Esterilização por radiação gama de baixa dose em enxertos traqueais descelularizados

Este protocolo proporciona um processo completo de esterilização de qualquer órgão não estéril sem afetar suas características. O principal objetivo desta técnica inclui a possibilidade de esterilizar um órgão sem afetar suas propriedades. Embora essa técnica tenha se concentrado nas traqueias, ela demonstrou que doses menores de radiação gama podem efetivamente esterilizar materiais biológicos.

Um indivíduo pode enfrentar o problema definindo a menor dose efetiva para os diferentes tipos de órgãos. Então, recomenda-se começar com uma dosagem mais baixa e aumentá-los até que a esterilização seja alcançada. Comece seccionando a traqueia dissecada de coelhos brancos eutanasiados da Nova Zelândia, ou Oryctolagus cuniculus, em pedaços de dois centímetros.

Com tesoura, remova o tecido conjuntivo circundante e a camada mucosa interna. Submergir os espécimes em 12 mililitros de solução de PBS contendo SDS, 5% de penicilina estreptomicina e 5% de anfotericina. Submeter as traqueias a agitação constante com um agitador magnético a 400 RPM durante cinco semanas à temperatura ambiente.

Semanalmente, dê duas horas de choque osmótico mergulhando as traqueias em água destilada antes de trocar o meio. Após cinco semanas, criogenizar os espécimes de traqueia usando uma mistura de 12 mililitros de 80% FBS e 20% DMSO em um recipiente de congelamento a menos 80 graus Celsius. Após 13 a 15 dias, descongele as traqueias em banho-maria a 37 graus Celsius.

Em seguida, lave-os com PBS. Para irradiar o espécime, colocar quatro peças traqueais em 20 mililitros de PBS em frascos de cultura de metacrilato T25, evitando a formação de bolhas. Realizar a irradiação utilizando um acelerador linear com fótons de uma energia nominal de 10 megavolts achatando feixes livres de filtros.

Aplicar uma taxa de dose de 2.400 unidades de monitor por minuto e definir outros parâmetros conforme descrito no manuscrito. Uma vez feito, cultivar o espécime em 30 mililitros de DMEM suplementado com FBS 10% inativado sem antibióticos ou antifúngicos. Incubar a cultura em uma incubadora de tecido padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas semanas e inspecioná-la a cada 24 horas para parâmetros de contaminação, como pH médio, cor e alterações de turbidez.

Realize testes de tração em uma máquina de teste universal de tração, ou controle de deslocamento UTM, equipada com sensores de força e posição e um computador com software especificamente projetado. Registre dados a cada 0,4 segundos e exporte-os para uma planilha. Construa mandíbulas de tração adaptadas ao calibre médio das traqueias de coelhos a partir de monocamada pura de cloreto de polivinila cristal atóxico ou tubos ocos de PVC.

Separar as condutas em segmentos de três centímetros de comprimento. Para realizar a sutura término-terminal sem viés, perfurar 12 orifícios pré-formados a dois milímetros da borda dos maxilares, separados por 2,5 milímetros. Em seguida, fixar os tubos de vidro de PVC à traqueia do coelho por anastomose término-terminal com fio monofilamentar contínuo de náilon 6-0 através de orifícios alternados de cinco milímetros presentes a dois milímetros da borda da traqueia.

Estique todas as peças a uma taxa de deslocamento de 5,0 milímetros por minuto. Em seguida, registre as variáveis, como tensão e deformação máximas, energia armazenada por unidade de volume traqueal e módulo de elasticidade. Execute testes de compressão radial em um UTM de mesa de compressão equipado com uma célula de carga de 15 newtons para obter dados de força, posição e tempo.

Registre dados e exporte para planilhas em intervalos de 0,5 segundo. Coloque as traqueias com a área membranosa apoiada na placa inferior antes da subida gradual da placa em direção à placa superior a uma velocidade constante de cinco milímetros por minuto. Calcular cada variável por unidade de comprimento da amostra, rigidez e energia por unidade de área de superfície necessária para ocluir completamente a traqueia.

Coloque um stent de PVC intraluminal estéril de tamanho 14, garantindo uma margem de três a quatro milímetros em cada extremidade. Fixar o stent com um único ponto de monofilamento de náilon 6-0 através do espaço intercartilaginoso da primeira cartilagem. Sob condições assépticas e com material estéril, realizar incisão torácica central longitudinal de três centímetros e colher retalhos pediculados bilaterais compostos por fáscia peitoral e componente muscular.

Embrulhe as traqueias com o retalho em quatro coelhos, uma traqueia em cada hemátoras. Concluída a cirurgia, reverter a anestesia interrompendo a administração de isoflurano. Das oito peças que foram expostas a 0,5 quilocinza de radiação, duas peças exibiram uma mudança na cor da mídia em uma semana.

No entanto, nenhuma das peças que foram irradiadas a um ou dois quilocinzas apresentou qualquer alteração na cor do meio. Em comparação com o controle, não foram detectadas alterações no padrão de distribuição de colágeno ou fibras elásticas nos espécimes analisados irradiados em diferentes doses de radiação. Os dados obtidos no ensaio de tração em traqueias irradiadas são mostrados aqui.

As curvas de tensão para as traqueias decelularizadas e irradiadas não revelaram alterações em relação às traqueias não esterilizadas. São mostrados os testes de compressão realizados nas traqueias nativas ou controles e as traqueias decelularizadas, criopreservadas e irradiadas. Os gráficos correspondentes mostraram que a irradiação não alterou a porcentagem de oclusão em relação à traqueia nativa.

A irradiação gama causou uma diminuição clinicamente mínima, mas estatisticamente significativa, nas características radiobiomecânicas e na força variável por unidade de comprimento. O exame histológico mostrou tecido conjuntivo altamente organizado na forma do pericôndrio da traqueia nativa. A cartilagem estava íntegra e sem sinais de necrose.

Ao implantar elemento radiológico em um ser vivo, a esterilidade do implante e o processo estéril são primordiais para evitar infecção e rejeição tecidual. Há uma ampla gama de órgãos a serem implantados após a geração do tecido, e eles devem ser estéreis. Seguindo este processo pode-se conseguir uma esterilização completa sem afetar as principais características do órgão.