folículo pré-antral bovino utilizou homogeneizador tecidual e filtração seriada para processar ovários inteiros20. Este estudo foi seguido por relatos que combinaram procedimentos mecânicos e enzimáticos que utilizaram colagenase14. Um tema recorrente na utilização da colagenase para digerir o tecido ovariano é o risco potencial de dano da membrana basal folicular, o que pode comprometer a viabilidade do folículo 14,21,22,23. Portanto, diferentes combinações de métodos mecânicos têm sido empregadas, como o uso de um helicóptero de tecido e pipetagem repetida ou um helicóptero de tecido combinado com homogeneização20,24,25,26. Outra técnica mecânica que foi descrita utiliza agulhas para dissecar folículos pré-antrais diretamente do tecido ovariano, o que é especialmente útil para isolar folículos secundários maiores (>200 μm). No entanto, esse processo é demorado, ineficiente para isolar folículos pré-antrais menores e é dependente de habilidades quando tentado em ovários bovinos 19,27,28.
Aproveitando as diferentes técnicas descritas na literatura, este protocolo teve como objetivo otimizar o isolamento de folículos pré-antrais de ovários bovinos únicos de forma simples, consistente e eficiente, evitando a incubação em soluções enzimáticas. Melhorar os métodos para isolar folículos pré-antrais proporcionará uma oportunidade para melhorar a compreensão deste estágio da foliculogênese e permitir o desenvolvimento de sistemas de cultura eficazes para desenvolver folículos pré-antrais para o estágio antral. Os procedimentos detalhados aqui descritos para o isolamento de folículos pré-antrais de um mamífero de grande porte, como a espécie bovina, serão vitais para os pesquisadores que pretendem estudar a foliculogênese precoce em uma espécie não murina que seja traduzível para os seres humanos.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteur de Vidro Descartável de Cal Sodada 5-3/4"</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>63A54</td><td>Pipeta Pasteur que pode ser usada para desalojar folículos de detritos enquanto procura dentro da placa de Petri</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>Diluído a 4%; fixação de folículos para imunocoloração</td></tr><tr><td>20 mL Seringa Luer-lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>Seringa usada com a agulha 18 G para desalojar os folículos do 40 &mu; Filtro de célula m</td></tr><tr><td>#21 Lâmina de bisturi estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-365-023</td><td>Usado para cortar os ovários e remover a medula</td></tr><tr><td>40 &mu; Filtro de Células m</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>Usado para filtrar o filtrado do 300 &mu; Filtro de célula m</td></tr><tr><td>104 mm Funil de Plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-348C</td><td>O tamanho pode variar, mas certifique-se de que o pano de queijo seja cortado adequadamente e que o homogenato ovariano não derrame mais de</td></tr><tr><td>300 &mu; m Cell Strainer</td><td>pluriSelect&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>Usado para filtrar o filtrado do pano de queijo&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer de 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB500500</td><td>Funil e frasco usados para pegar filtrado do pano de queijo&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulhas Estéreis Air-Tite 18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 G oferece pressão suficiente para desalojar os folículos dos 40 &mu; </td></tr><tr><td>Agulhas Estéreis Air-Tite 27 G 13 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>Agulhas que podem ser usadas para manipular quaisquer detritos nos quais os folículos estão presos</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 Solução</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB561908</td><td>Coloração de DNA Fluorescente</td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>Componente do meio de lavagem do folículo</td></tr><tr><td>Ciências</td> de <td>Microscopia Eletrônica de Pano</td> de Queijo <td>71748-00</td><td>Primeira etapa de filtragem do homogenato ovariano destinada a remover grandes detritos de tecido</td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de segurança de borda dupla clássica Lâminas de barbear</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N/A</td><td>que se encaixam melhor no picador de tecidos McIlwain e não embotam rapidamente</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho Burro, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>Anticorpo secundário para imunocoloração</td></tr><tr><td>Eisco Latex Pipeta Bulbs</td><td>Fisher Scientific</td><td>S29388</td><td>Bulbo de borracha para usar com pipetas Pasteur</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Componente do meio de lavagem do folículo</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>Homogeneizar o tecido ovariano para liberar folículos&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>Software usado para análise de fluorescência-imunolocalização</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10184</td><td>Usado para cortar tecido ovariano pequeno o suficiente para homogeneização</td></tr><tr><td>Microscópio - Estereoscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ILLT</td><td>Microscópio de dissecção usado para pesquisar e colher folículos do filtrado</td></tr><tr><td>Microscópio - Nikon invertido</td><td></td><td>Diaphot 300</td><td>Microscópio invertido utilizado para visualização de campo claro de alta ampliação de folículos isolados</td></tr><tr><td>Microscópio - Invertido</td><td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>Microscópio invertido utilizado para visualização de campo claro de alta ampliação e epifluorescência de folículos isolados</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>Óleo para cobrir as gotas do meio de lavagem folicular para evitar a evaporação durante a pesquisa</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Componente do meio de lavagem folicular</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>Reagente para tampão de bloqueio de imunocoloração</td></tr><tr><td>Nunc 4-well Pratos para FIV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144444</td><td>pratos de 4 poços para isolamento e lavagem</td>de</tr><tr><td>folículos Solução de Penicilina-Estreptomicina 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Componente do meio de lavagem folicular</td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm OD x 13.7 mm</td><td>Ted Pella</td><td>10184-04</td><td>Placa de Petri que se encaixa melhor no McIlwain Tissue Chopper</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Tampão de lavagem para ovários e folículos</td>Tábua</tr><tr>de<td>Corte de Plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A Tábua</td><td>de corte de tamanho suficiente para cortar com segurança ovários</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>A adição de PVP (0,1% p/v) ao PBS impede que os folículos grudem na placa ou uns nos outros&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Meio de montagem para células ou tecidos marcados com fluorescência</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Kit de limpeza de coluna de RNA</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>Software de análise estatística</td></tr><tr><td>Anticorpo Policlonal Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 anticorpo primário para imunocoloração</td></tr><tr><td>RevertAid RT Kit de Transcrição Reversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td>kit de síntese de cDNA</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>Software de análise estatística</td></tr><tr><td>Solução de Hidróxido de Sódio (1N/Certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>Usado para aumentar o pH do meio para 7,6-7,8</td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Componente do meio de lavagem folicular</td></tr><tr><td>Placa de Petri Quadrada 100 mm x 15 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60872-310</td><td>Placas de Petri gradeadas permitem uma identificação mais eficiente dos folículos&nbsp;</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Mastermix para reação de PCR</td></tr><tr><td>Filtro de topo de garrafa rosqueado Steritop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2GPT02RE</td><td>Usado para esterilizar o meio de lavagem do folículo</td></tr><tr><td>Coloração de gel de DNA seguro para SYBR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Coloração para produtos de PCR visual em gel de agarose</td></tr><tr><td>TCM199 com Hank' s Sais</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>Componente do meio de lavagem folicular</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Detergente para tampão de permeabilização de imunocoloração</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>reagente de isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Solução azul de tripano, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>Usado para testar a viabilidade de folículos isolados</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>Detergente para imunocoloração tampão de lavagem</td></tr><tr><td>Placa Aquecedor Universal</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>Placa quente para manter os folículos a 38,5 &deg; C enquanto procurava ao microscópio</td></tr><tr><td>Micropipetas de vidro Wiretrol II Calibrated Drummond</td><td></td><td>50002-005</td><td>para manipular folículos</td></tr></tbody></table>

isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

Compreender todo o processo de foliculogênese de mamíferos é crucial para melhorar as tecnologias de reprodução assistida em gado, humanos e espécies ameaçadas de extinção. A pesquisa tem sido limitada principalmente a folículos pré-antrais grandes e antrais devido à dificuldade no isolamento de folículos pré-antrais menores, especialmente em mamíferos de grande porte, como bovinos. Este trabalho apresenta uma abordagem eficiente para recuperar um grande número de pequenos folículos pré-antrais de um único ovário bovino. O córtex de ovários bovinos individuais foi cortado em cubos de 500 μm usando um helicóptero de tecido e homogeneizado por 6 min a 9.000-11.000 rpm usando uma sonda de 10 mm. Grandes detritos foram separados do homogeneizado com pano de queijo, seguido de filtração seriada através de filtros celulares de 300 μm e 40 μm. O conteúdo retido no filtro de 40 μm foi enxaguado em um prato de busca, onde os folículos foram identificados e coletados em uma gota de meio. A viabilidade dos folículos coletados foi testada por meio da coloração azul de tripano. Este método permite o isolamento de um grande número de pequenos folículos pré-antrais viáveis de um único ovário bovino em aproximadamente 90 min. É importante ressaltar que este método é totalmente mecânico e evita o uso de enzimas para dissociar o tecido, o que pode danificar os folículos. Os folículos obtidos com este protocolo podem ser utilizados para aplicações a jusante, como isolamento de RNA para RT-qPCR, imunolocalização de proteínas específicas e cultura in vitro .

Visão geral e etapas críticas Usando este protocolo, pequenos folículos pré-antrais bovinos podem ser isolados de forma confiável de ovários únicos em números experimentalmente relevantes. De um total de 30 repetições, obteve-se uma média de 41 folículos por repetição, com variação de 11 a 135 folículos (Figura 4A). Em 14 repetições, os folículos foram caracterizados para o estágio de desenvolvimento conforme descrito anteriormente26 pela medição d...

O avanço do estudo da foliculogênese pré-antral requer métodos eficientes de isolamento do folículo a partir de ovários únicos. Apresenta-se aqui um protocolo mecânico simplificado para isolamento folículo de ovários bovinos usando um cortador de tecido e homogeneizador. Este método permite a coleta de um grande número de folículos pré-antrais viáveis de um único ovário.

Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

Este protocolo permite o isolamento eficiente e repetível de folículos pré-antrais em estágio inicial de um único ovário bovino e cria novas oportunidades para o estudo da foliculogênese ovariana em uma espécie não bovina. Ao utilizar um maior número de folículos de um único ovário, esta técnica permite tratamentos in vivo antes da colheita do ovário, ou a obtenção de múltiplas amostras ao longo do tempo do mesmo animal através de biópsia ovariana. O isolamento e a criopreservação de folículos pré-antrais em estágio inicial podem ser uma opção valiosa para a preservação da fertilidade em mulheres jovens submetidas a tratamento gonadotóxico, como quimioterapia, bem como a preservação de germoplasma de espécies ameaçadas de extinção.Demonstrando o procedimento estarão Stephanie McDonnell, Amanda Morton e Juliana Candelaria, estudantes de doutorado do meu laboratório. Para começar, transfira os ovários em laboratório para PBS quente e estéril contendo Pen-Strep e selecione ovários com muitos folículos antrais pequenos e sem corpo lutécio proeminente. Remova qualquer excesso de tecido conjuntivo e gordura dos ovários usando uma tesoura.Transfira um ovário para a tábua de corte no papel de bancada. Usando um bisturi, corte o ovário ao meio longitudinalmente de um local de fixação ligamentar para o local de fixação oposto. Mantenha uma metade do ovário na tábua de corte a ser processada e coloque a outra metade do ovário de volta em PBS quente contendo Pen-Strep.Para remover a medula, corte ao longo da curvatura do ovário a aproximadamente 2 milímetros de distância da superfície sem cortar o córtex com a medula exposta voltada para cima. Fatie o corte para remover a maior parte da medula. Vire o ovário pela metade para que o epitélio fique voltado para cima e use o bisturi para terminar de cortar a medula para longe do córtex e cortar qualquer tecido conjuntivo branco restante ao redor da borda da peça do ovário que foi conectada aos ligamentos.Uma vez que a maioria da medula é removida, use o bisturi para cortar o córtex a aproximadamente 1 milímetro de espessura enquanto manipula o bisturi com pequenos movimentos de ida e volta para raspar o restante da medula e, em seguida, corte cada córtex do ovário metade em dois pedaços. Mantenha as peças do córtex em PBS quente contendo Pen-Strep até que estejam prontas para cortar. Transfira um único pedaço do córtex para a placa de Petri no helicóptero de tecido e molhe o tecido com três ou quatro gotas de PBS quente contendo Pen-Strep.Enquanto mantém o pedaço de tecido firme com um par de pinças, pressione o botão Reset uma vez para iniciar o cortador de tecido. Depois que todo o pedaço do córtex tiver sido cortado em tiras, use o botão do suporte da lâmina para levantar a lâmina da placa de Petri e a pinça para remover qualquer tecido da lâmina. Depois de girar o suporte da placa em 90 graus, novamente, pressione o botão Reset e passe a lâmina inteiramente através das tiras de tecido.Use o botão do suporte da lâmina para levantar a lâmina da placa de Petri e a pinça para remover qualquer tecido da lâmina, conforme demonstrado anteriormente. Usando uma pipeta de transferência e PBS quente contendo Pen-Strep, lave o tecido picado em um tubo cônico pré-aquecido de 50 mililitros. Devolva o tubo cônico ao banho de água ou grânulos para manter o tecido picado aquecido enquanto repete o procedimento de corte com as outras três metades do ovário.Para obter melhores resultados de corte, use o driver de porca para remover a porca do braço de corte e remova a lavadora e o fecho da lâmina. Usando fórceps, remova a lâmina do braço de corte. Vire-o de modo que a borda não utilizada fique voltada para a placa de Petri e coloque-a de volta no braço de corte.Depois de garantir que a unidade homogeneizadora esteja conectada e a velocidade seja ajustada para a segunda barra, insira a sonda geradora de 10 milímetros na unidade de acordo com as especificações do fabricante. Em seguida, defina um temporizador por 1 minuto e insira a sonda no tubo cônico de 50 mililitros contendo o tecido do córtex picado de um ovário e PBS suficiente contendo Pen-Strep para encher o tubo até a linha de 25 mililitros. A profundidade a que a sonda é inserida deve ser de 1/3 da altura do líquido, medida a partir do fundo da câmara.Quando o temporizador for iniciado, ligue o homogeneizador, garantindo que o fundo da sonda não toque no tubo e mantenha o tubo imóvel enquanto o homogeneizador está ligado. Após 1 minuto de homogeneização, remova a sonda do tubo e, em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo que obstrua os orifícios de ventilação no espaço entre a faca do rotor e o tubo do rotor ou as peças do córtex presas na sonda usando pinça e coloque-as de volta no tubo. Deitar o tecido disperso na ampola coberta de gaze, inserida no balão de Erlenmeyer e enxaguar o conteúdo do tubo na ampola utilizando PBS quente.Finalmente, lave o pano de queijo com PBS morno. Força o líquido em pequenos fragmentos a passar pelos orifícios do pano, torcendo o pano de queijo em torno dos fragmentos de tecido para baixo e apertando até que todo o excesso de fluido e tecido seja removido do pano de queijo. Depois de reabrir o pano de queijo sobre o funil, lave o pano de queijo com PBS contendo Pen-Strep usando uma pipeta de transferência e, novamente, esprema quaisquer fragmentos de tecido residual através do pano.Usando um hemostático, segure o filtro celular de 300 micrômetros sobre um copo de 200 mililitros e despeje o filtrado no frasco de Erlenmeyer através do filtro celular. Se o filtro celular ficar entupido com tecido, bata-o suavemente contra o copo, em seguida, vire o filtro de cabeça para baixo e toque os grandes detritos de tecido no papel de bancada. Enxaguar o conteúdo do balão utilizando PBS quente contendo Pen-Strep até que não restem fragmentos de tecido e deitá-lo no coador celular.Em seguida, enquanto segura o filtro celular de 40 micrômetros com um hemostato sobre um segundo copo de 200 mililitros, despeje todo o filtrado inicial presente no primeiro copo de 200 mililitros através do filtro e, em seguida, lave o conteúdo do copo usando PBS quente contendo Pen-Strep até que nenhum fragmento de tecido permaneça e despeje-o no filtro celular. Depois de encaixar a agulha de calibre 18 na seringa de 20 mililitros, encha a seringa com o meio de lavagem do folículo. Com um hemostático, segure o filtro celular de 40 micrômetros de cabeça para baixo sobre uma placa de Petri quadrada e use a seringa para lavar o conteúdo do filtro celular no prato.Transfira a placa de Petri quadrada para um estereoscópio com um estágio quente ajustado a 38,5 graus Celsius com uma ampliação definida entre 1,25 e 3,2x. Depois de identificar os folículos da placa de Petri quadrada, transfira o folículo para lavar gotas médias usando a micropipeta. O número total de folículos pré-antrais isolados por replicado utilizando homogeneização tecidual de 6 minutos mostra uma média de 41 folículos por replicado, variando de 11 a 135 folículos.A avaliação do estágio de desenvolvimento de 476 folículos isolados mostrou que a maioria estava no estágio primário de desenvolvimento, medindo de 40 a 79 micrômetros contendo uma camada de células granulosas cuboidais. A homogeneização do córtex ovariano por 6 minutos produziu um maior número de folículos pré-antrais em comparação com 5 minutos de homogeneização na mesma velocidade. A expressão do transcrito do receptor FSH marcador de células granulosas e do marcador de células germinativas DAZL nos folículos foi avaliada usando PCR quantitativa de transcrição reversa, demonstrando que os folículos primários e secundários precoces expressavam o receptor de FSH e os transcritos de DAZL.A localização imunofluorescente do CX37 em folículos pré-antrais isolados nos estágios primário e secundário inicial mostra que o CX37 estava localizado no plasma O, estando ausente do núcleo do sítio O e da membrana das células granulosas. Em nossa experiência, a dissecção adequada de uma fina camada de tecido cortical, o corte do tecido no tamanho certo e a homogeneização adequada são etapas críticas para garantir a liberação de folículos viáveis do tecido. Folículos pré-antrais isolados podem ser utilizados para responder a questões como a regulação do crescimento do folículo pré-antral e a natureza das interações entre as células granulosas e o ovócito, facilitando assim o desenvolvimento de condições de cultura mais eficientes.

isolation-small-preantral-follicles-from-bovine-ovary-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um novo método para encapsulação de ovário folículos em uma rede de fibrina 3D alginato-interpenetrantes é descrito. Este sistema combina suporte estrutural, com a degradação proteolítica para apoiar o desenvolvimento de folículos imaturos para produzir ovócitos maduros. Este método pode ser aplicado a agregados de cultura de células para manter contatos célula-célula sem limitar a expansão.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

Este vídeo descreve o isolamento de oócitos antrais de ovários de camundongos recém-colhidos. Esses oócitos antrais podem ser usados para caracterização adicional e estudos de desenvolvimento.

Isolamento de oócitos antrais de camundongos: um método para isolar oócitos antrais de ovários de camundongos recém-colhidos

Este vídeo descreve a técnica para isolar o complexo cumulus-oócito ou COC dos ovários suínos. O COC intacto isolado pode ser usado para realizar a fertilização in vitro - a técnica de reprodução assistida para o desenvolvimento de tratamentos de fertilidade.

Isolamento do Complexo Oócito do Cumulus Suíno: Uma Técnica para Isolar o Complexo de Oócitos do Cumulus do Folículo Ovariano Suíno para Fertilização In Vitro

Apresentados aqui estão dois protocolos para o encapsulamento de oócitos suínos em condições culturais 3D. No primeiro, os complexos cumulus-oocyte (COCs) são encapsulados em contas fibrina-alginato. No segundo, são fechados com partículas fluoradas de propileno de etileno (microbioreatores). Ambos os sistemas garantem condições ideais para manter sua organização 3D.

Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno

Descrevemos os procedimentos para o isolamento dos oócitos em crescimento dos folículos ovarianos nos estágios iniciais de desenvolvimento, bem como a criação de um sistema de cultura in vitro que possa apoiar o crescimento e a diferenciação até o estágio totalmente crescido.

Estratégia de Cultura In Vitro para Oócitos do Folículo Antral Primitivo em Bovinos

Aqui, apresentamos um método simples para separar células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish, o que facilitará investigações do desenvolvimento ovariano em zebrafish.

Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish

Aqui, apresentamos protocolos para a identificação e purificação de células ovarianas de folículos antrais. Elaboramos métodos de processamento de ovários inteiros para a criopreservação de tiras corticais e também colhemos de folículos antrais intactos que são tratados enzimaticamente para liberar vários tipos de células residentes de folículos, incluindo células granulosas, tecais, endoteliais, hematopoiéticas e estromais.

Extração, marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos

Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.

Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos

Aqui, descrevemos um protocolo para separar células vitelinos, células da granulosa e teca em folículos pré-ovulatórios aviários. Esse manuseio preciso permite investigações críticas sobre o papel dessas camadas na função reprodutiva, auxiliando na compreensão do desenvolvimento folicular, regulação hormonal e pesquisa de doenças para melhorar o rendimento agrícola e insights biomédicos.

Separação de camadas de células do folículo pré-ovulatório da granulosa e da teca aviária para aplicações a jusante

Este protocolo descreve um novo modelo de cultura tridimensional (3-D) usando um hidrogel de hialuronano ligado à tiramina para encapsular e cultivar folículos pré-antrais do ovário de camundongo. Também detalhamos duas abordagens para a criopreservação do folículo ovariano por vitrificação.

Aplicação de um novo hidrogel de hialuronano para cultura de folículos tridimensionais e metodologia para criopreservação de folículos ovarianos de camundongos

Este artigo apresenta um modelo de co-cultivo de células de teca e granulosa bovinas. Este método tem o potencial de servir como uma base confiável para análises focadas no estudo da comunicação parácrina e transporte de substrato entre as células somáticas dentro do folículo.

Um sistema de co-cultura modificado para entender as interações entre células granulosa-teca no ovário bovino

Aprenda a isolar folículos pré-antrais de ovário bovino usando fragmentação, homogeneização e filtração seriada. Este método mecânico eficiente aumenta a viabilidade das amostras para estudos de foliculogênese e preservação da fertilidade.

Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de pequenos folículos pré-antrais do ovário bovino usando uma combinação de fragmentação, homogeneização e filtração seriada

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