Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade
23 de agosto de 2022
Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.
Muitos relatórios que avaliaram o sistema biliar extra-hepático relataram que obtiveram as amostras, mas não como as obtiveram, levantando questões relativas à comparabilidade. A principal vantagem desta técnica é que todo o sistema biliar extra-hepático pode ser dissecado e as células contaminantes podem ser removidas atraumaticamente. Nosso protocolo de dissecção pode ser geralmente aplicado a abordagens experimentais que trabalham com distúrbios do ducto biliar neonatal murino, visando a dissecção do sistema biliar extra-hepático.
Algumas características do protocolo, por exemplo, deixar o estômago preso ao duodeno, podem ser úteis na pesquisa da atresia duodenal para permitir a orientação correta pelo leite parcialmente digerido expresso pelo estômago. No início, a técnica pode exigir algum tempo para o treinamento. Praticar e seguir a abordagem passo-a-passo aumentará a velocidade e o resultado.
Para começar, coloque os instrumentos desinfetados e autoclavados em uma superfície estéril ao lado da mesa de operação. Depois de fazer um corte no peritônio, expanda o corte para o local da decapitação, seguindo a linha axilar frontal esquerda. Remova a pele do lado esquerdo para o direito com pinça atraumática.
Sob um microscópio, segure o peritônio ao redor do baço. Leve-o suavemente até que o peritônio se assemelhe a uma estrutura semelhante a uma tenda e corte um buraco de um milímetro no centro. Espere que a tenda peritoneal seja preenchida com ar.
Corte o peritônio em uma janela emoldurada pelas costelas inferiores, ambas as regiões abdominais laterais e a área inferior da bexiga. Garantir o acesso total ao fígado, sistema de ductos biliares, estômago, intestino delgado e cólon. Examine a vesícula biliar e os ductos biliares puxando cuidadosamente o processo xifoide em uma posição ventral craniana.
Evite rasgar o ligamento falciforme que pode levar ao rompimento da vesícula biliar do sistema do ducto biliar. Em seguida, libere a tração do processo xifoide. Puxe suavemente o duodeno para baixo para liberar o sistema de ducto biliar.
Em seguida, realize a mobilização En-bloc inferior, identificando a papila duodenal, que conecta o sistema de ducto biliar ao duodeno. Corte o duodeno cerca de dois centímetros para o lado lateral direito da papila. Em seguida, corte a área pilórica.
Certifique-se de que o conteúdo do estômago esteja presente na área pilórica entre o local de corte e a papila duodenal. Para realizar a mobilização En-bloc superior, puxe suavemente o processo xifoide e obtenha acesso ao ligamento falciforme. Faça um corte de um centímetro através do ligamento falciforme entre a vesícula biliar e perto do processo xifoide.
Corte as estruturas de conexão entre o fígado e o tórax, como o esôfago, a veia cava inferior, a aorta torácica e todos os ligamentos que cercam a área nua do fígado. Além disso, corte todas as conexões de tecido dorsalmente remanescentes. Sob ampliação microscópica de 20 vezes, coloque a amostra En-bloc em uma almofada de espuma.
Monte a amostra reorganizando-a na posição anatômica correta. Usando movimentos suaves, achate a parte oral e aboral do duodeno. Usando pinça atraumática, inicie o movimento de achatamento na papila duodenal e continue até as arestas de corte.
Em seguida, alise o conteúdo polpudo branco do estômago na parte oral do duodeno. Identifique a parte oral e a parte aboral do duodeno para descartar a provável rotação do ducto biliar. Corte grandes restos de tecido hepático antes de dissecar o ducto biliar.
Após alguns movimentos de raspagem, transfira a amostra para uma posição mais limpa no tapete de espuma. Use o tecido hepático menos espremido no fundo para otimizar a visão para diferenciação entre EBDS e células indesejadas. Processe o ligamento hepatoduodenal até que a EBDS isolada permaneça.
Observe a artéria hepática e a veia porta surgindo como filamentos brancos e muito delicados, a aproximadamente três a cinco milímetros por via oral da papila duodenal. Cuidadosamente, remova este filamento delicado usando uma puxada suave para o lado lateral esquerdo. Certifique-se de que os movimentos de raspagem começam a partir do sistema de ductos biliares e levam aos limites do fígado.
Utilizando este protocolo, a EBDS foi dissecada a partir de neonatos murinos de nove dias de idade. O comprimento da EBDS isolada da vesícula biliar à papila duodenal foi inferior a 10 milímetros, e o diâmetro do delicado ducto colédoco variou de 0,05 a 0,2 milímetros. A coloração com hematoxilina eosina foi realizada no corte longitudinal da EBDS com lúmen aberto.
Os colangiócitos foram identificados ao redor do lúmen como uma monocamada e foram tingidos mais escuros. Os pesquisadores devem compartilhar e padronizar técnicas operacionais, como dissecção e protocolos de injeção, para melhorar a comparabilidade e a rápida usabilidade de seus estudos e resultados. A dissecção prévia será vantajosa para abordagens histológicas e unicelulares, como o isolamento de intra e extrapericolangiócitos, pois resulta na redução da contaminação por cultura celular.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica inovadora para isolar todo o sistema de ductos biliares extra-hepáticos em neonatos murinos, essencial para o estudo de distúrbios dos ductos biliares. O método garante a integridade do ducto biliar durante a dissecação, resolvendo problemas anteriores de comparabilidade na coleta de amostras.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- Relatos anteriores careciam de clareza quanto aos métodos de coleta de amostras.
- Células contaminantes podem ser removidas de forma não traumática com a nova técnica.
- O protocolo é aplicável a diversas abordagens experimentais.
- A manutenção da fixação no estômago auxilia na orientação da pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável de dissecação para o sistema biliar extra-hepático.
- Aprimorar a comparabilidade em pesquisas sobre distúrbios de vias biliares em camundongos neonatos.
- Fornecer uma abordagem passo a passo para um treinamento eficaz.
Métodos Utilizados
- Dissecação de todo o sistema biliar extra-hepático.
- Remoção não traumática de células contaminantes.
- Protocolo de treinamento passo a passo para pesquisadores.
- Técnicas de orientação utilizando o estômago e o duodeno.
Resultados Principais
- A técnica permite a dissecação completa do sistema biliar.
- Melhor integridade da amostra e comparabilidade entre estudos.
- Facilita a pesquisa sobre distúrbios relacionados, como atresia duodenal.
- O treinamento melhora a velocidade e os resultados nas dissecações.
Conclusões
- O novo protocolo de dissecação é eficaz para estudos neonatais em camundongos.
- Ele aborda as limitações anteriores nos métodos de coleta de amostras.
- Pesquisas futuras podem se beneficiar dessa abordagem padronizada.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissecação padronizada do sistema de ductos biliares extra-hepáticos em camundongos neonatos atende à necessidade crítica de amostras reprodutíveis e de alta integridade na pesquisa de doenças biliares em estágios iniciais. Este protocolo permite o isolamento confiável de tecido intacto, apoiando estudos mecanicistas e aplicações posteriores, como histologia e análise em nível de única célula. A comparabilidade aprimorada e a qualidade das amostras impactam diretamente a validação de alvos e a continuidade translacional em pipelines pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação precisa dos mecanismos de doenças biliares em modelos neonatais.
- Reduz a ambiguidade biológica ao minimizar contaminação e danos teciduais.
- Apóia a validação funcional de alvos mediante a preservação de colangiócitos intactos.
- Facilita a confiança preditiva em estudos de sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece amostras de tecido validadas e reproduzíveis para ensaios histológicos e celulares subsequentes.
- Aprimora a padronização dos ensaios ao garantir a integridade consistente das amostras.
- Permite avaliação confiável de intervenções experimentais em modelos biliares.
- Apóia a escalabilidade e o reuso da plataforma para estudos comparativos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças como atresia biliar e distúrbios relacionados.
- Garante a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, preservando a arquitetura tecidual.
- Reduz o risco de variáveis confundentes em estudos de biomarcadores e mecanicistas.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados de alta qualidade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de dissecção situa-se na interface entre a descoberta inicial e a pesquisa pré-clínica, permitindo a geração robusta de amostras para análises mecanicistas, histológicas e celulares em modelos de doenças biliares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao fornecer amostras de tecido intactas e sem contaminação.
- Triagem: Fornece amostras prontas para ensaios com qualidade reprodutível para fluxos de trabalho subsequentes.
- Análises: Facilita medições histológicas e celulares quantitativas para comparação de condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém a relevância da doença e o alinhamento de biomarcadores por meio da preservação da estrutura nativa do tecido.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: Estabelece um protocolo padronizado e reutilizável para preparação consistente de amostras entre estudos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa biliar.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade, padronização e escalabilidade do preparo de tecidos.
- Valor Estratégico: Aprimora a qualidade das decisões de prosseguimento ou interrupção e a eficiência do capital ao reduzir a variabilidade das amostras.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de programas para doenças biliares.
Considerações sobre a Implementação
- Exige treinamento do operador em microdissecção e orientação anatômica.
- Requer acesso a instrumentos estéreis e autoclavados e infraestrutura de microscopia.
- Exige padronização entre equipes para adoção do protocolo e comparabilidade dos dados.
- Adaptável a outros modelos murinos neonatais com características anatômicas semelhantes.
- O tamanho da amostra e a delicadeza do tecido impõem limitações práticas na produtividade.
