Name: Esterilização por radiação gama de baixa dose em enxertos traqueais descelularizados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a esterilizar enxertos traqueais descelularizados usando irradiação gama de baixa dose em Oryctolagus cuniculus. Este método preserva as propriedades do órgão para transplantes seguros.

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Este artigo foi apoiado pela Bolsa da Sociedade Espanhola de Cirurgia Torácica de 2018 para Estudo Multicêntrico Nacional [Número 180101 concedido a Néstor J.Martínez-Hernández] e PI16-01315 [concedido a Manuel Mata-Roig] pelo Instituto de Salud Carlos III. O CIBERER é financiado pelo VI Plano Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Programa Consolidador, Ações CIBER e pelo Instituto de Salud Carlos III, com assistência do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional.

A diretiva europeia 20170/63/EU para o cuidado e uso de animais de laboratório foi cumprida e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Valência (Lei 86/609/CEE e 214/1997 e Código 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 do Governo de Valência, Espanha).
1. Decelularização traqueal
NOTA: O método de decelularização foi relatado em outra publicação20.
<ol><li>Eutanásia de coelhos brancos (Oryctolagus cuniculus) adultos adultos doadores de eutanásia, pesando 3,5-4,1 kg com 133 mg/kg de pentobarbital sódico, usando uma injeção de 200 mg/mL através da veia marginal da orelha.</li>
	<li>Ao mesmo tempo em que garante condições assépticas, realize uma cervicotomia longitudinal central, disseque os músculos cervicais e aproxime-se da traqueia. Dissecar o órgão circunferencial e longitudinalmente. Finalmente, transecto sob o primeiro anel e logo acima da carina.</li>
	<li>Com um bisturi, corte as traqueias em pedaços de 2 cm. Com tesoura, remova o tecido conjuntivo circundante e a camada mucosa interna6.</li>
	<li>Submergir os espécimes em 12 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) a 2%, penicilina-estreptomicina a 5% e anfotericina B a 5%.</li>
	<li>Submeter as traqueias a agitação constante com um agitador magnético a 400 rpm durante 5 semanas à temperatura ambiente. Substituir a solução de descelularização semanalmente após 2 h de choque osmótico, por imersão da traqueia em água destilada.</li>
	<li>Criogenizar os espécimes usando uma mistura de 12 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) em um recipiente de congelamento a -80 °C.</li>
	<li>Quando as traqueias forem usadas (após 13-15 dias), descongele-as em banho-maria a 37 °C e lave-as submergindo-as em PBS após o descongelamento estar completo.</li>
</ol>2. Esterilização
<ol><li>Irradiação<ol><li>Colocar lotes de quatro peças traqueais de 2 cm cada em um frasco de 20 mL de metacrilato em frasco de cultura T25 preenchido com PBS até atingir um volume total de 30 mL. Tome cuidado para evitar a formação de bolhas, o que poderia causar difusão de energia na interface ar-líquido.</li>
		<li>Realizar irradiação utilizando um acelerador linear, com fótons de energia nominal de 10 MV achatando feixes livres de filtros. Aplicar uma taxa de dose de 2.400 unidades monitoras por minuto no isocentro, colocando as traqueias a uma distância fonte-superfície de 100 cm a ser irradiada, com uma profundidade de campo de 2,5 cm para um campo de radiação de 10 cm x 10 cm, de modo a cobrir todo o recipiente - correspondendo a uma dose de 24 Gy/min.</li>
		<li>Escalonar as doses a cada lote de quatro peças; quatro peças serão submetidas a 0,5 kGy, quatro a 1 kGy, quatro a 2 kG, etc., até que a esterilização seja atingida.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura<ol><li>Introduzir as peças em 30 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com SFB inativado a 10%, sem antibióticos ou antifúngicos.</li>
		<li>Cultivá-los em uma incubadora de tecidos padrão a 37 °C e 5% CO 2 por2 semanas e inspecioná-los a cada 24 h. OBS: Os parâmetros de contaminação são alterações no pH do meio de cultura e, consequentemente, alterações na cor e turbidez do meio. As traqueias foram colhidas de lagomorfos livres de germes, que não estavam doentes e, portanto, esperava-se que estivessem desprovidos de bactérias anaeróbias em suas traqueias.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise histológica
OBS: Coloração das peças com hematoxilina e eosina21, tricrômico de Masson e orceína22.
<ol><li>Coloração DAPI<ol><li>Determinar a viabilidade tecidual utilizando DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol). Essa coloração azul-florida liga-se fortemente a regiões ricas em adenina e timina em sequências de DNA e, portanto, permite que o DNA seja visualizado por microscopia de fluorescência.</li>
		<li>Incorpore as amostras de tecido em composto de temperatura de corte ideal (OCT).</li>
		<li>Corte as amostras usando um criostato.</li>
		<li>Lavar a amostra a ser tingida três vezes em água destilada para remover o OCT. Coloque em meio de montagem que inclua uma solução de 30 nM de DAPI.</li>
		<li>Visualize a fluorescência usando microscopia de fluorescência.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de conteúdo de DNA<ol><li>Segmentos cortados da traqueia medindo aproximadamente 3 mm de comprimento com bisturi.</li>
		<li>Incubar por 2 h em proteinase K (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Extraia o DNA com um kit de extração de DNA, seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Por meio de espectrofotometria, determinar a concentração de DNA medindo a absorbância a 260/280 usando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Medir o tamanho das amostras de DNA extraídas usando cromatografia capilar com um bioanalisador.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Estudo biomecânico
MOTIVO: A resistência traqueal às forças longitudinais e transversais é medida através de ensaios de tração axial e compressão radial23.
<ol><li>Medida traqueal<ol><li>Meça o comprimento traqueal, a espessura da parede e o diâmetro externo usando um paquímetro Vernier.</li>
		<li>Calcule os valores médios a partir de três medidas aleatórias de cada uma das variáveis.</li>
		<li>Nos ensaios de compressão radial, calcular o diâmetro anteroposterior detectando o ponto em que a placa entra em contato com o corpo de prova.</li>
		<li>Realizar todos os testes à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de tração<ol><li>Realize testes de tração em um controle de deslocamento UTM (máquina universal de ensaio de tração), equipado com uma carga de 100 N (resolução de força de 0,1 N, 0,001 mm de posição e 0,1 s). A máquina de ensaio está equipada com sensores de força e posição, e está conectada a um computador com software projetado especificamente pelo fabricante23.</li>
		<li>Registre dados a cada 0,4 s e exporte para uma planilha.</li>
		<li>Construir mandíbulas de tração adaptadas ao calibre médio das traqueias de coelhos a partir de tubos ocos de policloreto de vinila (PVC) cristal puro, monocamada, atóxicos, com diâmetro externo de 1 cm e espessura de parede de 1,5 mm.</li>
		<li>Separe as condutas em segmentos de 3 cm de comprimento.</li>
		<li>Perfurar 12 orifícios pré-formados para a sutura término-terminal, a 2 mm da borda dos maxilares e separados por uma distância de 2,5 mm, para evitar viés devido às suturas.</li>
		<li>Fixar os tubos de vidro de PVC na traqueia do coelho por anastomose término-terminal com sutura contínua através de orifícios pré-formados alternados (a cada 5 mm), distantes 2 mm da borda da traqueia e com fio de náilon 6-0 monofilamentar.</li>
		<li>Esticar todas as peças a uma taxa de deslocamento de 5,0 mm/min.</li>
		<li>Registrar as variáveis tensão máxima (σ máx, em N/mm2) e deformação (εmáx, sem unidades), juntamente com a energia armazenada por unidade de volume traqueal (W/Vol, em mJ/mm) e módulo de elasticidade (E, em MPa).</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de compressão radial<ol><li>Realize testes de compressão radial em um UTM desktop de compressão, equipado com uma célula de carga de 15 N (resolução de força 0,001 N, posição 0,001 mm e tempo 0,1 s) para obter dados de força (N), posição (mm) e tempo (s). Registre dados e exporte para planilha em intervalos de 0,5 s.</li>
		<li>Coloque as traqueias com a área membranosa apoiada na placa inferior. A placa sobe gradualmente em direção à placa superior a uma velocidade constante de 5 mm/min.</li>
		<li>Calcular cada unidade por unidade de comprimento da amostra (f em N/mm), rigidez (R em Mpa·mm) e a energia por unidade de área superficial (W / S em mJ/mm2) necessária para ocluir completamente a traqueia.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Técnica cirúrgica
NOTA: A técnica cirúrgica tem sido amplamente divulgada em outrosperiódicos 20.
<ol><li>Coloque um stent de PVC intraluminal estéril, tamanho 14 Fr (que permite deslizar livremente sem comprimir as paredes), com uma margem de 3-4 mm em cada extremidade.</li>
	<li>Fixar o stent com um único ponto de monofilamento de náilon 6-0 através do espaço intercartilaginoso da primeira cartilagem.</li>
	<li>Proceder à anestesia dos coelhos.<ol><li>Pré-medicar os indivíduos (3,65-4,05 kg coelhos machos da raça Nova Zelândia brancos) com analgésicos intramusculares (35 mg/kg de cetamina) com sedativo, relaxante muscular e analgésico (2,5 mg/kg de xilazina).</li>
		<li>Raspe a zona de incisão para fora da zona de operação e limpe a área cirúrgica para remover os cabelos.</li>
		<li>Administrar analgésicos e antibioticoprofilaxia: 0,05 mg/kg de buprenorfina intramuscular e 10 mg/kg de enrofloxacina.</li>
		<li>Coloque um cateter venoso na veia marginal da orelha de cada coelho.</li>
		<li>Anestesia induzida com propofol em bolus de 10 mg/kg por via venosa.</li>
		<li>Monitorar os sinais vitais do animal por meio de eletrocardiograma de três derivações, oximetria de pulso e medida de pressão não invasiva. A cada 30 min, aplique soro fisiológico nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.</li>
		<li>Verifique o plano anestésico usando o método de pinça dos dedos.</li>
		<li>Manter a anestesia com isoflurano inalatório a 1,5%-2% da concentração alveolar mínima sem perder a ventilação espontânea e fornecer suporte térmico ao coelho com uma almofada térmica.</li>
	</ol></li>
	<li>Desinfete a zona de incisão várias vezes em movimento circular com uma esfoliação à base de iodo. Em condições assépticas em todos os momentos e com material estéril, realizar incisão torácica central longitudinal de 3 cm e colher retalhos pediculados bilaterais compostos por fáscia peitoral e componente muscular.</li>
	<li>Envolver as traqueias com o retalho em quatro coelhos, um em cada hemitórax (totalizando oito traqueias).</li>
	<li>Ao término da cirurgia, reverter a anestesia interrompendo a administração de isoflurano.</li>
	<li>Período pós-cirúrgico<ol><li>Mantenha os animais na sala de cirurgia até que tenham se recuperado completamente da anestesia. Quando eles tiverem se recuperado completamente, devolva-os ao seu ambiente com outros coelhos.</li>
		<li>Tratar os coelhos com antibióticos (0,5 mL/kg de enrofloxacina a 2,5%) e analgésicos (5 mg/mL meloxicam; 0,05 mL/kg metacam) a cada 24 h por 5 dias.</li>
		<li>Deixe os implantes in situ pelo tempo desejado.</li>
		<li>Antes da eutanásia, pré-medicar os coelhos com analgésicos intramusculares (35 mg/kg de cetamina) e um sedativo, relaxante muscular e analgésico (2,5 mg/kg de xilazina). Em seguida, eutanasiar os coelhos com 133 mg/kg de pentobarbital sódico usando uma injeção de 200 mg/mL através da veia marginal da orelha e colher as traqueias.</li>
		<li>Realizar testes biomecânicos e histológicos nas traqueias.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Análise estatística
<ol><li>Ajuste todos os modelos pelo método bayesiano no software R, Versão 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).</li>
	<li>Analisar as variáveis do estudo, exceto f e R, utilizando modelos de regressão linear múltipla.</li>
	<li>Para as variáveis f e R , aplicar modelos de regressão linear mista. Nesses modelos, além das variáveis de interesse relacionadas ao tratamento e condição de cada traqueia, introduz-se a porcentagem de oclusão como efeito monotônico e um termo independente por traqueia como fator aleatório.</li>
</ol>

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</ol>

Nenhum dos autores tem qualquer conflito de interesses.

Existem várias estratégias de esterilização. O CO2supercrítico penetra totalmente nos tecidos, acidificando o meio e desconstruindo a bicamada fosfolipídica celular com eliminação simples por meio da despressurização do implante 8,14,25. A radiação ultravioleta também tem sido utilizada, e sua eficácia na traqueia de roedores tem sido publicada, embora existam poucos relatos naliteratura10. Out...

A esterilização de um implante é um requisito básico para sua viabilidade; Na verdade, as próteses que têm se mostrado bem-sucedidas são aquelas implantadas em áreas estéreis (vasos sanguíneos, coração, osso, etc.) 1. A traqueia possui duas superfícies: uma superfície em contato com o meio externo, portanto não estéril, e uma superfície em direção ao mediastino, que é estéril. Portanto, a partir do momento em que a traqueia é extraída, ela não é um órgão estéril. Apesar do processo de descelularização subsequente ser realizado em condições estéreis máximas, não se trata de uma etapa de esterilização2. A implantação de material estranho por si só acarreta risco de infecção devido ao microambiente pró-bacteriano queproduz3e risco de até 0,014% de transmissão de doença do doador para o receptor, mesmo que o material tenha sido esterilizado4. Para garantir a correta vascularização da traqueia, em quase todos os protocolos experimentais de transplante, ela é primeiramente submetida a implante heterotópico 5,6,7 em uma área estéril (músculo, fáscia, omento, subcutâneo, etc.); Isso porque a implantação de um elemento não estéril nesse meio levaria à infecção da área3.
Existe uma gama de estratégias possíveis para a obtenção de um implante estéril. O uso do CO2supercrítico tem alcançado esterilização terminal 8,9. Outros métodos, como radiação ultravioleta ou tratamento com substâncias como ácido peracético, etanol, peróxido de oxigênio e água eletrolisada, têm obtido diferentes taxas de sucesso na esterilização, quase sempre dependendo de suas dosagens, mas têm demonstrado afetar as características biomecânicas dos implantes. De fato, algumas substâncias, como o óxido de etileno, podem alterar substancialmente a estrutura da matriz implantada e até causar efeitos imunogênicos indesejáveis. Por essa razão, muitas dessas estratégias não podem ser aplicadas a modelos biológicos 2,10,11,12,13.
A estratégia de esterilização mais estudada e aceita é a estabelecida pela norma ISO 11737-1:2006 para esterilização de produtos médicos implantados em humanos, com dose de radiação gama de 25 kGy. No entanto, essa regulamentação enfoca apenas a esterilização de elementos inertes não biológicos14,15. Além disso, as doses de radioterapia no tratamento radical do carcinoma são três ordens de grandeza menores do que as utilizadas para esterilizar produtosmédicos1. Com isso em mente, podemos concluir que tal dose não apenas mataria a microbiota, mas também destruiria e alteraria radicalmente a estrutura biológica do implante. Existe também a possibilidade de gerar lipídios residuais no momento da degradação, que podem ser potencialmente citotóxicos e acelerar a degradação enzimática do arcabouço 13,14,15,16,17, mesmo quando se utilizam doses tão baixas quanto 1,9 kGy e com danos diretamente proporcionais à dose de radiação recebida 17.
Assim, o objetivo deste trabalho é tentar identificar a dose de radiação que permite a obtenção de um implante estéril com o mínimo de efeitos deletérios causados pela irradiação 2,18,19. A estratégia seguida envolveu a irradiação de traqueias decelularizadas e irradiadas em diferentes doses escalonadas dentro de uma faixa de quilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), até a obtenção de uma cultura negativa. Testes adicionais foram realizados para as doses que obtiveram culturas negativas, a fim de confirmar a esterilização. Após a determinação da dose mínima para obtenção da esterilização, foi verificado o impacto estrutural e biomecânico da irradiação na traqueia. Todas as métricas foram comparadas com as traqueias de coelhos nativos controle. A esterilização do construto foi então testada in vivo, implantando-se as traqueias em coelhos brancos da Nova Zelândia.

<table><tbody><tr><td>Sutura de Monofilamento de Nylon 6-0&nbsp;</td><td>Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, EUA</td><td>SN-5698G</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B 5%</td> <td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA EUA</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, EUA</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Buprex. Reckitt Benckiser Saúde; Hull, Reino Unido</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>Microteste UTM de mesa de compressão</td><td>, Madri, Espanha</td><td>EM1/10/FR</td><td></td></tr><tr><td>Cryostate</td><td>Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania</td><td>CM3059</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, EUA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Científico; Waltham, MA, EUA</td><td>Kit de extração de DNA 11965084</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit de extração DNeasy Quiagen, Hilden, Alemanha</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina, 2,5%</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Alemanha</td><td>0035-0002</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare Hyclone; Madrid, Espanha</td><td>SH20898.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Alemanha)</td><td>DM2500??</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de Congelamento&nbsp;</td><td>Sr. Frosty. Thermo Fisher; Madri, Espanha</td><td>&nbsp; 5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>isofluorano</td><td>isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Espanha&nbsp;</td><td>8.43603E+12</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Imalgene. Merial; Toulouse, Francia</td><td>BOE127823</td><td></td></tr><tr><td>Acelerador linear&nbsp;</td><td>"True Beam". Varian, Palo Alto, Califórnia, EUA</td><td>H191001</td><td></td></tr><tr><td>agitador magnético</td><td>Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia</td><td>BS-010144-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam 5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Alemanha</td><td>6283-MV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA EUA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Doletal. Vetoquinol; Madrid, Espanha; um</td><td>3.60587E+12</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, EUA</td><td>P2272</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania</td><td>G 151030</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, EUA</td> Tubos ocos de PVC <td>S3020</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Itália</td><td>hhdddyyZ</td><td></td></tr><tr><td>stent de PVC&nbsp;</td><td>ArgyleTM Medtronic; Istambul, Turquia</td><td>019 5305 1</td><td></td></tr><tr><td>R software, Versão 3.5.3 R Core</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>R 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, EUA</td><td>8,17,034</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Nanodrop, Life Technologies; Ciência da vida Isogen. Utrech, Holanda</td><td>Planilha ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microsoft Excel para Mac, Versão 16.23, Redmond, WA, EUA</td><td>Máquina de</td> Teste Universal de Tração 2864993241 <td></td></tr><tr><td></td><td>Máquinas de Teste, Veenendaal, Holanda</td><td>84-01</td><td></td></tr><tr><td>UTM Software</td><td>TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, EUA&nbsp;</td><td>100-093-627 F</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montagem Média&nbsp;</td><td>Laboratórios de Vetores, Burlingame; CA; EUA</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Xilagesic. Calier; Barcelona, Espanha; um</td><td>20102-003</td><td></td></tr></tbody></table>

esterilização por radiação gama de baixa dose em enxertos traqueais descelularizados

Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts

Um dos principais aspectos fundamentais para garantir que um transplante evolua corretamente é a esterilidade do meio. O transplante traqueal descelularizado envolve a implantação de um órgão que originalmente estava em contato com o meio ambiente, não sendo estéril desde o início. Embora o protocolo de descelularização (por exposição a detergente [dodecil sulfato de sódio a 2%), agitação contínua e choques osmóticos) seja conduzido de acordo com medidas assépticas, ele não prevê esterilização. Portanto, um dos principais desafios é garantir a esterilidade antes da implantação in vivo . Embora existam protocolos estabelecidos de esterilização por radiação gama para materiais inorgânicos, não existem tais medidas para materiais orgânicos. Além disso, os protocolos em vigor para materiais inorgânicos não podem ser aplicados a materiais orgânicos, pois a dose de radiação estabelecida (25 kGy) destruiria completamente o implante. Este trabalho estuda o efeito de uma dose de radiação aumentada em uma traqueia de coelho decelularizada. Mantivemos a faixa de dose (kGy) e testamos doses escalonadas até encontrar a dose mínima na qual a esterilização é alcançada. Após a determinação da dose, estudaram-se os efeitos da mesma no órgão, tanto histologicamente quanto biomecanicamente. Determinamos que, enquanto 0,5 kGy não atingiu esterilidade, doses de 1 kGy e 2 kGy atingiram, sendo 1 kGy, portanto, a dose mínima necessária para atingir a esterilização. Estudos microscópicos não mostraram alterações relevantes em comparação com órgãos não esterilizados. As características biomecânicas axiais não foram alteradas, e apenas uma pequena redução na força por unidade de comprimento que o órgão pode tolerar radialmente foi observada. Podemos, portanto, concluir que 1 kGy alcança a esterilização completa da traqueia de coelhos descelularizados com um mínimo, se houver, efeito sobre o órgão.

Descelularização A coloração DAPI mostra ausência de DNA, e nenhum valor de DNA superior a 50 ng foi detectado em nenhuma das traqueias por eletroforese, com todos os fragmentos sendo menores que 200 pb20.
Cultura microbiana Duas das oito peças submetidas a 0,5 kGy apresentaram mudança de cor em menos de 1 semana. Nenhuma das peças irradiadas a 1 kGy e 2 kGy apresentou alteração de cor (Figura 1)....

A obtenção da esterilização é essencial para o transplante de tecido traqueal. Apresentamos um protocolo de esterilização utilizando irradiação gama em baixas doses que é totalmente tolerada pelos órgãos.

Esterilização por radiação gama de baixa dose em enxertos traqueais descelularizados

One of the main key aspects in ensuring that a transplant evolves correctly is the sterility of the medium. Decellularized tracheal transplantation ...

Este protocolo proporciona um processo completo de esterilização de qualquer órgão não estéril sem afetar suas características. O principal objetivo desta técnica inclui a possibilidade de esterilizar um órgão sem afetar suas propriedades. Embora essa técnica tenha se concentrado nas traqueias, ela demonstrou que doses menores de radiação gama podem efetivamente esterilizar materiais biológicos.Um indivíduo pode enfrentar o problema definindo a menor dose efetiva para os diferentes tipos de órgãos. Então, recomenda-se começar com uma dosagem mais baixa e aumentá-los até que a esterilização seja alcançada. Comece seccionando a traqueia dissecada de coelhos brancos eutanasiados da Nova Zelândia, ou Oryctolagus cuniculus, em pedaços de dois centímetros.Com tesoura, remova o tecido conjuntivo circundante e a camada mucosa interna. Submergir os espécimes em 12 mililitros de solução de PBS contendo SDS, 5% de penicilina estreptomicina e 5% de anfotericina. Submeter as traqueias a agitação constante com um agitador magnético a 400 RPM durante cinco semanas à temperatura ambiente.Semanalmente, dê duas horas de choque osmótico mergulhando as traqueias em água destilada antes de trocar o meio. Após cinco semanas, criogenizar os espécimes de traqueia usando uma mistura de 12 mililitros de 80% FBS e 20% DMSO em um recipiente de congelamento a menos 80 graus Celsius. Após 13 a 15 dias, descongele as traqueias em banho-maria a 37 graus Celsius.Em seguida, lave-os com PBS. Para irradiar o espécime, colocar quatro peças traqueais em 20 mililitros de PBS em frascos de cultura de metacrilato T25, evitando a formação de bolhas. Realizar a irradiação utilizando um acelerador linear com fótons de uma energia nominal de 10 megavolts achatando feixes livres de filtros.Aplicar uma taxa de dose de 2.400 unidades de monitor por minuto e definir outros parâmetros conforme descrito no manuscrito. Uma vez feito, cultivar o espécime em 30 mililitros de DMEM suplementado com FBS 10% inativado sem antibióticos ou antifúngicos. Incubar a cultura em uma incubadora de tecido padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas semanas e inspecioná-la a cada 24 horas para parâmetros de contaminação, como pH médio, cor e alterações de turbidez.Realize testes de tração em uma máquina de teste universal de tração, ou controle de deslocamento UTM, equipada com sensores de força e posição e um computador com software especificamente projetado. Registre dados a cada 0,4 segundos e exporte-os para uma planilha. Construa mandíbulas de tração adaptadas ao calibre médio das traqueias de coelhos a partir de monocamada pura de cloreto de polivinila cristal atóxico ou tubos ocos de PVC.Separar as condutas em segmentos de três centímetros de comprimento. Para realizar a sutura término-terminal sem viés, perfurar 12 orifícios pré-formados a dois milímetros da borda dos maxilares, separados por 2,5 milímetros. Em seguida, fixar os tubos de vidro de PVC à traqueia do coelho por anastomose término-terminal com fio monofilamentar contínuo de náilon 6-0 através de orifícios alternados de cinco milímetros presentes a dois milímetros da borda da traqueia.Estique todas as peças a uma taxa de deslocamento de 5,0 milímetros por minuto. Em seguida, registre as variáveis, como tensão e deformação máximas, energia armazenada por unidade de volume traqueal e módulo de elasticidade. Execute testes de compressão radial em um UTM de mesa de compressão equipado com uma célula de carga de 15 newtons para obter dados de força, posição e tempo.Registre dados e exporte para planilhas em intervalos de 0,5 segundo. Coloque as traqueias com a área membranosa apoiada na placa inferior antes da subida gradual da placa em direção à placa superior a uma velocidade constante de cinco milímetros por minuto. Calcular cada variável por unidade de comprimento da amostra, rigidez e energia por unidade de área de superfície necessária para ocluir completamente a traqueia.Coloque um stent de PVC intraluminal estéril de tamanho 14, garantindo uma margem de três a quatro milímetros em cada extremidade. Fixar o stent com um único ponto de monofilamento de náilon 6-0 através do espaço intercartilaginoso da primeira cartilagem. Sob condições assépticas e com material estéril, realizar incisão torácica central longitudinal de três centímetros e colher retalhos pediculados bilaterais compostos por fáscia peitoral e componente muscular.Embrulhe as traqueias com o retalho em quatro coelhos, uma traqueia em cada hemátoras. Concluída a cirurgia, reverter a anestesia interrompendo a administração de isoflurano. Das oito peças que foram expostas a 0,5 quilocinza de radiação, duas peças exibiram uma mudança na cor da mídia em uma semana.No entanto, nenhuma das peças que foram irradiadas a um ou dois quilocinzas apresentou qualquer alteração na cor do meio. Em comparação com o controle, não foram detectadas alterações no padrão de distribuição de colágeno ou fibras elásticas nos espécimes analisados irradiados em diferentes doses de radiação. Os dados obtidos no ensaio de tração em traqueias irradiadas são mostrados aqui.As curvas de tensão para as traqueias decelularizadas e irradiadas não revelaram alterações em relação às traqueias não esterilizadas. São mostrados os testes de compressão realizados nas traqueias nativas ou controles e as traqueias decelularizadas, criopreservadas e irradiadas. Os gráficos correspondentes mostraram que a irradiação não alterou a porcentagem de oclusão em relação à traqueia nativa.A irradiação gama causou uma diminuição clinicamente mínima, mas estatisticamente significativa, nas características radiobiomecânicas e na força variável por unidade de comprimento. O exame histológico mostrou tecido conjuntivo altamente organizado na forma do pericôndrio da traqueia nativa. A cartilagem estava íntegra e sem sinais de necrose.Ao implantar elemento radiológico em um ser vivo, a esterilidade do implante e o processo estéril são primordiais para evitar infecção e rejeição tecidual. Há uma ampla gama de órgãos a serem implantados após a geração do tecido, e eles devem ser estéreis. Seguindo este processo pode-se conseguir uma esterilização completa sem afetar as principais características do órgão.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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